專利名稱：紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物半胱氨酸蛋白酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其編碼基因與其在培育耐逆性提高植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，涉及到各種蛋白水解酶的作用。它們通過(guò)有限的水解加工使蛋白成熟，或者將貯藏蛋白降解為多肽和氨基酸，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的動(dòng)員和氮素的轉(zhuǎn)移，以滿足植物生長(zhǎng)發(fā)育如種子萌發(fā)的需要。通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的結(jié)合和對(duì)下游響應(yīng)因子的水解，蛋白水解酶也可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的響應(yīng)和調(diào)節(jié)。隨著對(duì)逆境和衰老以及細(xì)胞程序化死亡研究的逐步深入，作為蛋白水解酶中的一大類，關(guān)于半胱氨酸蛋白酶的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。
半胱氨酸蛋白酶作為一類重要的蛋白酶家族，廣泛參與植物的各種生理過(guò)程。許多研究表明在環(huán)境脅迫如低溫、干旱和鹽脅迫條件下半胱氨酸蛋白酶mRNA會(huì)累積。而在植物某些涉及細(xì)胞程序化死亡的發(fā)育階段中，半胱氨酸蛋白酶mRNA含量也會(huì)增加，這表明半胱氨酸蛋白酶與植物細(xì)胞程序化死亡有關(guān)。半胱氨酸蛋白酶也存在于葉綠體和液泡中，可降解光合作用必需酶Rubisco(1，5-二磷酸核酮糖脫羧/加氧酶)的大亞基，在遭受水分脅迫而衰老的植物葉片中，半胱氨酸蛋白酶起著主要作用。此外，在植物的正常發(fā)育過(guò)程中，半胱氨酸蛋白酶可動(dòng)員貯存蛋白，實(shí)現(xiàn)氮素的再利用，以供種子萌發(fā)之需，而在植物特異組織的形成，如木質(zhì)部分化和通氣組織形成等過(guò)程中也有半胱氨酸蛋白酶的參與。既然半胱氨酸蛋白酶具有這些重要的功能。因此，分離該編碼該蛋白酶基因，并且分析其功能將具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于紫花苜蓿的半胱氨酸蛋白酶。
本發(fā)明所提供的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶，名稱為MsCP1，來(lái)源于紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №12)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由350個(gè)氨基酸殘基組成。
編碼上述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因(MsCP1)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列2)編碼序列表中SEQ ID №1的氨基酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1346個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第47-1099位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增MsCP1中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到抗逆性提高的植物。
所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1可通過(guò)含有所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1的植物表達(dá)載體導(dǎo)入外植體；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBI121、pBin19、pCAMBIA1391、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表達(dá)載體。
使用MsCP1構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明基因MsCP1的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、煙草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、花生、矮牽牛、擬南芥或大麥等植物。
本發(fā)明所提供的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其編碼基因，可調(diào)控植物抵抗干旱、低溫及高鹽等逆境脅迫的能力，從而顯著提高植物的抗逆性。該蛋白及其編碼基因?qū)τ谂嘤鼓嫘蕴岣叩淖魑镄缕贩N具有重要的理論及實(shí)際意義，可應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為PCR擴(kuò)增的MsCP1 cDNA中間片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2為3’RACE產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖3為5’RACE產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖4為MsCP1氨基酸殘基序列的序列比對(duì)結(jié)果圖5為MsCP1氨基酸殘基序列的相似性分析結(jié)果圖6為MsCP1氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果圖7為MsCP1氨基酸序列的序列分析結(jié)果圖8為MsCP1真核表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程的示意9為轉(zhuǎn)基因煙草部分植株的基因組DNA和PCR鑒定結(jié)果圖10為轉(zhuǎn)基因煙草的Southern blot檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物及探針均由上海生工合成。
