專利名稱：革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法及其專用芯片與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法及其專用芯片與試劑盒。
背景技術(shù)：
一.細(xì)菌鑒定與耐藥性檢測(cè)的重要意義
隨著抗菌藥物的廣泛使用，病原菌對(duì)常見抗菌藥物的耐藥性不斷增加，耐藥菌感染的治療已成為一個(gè)全球性難題。引起臨床細(xì)菌性感染的致病菌包括需氧菌與厭氧菌，分為革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌兩大類，每類又各分為球菌與桿菌。需氧革蘭陽(yáng)性球菌與革蘭陰性桿菌是臨床最常見的二類致病菌。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌由于細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)的不同，從而導(dǎo)致藥物對(duì)其作用機(jī)理及其耐藥機(jī)制也存在顯著差異，臨床上對(duì)這兩類細(xì)菌地臨床用藥具有很大差別。
抗生素是醫(yī)院臨床中應(yīng)用最廣泛的抗菌藥物，在控制、預(yù)防和治療各種感染性疾病中發(fā)揮重要作用。然而，自1939年抗生素問世以來，特別是近10年來，細(xì)菌耐藥率迅速增長(zhǎng)，醫(yī)院內(nèi)感染時(shí)尤其嚴(yán)重。
各種耐藥菌的不斷出現(xiàn)可造成嚴(yán)重后果，例如，導(dǎo)致手術(shù)治療失敗、并發(fā)癥增多、感染復(fù)發(fā)、住院時(shí)間延長(zhǎng)、昂貴抗生素及其它藥物的使用量增加等。耐藥株還隨著國(guó)際貿(mào)易及旅游業(yè)的高速發(fā)展而在全球范圍蔓延。了解耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)原因、發(fā)生機(jī)制，掌握并使用正確的檢測(cè)方法是及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥菌株、有效預(yù)防和控制耐藥性細(xì)菌擴(kuò)散的關(guān)鍵。及時(shí)準(zhǔn)確地掌握細(xì)菌耐藥機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥和新的抗菌藥物的研制具有重要意義。
二.當(dāng)前革蘭氏陰性菌的主要耐藥問題
革蘭氏陰性菌的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，包括四種主要耐藥機(jī)制，而且可能由于不同耐藥機(jī)制的協(xié)同作用而導(dǎo)致多重耐藥。
酶對(duì)抗生素的修飾或破壞
主要是β-內(nèi)酰胺酶，通過水解β-內(nèi)酰胺環(huán)使抗生素失活，這是大多數(shù)致病菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，約80％的病原菌的耐藥性與其有關(guān)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶有200種以上，β-內(nèi)酰胺酶可水解常見青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉素類(亞胺培南和美羅培南)和單環(huán)類(氨曲南)中的β-內(nèi)酰胺四元環(huán)。
膜通透性改變
革蘭氏陰性菌的膜孔蛋白通道狹窄，能對(duì)大分子及疏水性化合物的穿透形成有效屏障。膜通透性降低導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性主要原因是膜孔蛋白缺陷，如OprD孔蛋白的缺失導(dǎo)致銅綠假單胞菌(Huang H，Jeanteur D，Pattus F，Hancock RE.1995.Membrane topology and site-specific mutagenesis of Pseudomonas aeruginosaporin OprD.Mol Microbiol.16(5)931-41.)和肺炎克雷伯氏菌(Martinez-Martinez L，Pascual A，Hernandez-Alles S，Alvarez-Diaz D，Suarez AI，Tran J，Benedi VJ，Jacoby GA.1999.Roles of beta-lactamasesand porins in activities of carbapenems and cephalosporins againstKlebsiella pneumoniae.Antimicrob Agents Chemother.43(7)1669-73.)對(duì)亞胺培南耐藥。
主動(dòng)泵出機(jī)制