實(shí)施例1、紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1 cDNA全序列的獲得及其序列分析紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1全長(zhǎng)cDNA序列的獲得包括以下步驟一、MsCP1 cDNA中間片段的擴(kuò)增利用RT-PCR方法，從紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品種中苜一號(hào)的總mRNA中克隆得到其半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1的cDNA片段，具體方法如下1、植物材料處理將紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品種中苜一號(hào)種子用蒸餾水洗凈后，浸種1天，催芽。播種于含石英砂的托盤中，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件25℃，16h光照/8h黑暗。10天后，用200mmol/L NaCl溶液處理6h后可取整株植物提取RNA。
2、總RNA的提取參照張勁松等人的方法(張勁松，等.中國(guó)科學(xué)，B輯，1995，25(5)659-669)提取RNA，具體方法為將苜蓿葉片在液氮中研碎，懸于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中鈉，5g/L十二烷基肌氨酸，25mmol/L檸檬酸鈉，0.1mol/Lβ巰基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入無(wú)水乙醇沉淀總RNA，再經(jīng)4mol/L LiCl懸浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸鈉/乙醇沉淀總RNA，最后將RNA溶于水中，進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明獲得了純度較高、較完整的RNA，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 3、MsCP1 cDNA中間片段的擴(kuò)增比較現(xiàn)已公開(kāi)的植物紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的氨基酸殘基序列，尋找保守區(qū)域，并根據(jù)保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，引物序列如下CP15’-CAGGG(TA)T(CG)(AG)TG(TC)GG(TA)TC(GT)TG(TC)TGG-3’CP25’-(AG)TC(AG)CA(AG)TCCACAAGCTG(CT)TG(CT)TC-3’以步驟2提取的紫花苜蓿RNA為模板，用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega，Cat.No.M1701)并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)合成其第一鏈cDNA，反應(yīng)體系及條件為2ug RNA模板，1.0ul Oligo(dT)18，5ul 5×RT緩沖液，1.25uldNTP(10mmol/L)，1ul RNA酶蛋白質(zhì)抑制劑(RNAasin)，1ul逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃反應(yīng)60min，70℃變性5min，將合成的第一鏈cDNA貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 再以獲得的第一鏈cDNA為模板，在引物CP1和CP2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增MsCP1 cDNA的中間片段，25ul PCR反應(yīng)體系為2μl cDNA模板，0.5μl Taq polymerase(Promega，5U/μl)，2.5μl 10×PCR buffer，2.5μl MgCl2(25mmol/L)，0.5μl dNTPs(各10mmol/L)，CP1和CP2(濃度均為10mmol/L)各2μl，ddH2O 13μl。反應(yīng)條件為先94℃變性4分鐘；然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)40次；最后72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，泳道1為PCR擴(kuò)增的MsCP1 cDNA片段)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度約150bp的目的片段。
回收并純化長(zhǎng)度約150bp的目的片段，取回收純化的PCR產(chǎn)物5ul、1ul pMD-18T載體和連接緩沖液5ul，混勻后16℃連接12-24小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，命名為pMD-MsCP1，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增片段具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №3由117個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID №4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，序列表中SEQ ID №4由39個(gè)氨基酸殘基組成，其中自氨基端第1-8位和第31-38位氨基酸殘基為保守序列。
二、MsCP1 cDNA的5’和3’UTR(非翻譯區(qū))的克隆根據(jù)步驟一得到的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性3’端特異引物(GSP15’-ATTCAGCACAACTGGAGCTTTGGAG-3’)和5’端特異引物(GSP25’-GCAGCCAAAGTTATTGAAAGCACCAGCA-3’)，通過(guò)RACE的方法進(jìn)一步擴(kuò)增得到MsCP1 cDNA的5’和3’端UTR片段。
以紫花苜蓿RNA為模板，分別在3’端特異引物GSP1和5’端特異引物GSP2的引導(dǎo)下，用SMART RACE cDNA Amplification試劑盒(Clontech，Cat.no.K1811-1)并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)RT-PCR擴(kuò)增MsCP1 cDNA的3’和5’末端片段。3’RACE的擴(kuò)增條件為94℃變性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)。5’RACE的擴(kuò)增條件為先94℃變性5s，72℃延伸3min，共5個(gè)循環(huán)；然后94℃變性5s，70℃退火10s，72℃延伸3min，共5個(gè)循環(huán)；最后94℃變性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，共25個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)3’RACE和5’RACE產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，3’RACE產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，泳道1為3’RACE產(chǎn)物)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度約800bp的DNA片段；5’RACE產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，泳道1為5’RACE產(chǎn)物)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度約600bp的DNA片段。回收并純化3’RACE和5’RACE產(chǎn)物，分別連接入pMD-18T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，得到分別含有3’UTR和5’UTR的重組質(zhì)粒，分別命名為pMD-3’UTR和pMD-5’UTR，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明MsCP1 cDNA的5’端序列具有序列表中SEQ ID №5的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №5由638個(gè)堿基組成，3’端序列具有序列表中SEQ ID №6的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №6由824個(gè)堿基組成。
三、紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1全長(zhǎng)cDNA序列的獲得利用步驟一和步驟一獲得的長(zhǎng)度分別為117bp，638bp和824bp片段之間的重疊區(qū)，借助DNA拼接軟件contig得到MsCP1的全長(zhǎng)cDNA序列。該序列具有序列表中SEQID №2的多核苷酸序列。序列表中的SEQ ID №2由1346個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第47-第1099位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，序列表中的SEQ ID №1由350個(gè)氨基酸殘基組成。
四、紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因及其編碼蛋白的序列分析1、MsCP1核苷酸序列同源性分析對(duì)MsCP1的核苷酸序列進(jìn)行相似性分析，分析結(jié)果如表1所示，表明其與PsCP(GenBank號(hào)CAA92583.1)的相似性最高，與其它植物的半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸序列也有較高的同源性，如紫云英(Cicer arietinum)、大豆、杏(Prunusarmeniaca)、擬南芥、煙草、玉米、花椰菜、大麥和多花黑麥草(Lolium multiflorum)等，但同源性最高的為豆科植物，如豌豆、紫云英和大豆，表明MsCP1的核苷酸序列具有種屬特異性和密碼子偏愛(ài)性。
表1 紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸序列在GenBank中的同源性比較結(jié)果

2、紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶MsCP1的蛋白序列分析1)MsCP1氨基酸序列的同源性分析對(duì)紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶MsCP1的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)并進(jìn)行相似性分析，比對(duì)序列為PsCP(emb|CAA92583.1)、AtAALP(gb|AAN31820.1)、BoCP5(gb|AAL60582.1)、PaCP(gb|AAB97142.1)、NTCP-23(dbj|BAA96501.1)、PeTH3(gb|AAC49361.1)、LeCYP-3(emb|CAA88629.1)、aleurain(emb|CAA28804.1)、LmSEE1(emb|CAB71032.1)和ZmSEEl(emb|CAA68192.1)，序列比對(duì)結(jié)果如圖4所示(陰影部分為相同序列)，相似性分析結(jié)果如表2和圖5所示，MsCP1的氨基酸序列與PsCP的相似性高達(dá)91％，與其它植物的半胱氨酸蛋白酶也有較高的同源性，如擬南芥、煙草、番茄、大麥、花椰菜、杏(Prunus armeniaca)、多花黑麥草(Loliummultiflorum)和矮牽牛(Petunia×hybrida)等，推斷所克隆的克隆的基因MsCP1是紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因。
表2 紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的氨基酸殘基序列的同源性比較結(jié)果


3、MsCP1的結(jié)構(gòu)域分析對(duì)MsCP1的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果如圖6和表3所示，其含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(CD)，CD為papain家族所共有，表明MsCP1屬于papain蛋白家族，再在http//ca.expasy.org/網(wǎng)站上用Scan prosite程序?qū)sCP1編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖7所示(下劃線部分所示為推測(cè)的信號(hào)肽，陰影部分為液泡定位信號(hào)，“*”表示ERFNIN motif位點(diǎn)；“◎”表示保守活性位點(diǎn)；“◆’表示潛在的糖基化位點(diǎn)；

表示CK2磷酸化位點(diǎn)；

表示PKC磷酸化位點(diǎn))，表明MsCP1含有papain家族保守活性位點(diǎn)Cys157、is297和Asn317具有6個(gè)Cys殘基參與二硫鍵的形成；缺乏C端結(jié)構(gòu)域，N端具有由16個(gè)疏水氨基酸構(gòu)成的信號(hào)序列，含有ERFNIN花式和液泡定位的NPIR模式，因此MsCP1可能定位于液泡內(nèi)；分析結(jié)果還表明MsCP1可能在翻譯后發(fā)生多種修飾，其含有3個(gè)潛在的N-linked糖基化位點(diǎn)Asn-X-Ser/Thr，7個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和11個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)(未標(biāo)出)。
表3 MsCP1的保守結(jié)構(gòu)域的比對(duì)結(jié)果