主動(dòng)泵出機(jī)制是通過幾種膜蛋白的協(xié)同作用將許多不同結(jié)構(gòu)的抗生素排出菌體，從而造成細(xì)菌的多重耐藥。在銅綠假單胞菌中，至少有4種主動(dòng)泵出系統(tǒng)介導(dǎo)多重耐藥[Masuda N，Sakagawa E，Ohya S.1995.Outer membrane proteinsresponsible for multiple drug resistance in Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother.39(3)645-9.]。其中MexAB-oprM系統(tǒng)是唯一組成型表達(dá)的，是銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素和有機(jī)物質(zhì)天然耐藥的主要基礎(chǔ)。
新靶位的改變或產(chǎn)生
β-內(nèi)酰胺類抗生素專一性地與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上的靶位點(diǎn)PBPs結(jié)合，干擾細(xì)胞壁肽聚糖合成而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。由于PBPs的改變或產(chǎn)生新的有功能的PBPs，使抗生素不再發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致耐藥。由于革蘭氏陰性菌的產(chǎn)酶機(jī)制和通透性等因素作用明顯，PBP在耐藥機(jī)制中的作用并不十分顯著。
三.β-內(nèi)酰胺酶
β-內(nèi)酰胺酶(E.C.3.5.2.6)是一類可特異水解β-內(nèi)酰胺環(huán)的酶，是導(dǎo)致細(xì)菌尤其是革蘭氏陰性菌耐藥的最主要機(jī)制，在各種耐藥機(jī)制中占80％。β-內(nèi)酰胺酶是由多種酶組成的蛋白家族，能水解β內(nèi)酰胺抗生素。這些蛋白基因存在于細(xì)菌的染色體或質(zhì)粒中。幾乎在青霉素使用的同時(shí)(1940年)即報(bào)導(dǎo)了可對(duì)青霉素進(jìn)行水解的青霉素酶[Abraham EP，Chain E.1940.An enzyme from bacteria ableto destroy penicillin.Nature.146837.]。目前G-桿菌中最引人注目的問題是細(xì)菌對(duì)第三代頭孢菌素和新的廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，其主要機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ESBLs和Bush I組β-內(nèi)酰胺酶。青霉素酶和AmpC酶的活性中心均為絲氨酸，它作為親核試劑向β-內(nèi)酰胺環(huán)的羧基進(jìn)攻，形成?；钢虚g體，然后在水分子的作用下使β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)失活。金屬β-內(nèi)酰胺酶則是以二價(jià)過渡金屬Zn作為催化中心。
迄今為止報(bào)道的β-內(nèi)酰胺酶已超過200種。它們?cè)趤碓?、底物譜、抑制劑、結(jié)構(gòu)等方面存在許多差異，從而給β-內(nèi)酰胺酶的系統(tǒng)分類帶來困難。至今已有7種酶分類法的報(bào)道。其中較為實(shí)用和完善的是改進(jìn)版BJM分類系統(tǒng)[Bush，K.，G.A.Jacoby，and A.A.Medeiros.1995.A functional classification scheme forβ-lactamases and its correlation with molecular structure.Antimicrob.Agents Chemother.391211-1233.]，主要將β-內(nèi)酰胺酶分為以下4組。
Group1頭孢菌素酶，為C類酶，能水解頭孢菌素，但對(duì)青霉素水解作用很弱，不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(克拉維酸)抑制，可被鄰氯西林抑制，由位于染色體上的ampC基因編碼產(chǎn)生，統(tǒng)稱為AmpC酶，近年發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的性質(zhì)與染色體介導(dǎo)的AmpC酶基本一致，也歸于此類；
Group2青霉素酶，為A或D類酶，主要水解青霉素類，能被克拉維酸抑制(2br亞組除外)，其中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum betalactamases，ESBLs)屬于A類酶，可水解第三代頭孢菌素；
Group3金屬β-內(nèi)酰胺酶，又稱碳青霉烯酶，為B類酶，包括IMP型和VIM型β-內(nèi)酰胺酶，由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)。活性中心有2個(gè)Zn原子，可以水解幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，其活性不被克拉維酸抑制劑抑制，但可被EDTA和對(duì)氯苯甲酸汞(p-chloromercuribenzoate，pCMB)抑制；
Group4青霉素酶，分子分類不明，主要水解青霉素類，不能被克拉維酸抑制。
臨床上最重要的β-內(nèi)酰胺酶是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC)。
超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extened-spectrum β-lactamases，ESBLs)是指由質(zhì)粒介導(dǎo)的能賦予細(xì)菌對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的一類酶，由革蘭氏陰性細(xì)菌，主要是肺炎克雷伯氏菌和E.coli產(chǎn)生，屬BJM分類系統(tǒng)2be組，組成型高表達(dá)，可水解廣譜頭孢菌素(如頭孢噻肟，頭孢他啶)，單環(huán)類抗生素(氨曲南)等，且能被克拉維酸，舒巴坦所抑制。ESBLs主要是由廣譜酶TEM-1、TEM-2、SHV-1為基礎(chǔ)突變產(chǎn)生，底物譜擴(kuò)大，可對(duì)多種氧亞胺基β-內(nèi)酰胺類抗生素具有催化水解作用。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多種ESBLs，其中TEM型144種，SHV型53種，OXA型14種，CTX-M型24種，其他型10種。TEM、SHV和OXA型ESBLs的具體分類、氨基酸組成和pI值可參考網(wǎng)址http//www.lahey.org/studies/webt.htm。
CTX-M型ESBLs是我國(guó)最流行的ESBLs[Wang H，Kelkar S，Wu W，Chen M，QuinnJP.2003.Clinical Isolates of Enterobacteriaceae ProducingExtended-Spectrum beta-LactamasesPrevalence of CTX-M-3 at a Hospital inChina.Antimicrob Agents Chemother.47(2)790-3.]，其中CTX-M-11、13、14、15在我國(guó)北京和廣州發(fā)現(xiàn)；少數(shù)ESBLs為SHV型，沒有TEM型ESBLs。這可能與我國(guó)大量使用頭孢噻肟有關(guān)，因此選擇出對(duì)頭孢噻肟耐藥而對(duì)頭孢他定敏感的CTX-M型ESBLs。
頭孢菌素酶(AmpC酶)在分子結(jié)構(gòu)上具有同源性，都屬于分子分類的C類酶。AmpC酶存在于大多數(shù)腸桿科細(xì)菌和銅綠假單胞菌中，由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)。
最初AmpC酶由染色體介導(dǎo)，自然發(fā)生，主要見于陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌及銅綠假單胞菌中。近年來出現(xiàn)向質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)。質(zhì)粒中的AmpC沒有調(diào)控基因，呈持續(xù)高表達(dá)(DHA-1除外)，且由于質(zhì)粒的快速?gòu)?fù)制(導(dǎo)致突變?cè)黾?和可轉(zhuǎn)移性(導(dǎo)致散播快)，造成更多的菌株耐藥。1989年報(bào)導(dǎo)了第一個(gè)對(duì)頭孢西定和頭孢替坦耐藥的質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶CMY-1，其pI值為8.0，該酶可將耐藥性從K.pneumoniae轉(zhuǎn)移到E.coli中(Bauernfeind，A.，Y.Chong，andS.Schweighart.1989.Extended broad spectrum β-lactamase in Klebsiellapneumoniae including resistance to cephamycins.Infection 17316-321.)，此后，越來越多的質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，它們可對(duì)氧亞氨基類和7α-甲氧基類頭孢菌素耐藥，而且介導(dǎo)這些酶的質(zhì)粒是可傳遞的。質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC主要分布在K.pneumoniae和其他腸桿菌中。并以平均每年1～2個(gè)新質(zhì)粒的速度增加，這是一種新的危險(xiǎn)，應(yīng)引起足夠重視。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)33種質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，根據(jù)其與染色體介導(dǎo)的AmpC酶氨基酸同源性可分為6組[Philippon A，Arlet G，Jacoby GA.2002.Plasmid-determinedAmpC-type beta-lactamases.Antimicrob Agents Chemother.46(1)1-11.]MOX-CMY組，CMY-LAT組(由于來源于Citrobacter，也稱為CIT組)，DHA組，ACC組EBC組和FOX組。