實(shí)施例2、MsCP1轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性分析一、MsCP1轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及其鑒定1、MsCP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例l克隆的MsCP1 cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物CPF和CPR(引物CPR中去掉了終止密碼子，以與GUS基因融合)，引物序列如下CPF5’-GC

TGAAAGATGGCACAGTGGACG-3’(方框內(nèi)堿基為限制性內(nèi)切酶Xba I識(shí)別位點(diǎn))CPR5’-CG

GGCCACAACAGGATA-3’(方框內(nèi)堿基為限制性內(nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn))
以紫花苜蓿RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，在引物CPF和CPR的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增MsCP1全長(zhǎng)序列(退火溫度為56℃)，反應(yīng)結(jié)束后，回收約1000bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I酶切后，回收目的片段，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ儆梅植絾蚊盖械姆椒▽?duì)pBI121進(jìn)行酶切，先用Xba I在37℃下酶切后回收酶切片段，再對(duì)回收片段用BamH I在30℃下進(jìn)行酶切，回收線性大片段。將經(jīng)酶切的MsCP1片段與線性化載體pBI121進(jìn)行連接，20.0mL連接反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為pBI121線性大片段3.0mL，MsCP1片段9.0mL，10×T4DNA連接酶緩沖液2.0mL，T4DNA連接酶(350U/mL)1.0mL，ddH2O 5.0mL，16℃保溫16h，得到MsCP1的植物表達(dá)載體，命名為pBI-CP，其構(gòu)建流程圖如8所示。
2、轉(zhuǎn)化煙草1)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備a.挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3mL含100μg/mL鏈霉素(Str)的YEB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；b.取上述經(jīng)培養(yǎng)的菌液500mL接種于50mL YEB(含100μg/mL Str)液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5；d.5000rpm離心5min，棄去培養(yǎng)基；e.加入10mL 0.15mol/L NaCl溶液懸浮農(nóng)桿菌細(xì)胞，5000rpm離心5min；f.用1mL預(yù)冷的20mmol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴，24h內(nèi)使用，或分裝成每管200mL，液氮中速凍1min，置-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆的鑒定a.取200mL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入1μg質(zhì)粒pBI-CP，冰浴30min，液氮中速凍1min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培養(yǎng)基，28℃慢速(140rpm)振蕩培養(yǎng)4h；b.10000rpm離心30sec，棄上清，加入0.1mL YEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素(Kan)和100μg/mL Str的YEB平板上，28℃倒置培養(yǎng)48h；c.挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)基中(含50μg/mL Kan和100μg/mL Str)，28℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；d.小量提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板，用引物CPF和CPR進(jìn)行PCR鑒定，將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pBI-CP-GUS。
3)煙草的轉(zhuǎn)化a.取轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性農(nóng)桿菌按1∶100接種于YEB液體培養(yǎng)液(含50μg/mL Kan和100μg/mL Str)，28℃振蕩培養(yǎng)；b.取上述菌液按1∶50接種于YEB液體培養(yǎng)液(含50μg/mL Kan和100μg/mL Str)，28℃振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行二次活化；c.當(dāng)OD600達(dá)到0.6時(shí)，5000rpm離心5min收集菌體，用1/2MS液體培養(yǎng)基(pH7.0)洗菌一次，并將其稀釋至5倍體積的1/2MS液體培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備侵染用；d.選取30天苗齡的煙草無(wú)菌苗，切下成熟葉片，用5-10mm打孔器制取葉盤外植體；e.將新制備的葉盤外植體投入已準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中，侵染15min，同時(shí)留出一部分葉盤作對(duì)照，分別為CK1未侵染葉盤放入B0培養(yǎng)基(MS+2μg/mL 6-BA+0.5μg/mL IAA)上，檢測(cè)培養(yǎng)基的有效性；CK2未侵染葉盤放入B0培養(yǎng)基上，檢測(cè)抗生素的有效性；f.將侵染過(guò)的葉盤放在表明鋪有一張無(wú)菌濾紙的B0培養(yǎng)基上，28℃暗處共培養(yǎng)兩天；g.將葉盤轉(zhuǎn)入含有400μg/mL Carb和50μg/mL Kan的B培養(yǎng)基上，28℃見(jiàn)光培養(yǎng)，10-15天繼代一次；h.當(dāng)抗性芽長(zhǎng)到1-1.5cm時(shí)，將其切下?lián)Q到含有200μg/mL Carb和75μg/mL Kan的T培養(yǎng)基(MS+200mg/mL Carb+75mg/mL Kan)上生根，15-20天后生根完全，即可移栽溫室；i.收集T1代種子。
3、轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定1)PCR鑒定先用PCR的方法對(duì)步驟2的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行鑒定，包括以下步驟(1)煙草基因組DNA的少量提取采用CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)法，提取步驟2)轉(zhuǎn)化煙草葉片的DNA，具體方法如下a.取葉片洗凈晾干，放入液氮致冷、研磨；b.加入65℃預(yù)熱的CTAB提取液900mL；c.65℃水浴15-20min，每隔2min顛倒一次；d.冷卻后加入500mL氯仿/異戊醇(24∶1)，劇烈搖動(dòng)5min；e.6000-8000rpm，4℃離心10min；f.取上清液，重復(fù)d、e兩步；g.取上清液，加入1/10體積的3mol/L NaAc和等體積的異丙醇，搖勻至出現(xiàn)絮狀沉淀；
h.12000rpm，4℃離心15min，倒掉上清液；i.70％乙醇洗滌DNA沉淀，干燥后溶于TE(或雙蒸水)中；j.取少許DNA，進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖9中的圖A所示，表明獲得了純度較高的DNA，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> (2)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)a.35S啟動(dòng)子檢測(cè)引物序列如下P35S-15’-CTTACGCAGCAGGTCTCATCA-3’P35S-25’-CCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3’以轉(zhuǎn)化煙草葉片的DNA為模板，在引物P35S-1和P35S-2的引導(dǎo)下，用PCR的方法進(jìn)行35S啟動(dòng)子的檢測(cè)(退火溫度為54℃)，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖9中的圖B所示(泳道0為作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)化植株，泳道1-11為轉(zhuǎn)化植株，泳道M為Marker)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為530bp的DNA片段。
b.GUS基因的檢測(cè)引物序列如下GUSF5’-GCAACTGGACAAGGCACT-3’GUSR5’-GAGCGTCGCAGAACATTACA-3’以轉(zhuǎn)化煙草葉片的DNA為模板，在引物GUSF和GUSR的引導(dǎo)下，用PCR的方法進(jìn)行35S啟動(dòng)子的檢測(cè)(退火溫度為54℃)，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖9中的圖C所示(泳道0為作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)化植株，泳道1-12為轉(zhuǎn)化植株，泳道M為Marker)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為750bp的DNA片段。
c.MsCP1基因全長(zhǎng)的檢測(cè)以轉(zhuǎn)化煙草葉片的DNA為模板，在引物CPF和CPR的引導(dǎo)下，用PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)(退火溫度為56℃)，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖9中的圖D所示(泳道0為作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)化植株，泳道1-6為轉(zhuǎn)化植株，泳道M為Marker，泳道+為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pBI-CP-GUS)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1Kb的DNA片段。
d.MsCP1-GUS片段的檢測(cè)引物序列如下AnF5’-CGGGATCCTTGGAGTCAGCTTAC-3’
GUSR5’-GAGCGTCGCAGAACATTACA-3’以轉(zhuǎn)化煙草葉片的DNA為模板，在引物AnF和GUSR的引導(dǎo)下，用PCR的方法進(jìn)行35S啟動(dòng)子的檢測(cè)(退火溫度為54℃)，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖9中的圖E所示(泳道1-5為轉(zhuǎn)化植株，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000))，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為2Kb的DNA片段。
2)Southern blot檢測(cè)對(duì)步驟1)經(jīng)鑒定獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株用Southern blot的方法做進(jìn)一步檢測(cè)，所用探針為GUS基因的部分片段(序列表中序列7)，具體方法為將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶Hind III進(jìn)行酶切，取少量酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后，切下分子量標(biāo)準(zhǔn)，EB染色，凝膠條的一側(cè)放一把透明的塑料尺照像。依次對(duì)凝膠進(jìn)行如下處理0.25mol/L HCl中浸泡膠20min，凝膠中溴酚藍(lán)變?yōu)辄S色；變性液(0.5mmol/L NaOH，1.5mmol/L NaCl)中處理凝膠45min；中和液(0.5mmol/LTris-HCl(pH 7.0)，1.5mmol/L NaCl)中浸泡膠30min。采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。2×SSC漂洗尼龍膜，吹干或晾干后于80℃烘30min-1h。預(yù)雜交與雜交5×SSC預(yù)濕的雜交膜放入雜交管中，帶有DNA片段的一面向里，加入15mL預(yù)熱到65℃的Church緩沖液(含1％BSA，1mM EDTA，0.25mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.2)，7％SDS)預(yù)雜交5小時(shí)以上，加入變性好的探針，于65℃雜交16小時(shí)。雜交結(jié)束后，分別用2×SSC+0.5％SDS，1×SSC+0.5％SDS，0.5×SSC+0.5％SDS和0.1×SSC+0.1％SDS在65℃下洗膜，每次15分鐘，并不斷用射線監(jiān)控儀檢測(cè)信號(hào)。洗完后，用濾紙吸掉膜表面的水分，保鮮膜包好，放入暗盒，-70℃放射自顯影。雜交結(jié)果如圖10所示(泳道1為對(duì)照質(zhì)粒pBI-CP-GUS；泳道2-10為轉(zhuǎn)基因植株；泳道11為陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化植株))，其中泳道2-10顯示出明顯的雜交條帶，表明其為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。
4、陽(yáng)性植株的篩選用下述方法對(duì)步驟3鑒定出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選a.制備MS(0.43％MS鹽，3％蔗糖，1％瓊脂，用KOH調(diào)pH至5.7)選擇培養(yǎng)基；b.T1代種子表面消毒(70％乙醇浸種2min，0.5％次氯酸鈉浸種10min，無(wú)菌水洗5次，每次2min)；c.將種子平鋪于含相應(yīng)抗生素(40μg/mL Kan和50μg/mL羧芐西啉鈉)的MS選擇培養(yǎng)基中，密度為1000-2000粒種子/皿；d.4℃春化3天，移入生長(zhǎng)箱中(22℃恒溫，24小時(shí)光照，光強(qiáng)為30-40μmol.m-2.s-1)
e.7天后挑選轉(zhuǎn)化體，表現(xiàn)為真葉健康呈深綠色，根伸長(zhǎng)至培養(yǎng)基中；f.將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)至正常的MS培養(yǎng)基中，10天后轉(zhuǎn)入土壤；g.收獲T2代種子，備用觀察，并做生理生化鑒定，得到遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株。
二、MsCP1轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性鑒定1、轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定將野生型煙草種子和步驟一獲得的T3代MsCP1轉(zhuǎn)基因煙草種子分別在1/4MS，和含100ug/mL Kan的抗性平板上萌發(fā)，在抗性平板上生長(zhǎng)兩周后，將幼苗載入土中，在室溫中培養(yǎng)兩周后進(jìn)行NaCl脅迫處理，用0、10Mm、100mM、200mM的NaCl澆灌植株，兩天澆灌一次。兩周后觀察表型，并將上述供測(cè)植株從培養(yǎng)土中取出，取地上部分測(cè)鮮重、干重，同時(shí)，取上述植物材料在70℃烘烤至恒重后稱干重，并用Z 5300型原子吸收光譜儀進(jìn)行Na+含量的測(cè)定。
結(jié)果對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草進(jìn)行鹽處理兩周后，在0、10mM的NaCl鹽脅迫下，無(wú)論是野生型還是轉(zhuǎn)基因煙草植株長(zhǎng)勢(shì)都很正常。但是在100mM，200mM的NaCl處理下，野生型煙草的根生長(zhǎng)受到抑制，且變短變粗、分叉減少，葉片變黃，基部葉片脫落并伴有壞死。轉(zhuǎn)基因煙草的根的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于對(duì)照，沒(méi)有受到明顯的生長(zhǎng)限制。在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草地上部分的鮮重、干重明顯高于野生型；如在100mM的NaCl處理下，與未經(jīng)鹽處理的相比，野生型煙草的鮮重下降了42％，而轉(zhuǎn)基因煙草卻僅下降約21％。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶蛋白與基因可以增強(qiáng)植物的耐鹽性，從而可作為植物耐鹽基因工程的侯選基因加以應(yīng)用，用來(lái)改良植物的耐鹽性狀。
2、轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性鑒定將野生型和T3轉(zhuǎn)基因煙草種子分別在1/4MS，和含100ug/mL Kan的抗性平板上萌發(fā)，在抗性平板上生長(zhǎng)兩周后，將幼苗載入土中，在室溫中培養(yǎng)兩周后進(jìn)行干旱脅迫處理。分別于第一周、兩周、三周后觀察表型，并將上述材料從培養(yǎng)土中取出，取地上部分測(cè)鮮重、干重。
結(jié)果對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草進(jìn)行干旱脅迫一周后，無(wú)論是野生型還是轉(zhuǎn)基因煙草植株長(zhǎng)勢(shì)都很正常。但是在干旱處理二周后、三周后，野生型煙草的根生長(zhǎng)受到抑制，且變短變粗、分叉減少，葉片變黃，基部葉片脫落并伴有壞死。但轉(zhuǎn)基因煙草的根的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于對(duì)照，在二周后沒(méi)有受到明顯的生長(zhǎng)限制，在處理17天后開(kāi)始葉片才開(kāi)始發(fā)黃。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶蛋白與基因可以增強(qiáng)植物的抗旱性，從而可作為植物抗旱基因工程的侯選基因加以應(yīng)用，用來(lái)改良植物的抗旱性狀。
序列表<160>7<210>1<211>350<212>PRT<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>1Met Ala Gln Trp Thr Leu Leu Ile Val Phe Phe Cys Val Ala Thr Ala1 5 10 15Ala Ala Gly Leu Ser Phe His Asp Ser Asn Pro Ile Arg Met Val Ser20 25 30Asp Met Glu Lys Gln Leu Leu Gln Val Ile Gly Glu Ser Arg His Ala35 40 45Val Ser Phe Ala Arg Phe Ala Asn Arg Tyr Gly Lys Arg Tyr Asp Thr50 55 60Val Asp Glu Met Lys Arg Arg Phe Lys Ile Phe Ser Glu Asn Leu Gln65 70 75 80Leu Ile Glu Ser Thr Asn Lys Lys Arg Leu Gly Tyr Thr Leu Gly Val85 90 95Asn His Phe Ala Asp Trp Thr Trp Glu Glu Phe Arg Ser His Arg Leu100 105 110Gly Ala Ala Gln Asn Cys Ser Ala Thr Leu Lys Gly Asn His Arg Ile115 120 125Thr Asp Val Val Leu Pro Ala Glu Lys Asp Trp Arg Lys Glu Gly Ile130 135 140Val Ser Glu Val Lys Asp Gln Gly His Cys Gly Ser Cys Trp Thr Phe145 150 155 160Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Ser Ala Tyr Ala Gln Ala Phe Gly Lys165 170 175
Asn lle Ser Leu Ser Glu Gln Gln Leu Val Asp Cys Ala Gly Ala Phe180 185 190Asn Asn Phe Gly Cys Asn Gly Gly Leu Pro Ser Gln Ala Phe Glu Tyr195 200 205Ile Lys Tyr Asn Gly Gly Leu Glu Thr Glu Glu Ala Tyr Pro Tyr Thr210 215 220Gly Gln Asn Gly Pro Cys Lys Phe Thr Ser Glu Asp Val Ala Val Gln225 230 235 240Val Leu Gly Ser Val Asn Ile Thr Leu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Lys245 250 255His Ala Val Ala Phe Ala Arg Pro Val Ser Val Ala Phe Glu Val Val260 265 270Asp Asp Phe Arg Leu Tyr Lys Lys Gly Val Tyr Thr Ser Thr Thr Cys275 280 285Gly Asn Thr Pro Met Asp Val Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr290 295 300Gly Ile Glu Asp Gly Val Pro Tyr Trp Leu Ile Lys Asn Ser Trp Gly305 310 315 320Gly Glu Trp Gly Asp His Gly Tyr Phe Lys Met Glu Met Gly Lys Asn325 330 335Met Cys Gly Val Ala Thr Cys Ser Ser Tyr Pro Val Val Ala340 345 350<210>2<211>1346<212>DNA<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>2acgcggggag agccgtagaa gcagagtttt tagttgagag tgaaagatgg cacagtggac 60gctccttatc gttttcttct gcgtggccac cgccgccgcc ggattgagct tccacgactc120caatcctatt cggatggtct ccgacatgga aaagcagctt cttcaggtca tcggagaatc180
tcgccacgct gtctctttcg ctcgctttgc taacagatac ggcaaaagat acgataccgt 240tgatgaaatg aagcgtagat ttaagatctt ctctgagaat cttcaactta tcgaatctac 300taataagaaa cgtcttggtt acactctcgg tgttaatcat tttgctgatt ggacttggga 360ggagttcaga agtcatagac ttggtgctgc tcaaaattgt tctgctactc tcaaggggaa 420ccataggatt accgatgttg ttcttcctgc cgagaaagat tggaggaaag aaggtatagt 480cagtgaagtt aaggatcaag gccactgcgg atcatgctgg acattcagca caactggagc 540tttggagtca gcttacgcac aggccttcgg aaagaatatc tctctttctg agcagcagct 600agtggactgt gctggtgctt tcaataactt tggctgcaat ggtgggctgc catcccaagc 660ctttgaatac attaaataca atggtggcct tgagacagag gaagcatatc cctacactgg 720acaaaatggt ccctgcaaat ttacatctga agacgttgct gttcaagtcc ttggctctgt 780caatatcacc ttgggtgctg aggatgaatt gaaacatgca gttgcttttg ctcgtcccgt 840tagtgtggca tttgaggtgg ttgatgactt cagattgtac aagaaaggag tttacactag 900tacaacttgt ggcaacacac ccatggatgt gaatcatgct gttcttgctg ttgggtatgg 960aattgaagat ggtgtaccat attggctcat taaaaactca tggggaggtg aatggggtga1020ccatggctac ttcaaaatgg aaatggggaa gaatatgtgc ggtgttgcaa cttgttcatc1080ctatcctgtt gtggcctaaa tggtacggaa ggatgtgatg cccgaaaggc tacccctgtg1140aattccacct tgcatgttat gctttgtagt tcatcttaaa cgtaaaatgt atgtgagacg1200atgataagtc tttgttgata ttcttctgta aaataagttt ggagtttaga tgccatttct1260tctattcatc atataccaca ttacaaaata agattgtaaa tcatgtatta ttatcacaca1320gagacattat ctttaaaaaa aaaaaa 1346<210>3<211>117<212>DNA<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>3cagggatcgt gtggatcttg ctggacattc agcacaactg gagctttgga gtcagcttac 60gcacaggcct tcggaaagaa tatctctctt tctgagcaac agcttgtgga ttgtgac117<210>4<211>39
<212>PRT<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>4Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Thr Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu1 5 10 15Glu Ser Ala Tyr Ala Gln Ala Phe Gly Lys Asn Ile Ser Leu Ser Glu20 25 30Gln Gln Leu Val Asp Cys Asp35<210>5<211>638<212>DNA<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>5aacgcgggga gagccgtaga agcagagttt ttagttgaga gtgaaagatg gcacagtgga 60cgctccttat cgttttcttc tgcgtggcca ccgccgccgc cggatttagc ttccatgact120ccaatcctat tcggatggtc tccgacatgg aggagcagct tcttcaggtc atcggagaat180ctcgccacgc tgtctctttc gctcgctttg ctaacagata cggcaaaaga tacgataccg240ttgatgaaat gaagcgtaga tttaagatct tctctgagaa tcttcaactt atcaaatcta300ctaataagaa acgtcttggt tacactctcg gtgttaatca ttttgctgat tggacttggg360aggagttcag aagtcataga cttggtgctg ctcaaaattg ttctgctact ctcaagggga420accataggat taccgatgtt gttcttcctg ccgagaaaga ttggaggaaa gaaggtatag480tcagtgaagt taaggatcaa ggccactgcg gatcatgctg gacattcagc acaactggag540ctttggagtc agcttacgca caggccttcg gaaagaatat ctctctttct gagcagcagc600tagtggactg tgctggtgct ttcaataact ttggctgc638<210>6<211>824<212>DNA
<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>6attcagcaca actggagctt tggagtcagc ttacgcacag gccttcggaa agaatatctc 60tctttctgag cagcagctag tggactgtgc tggtgctttc aataactttg gctgcaatgg120tgggctgcca tcccaagcct ttgaatacat taaatacaat ggtggccttg agacagagga180agcatatccc tacactggac aaaatggtcc ctgcaaattt acatctgaag acgttgctgt240tcaagtcctt ggctctgtca atatcacctt gggtgctgag gatgaattga aacatgcagt300tgcttttgct cgtcccgtta gtgtggcatt tgaggtggtt gatgacttca gattgtacaa360gaaaggagtt tacactagta caacttgtgg caacacaccc atggatgtga atcatgctgt420tcttgctgtt gggtatggaa ttgaagatgg tgtaccatat tggctcatta aaaactcatg480gggaggtgaa tggggtgacc atggctactt caaaatggaa atggggaaga atatgtgcgg540tgttgcaact tgttcatcct atcctgttgt ggcctaaatg gtacggaagg atgtgatgcc600cgaaaggcta cccctgtgaa ttccaccttg catgttatgc tttgtagttc atcttaaacg660taaaatgtat gtgagacgat gataagtctt tgttgatatt cttctgtaaa ataagtttgg720agtttagatg ccatttcttc tattcatcat ataccacatt acaaaataag attgtaaatc780atgtattatt atcacacaga gacattatct ttaaaaaaaa aaaa 824<210>7<211>682<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>7gcaactggac aaggcactag cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg 60ggtgaaggtt atctctatga actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga gtgtgatatc120tacccgcttc gcgtcggcat ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt cctgattaac180cacaaaccgt tctactttac tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt gcgtggcaaa240ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac300
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1.紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的氨基酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID№2的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的宿主菌。
8.一種提高植物耐逆性的方法，是將權(quán)利要求3所述的編碼紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到抗逆性提高的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因通過(guò)含有所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pBI121、pBin19、pCAMBIA1391、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物宿主為水稻、小麥、大豆、煙草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、花生、矮牽牛、擬南芥或大麥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其編碼基因與應(yīng)用，其目的是提供一種紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其編碼基因與其在培育耐逆性提高植物中的應(yīng)用。該酶是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明對(duì)于培育抗逆性提高的作物新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1807611SQ20061000049
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2006年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日
發(fā)明者韓建國(guó), 閆龍鳳, 楊青川, 孫彥 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)