其中CIT組的基因cmy-2是世界上分布最廣的一個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC基因，在亞洲，美洲和歐洲等地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)[Philippon A，Arlet G，JacobyGA.2002.Plasmid-determined AmpC-type beta-lactamases.Antimicrob AgentsChemother.46(1)1-11.]。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶底物譜廣，可水解氧亞氨基類，(如第三代頭孢菌素)和7α-甲氧基類頭孢菌素(如頭孢西丁)等抗生素，而且該類酶與染色體介導(dǎo)的AmpC酶一樣，不被酶抑制劑克拉維酸等抑制。另外，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC與特異孔蛋白缺失聯(lián)合作用，可導(dǎo)致對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，如產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)CMY-4和缺失孔蛋白的K.pneumoniae的協(xié)同作用對(duì)亞胺培南產(chǎn)生耐藥[CaoVT，Arlet G，Ericsson BM，Tammelin A，Courvalin P，Lambert T.2000.Emergence of imipenem resistance in Klebsiella pneumoniae owing tocombination of plasmid-mediated CMY-4 and permeability alteration.JAntimicrob Chemother.46(6)895-900.]，這給治療帶來很大難題。
四.ESBLs和AmpC檢測(cè)方法
紙片擴(kuò)散法
篩選試驗(yàn)選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松藥敏紙片中的至少2種，用MH瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)待測(cè)菌，測(cè)量抑菌環(huán)直徑，按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。確認(rèn)試驗(yàn)是使用頭孢他啶和頭孢他啶加克拉維酸；頭孢噻肟和頭孢噻肟加克拉維酸；分別測(cè)量2種紙片單獨(dú)及加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑。加克拉維酸和不加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑相差≥5mm可確認(rèn)為ESBLs菌株。該方法敏感率為84.4％。
雙紙片協(xié)同法
將菌液涂布在MH瓊脂平板上，然后將一張含有酶抑制劑(如阿莫西林+克拉維酸)藥敏紙片貼在中心，再貼1張三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟或頭孢曲松)或氨曲南紙片，如頭孢他啶紙片向克拉維酸紙片方向抑菌區(qū)增大則顯示ESBLs存在。該方法敏感率在79％左右。
檢測(cè)最低抑菌濃度(MIC)(即瓊脂稀釋法)
篩選試驗(yàn)選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松至少2種以上，用MH肉湯(標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法)稀釋，根據(jù)NCCLS推薦的篩選標(biāo)準(zhǔn)，凡頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松(CTRX)等三代頭孢霉素及氨曲南(ATZ)MIC超過2mg/ml的菌株都應(yīng)懷疑是產(chǎn)ESBLs菌。確認(rèn)試驗(yàn)是根據(jù)NCCLS推薦的篩選和確認(rèn)ESBLs的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。選用頭孢噻肟(或頭孢他啶)進(jìn)行單獨(dú)稀釋及頭孢噻肟(或頭孢他啶)加克拉維酸(固定濃度為4mg/L)進(jìn)行稀釋；如果加克拉維酸和不加克拉維酸的MIC差值≥8倍，可確認(rèn)為ESBLs菌株。
Etest法
Etest ESBLs試條一側(cè)含有頭孢他啶，另一側(cè)含有頭孢他啶+克拉維酸，抗生素濃度兩端最高，向中間呈濃度梯度遞減。將E-test試條貼于接種待測(cè)菌的MH平皿上，孵育18～24小時(shí)，讀取兩端抑菌線的MIC值，如果頭孢他啶的MIC值大于頭孢他啶+克拉維酸MIC值4倍以上，則判定為ESBLs陽(yáng)性。此法操作簡(jiǎn)單，但試條價(jià)格較為昂貴。
三維實(shí)驗(yàn)
將敏感菌株如大腸埃希菌ATCC25922涂布在平板上，然后貼上藥敏紙片，在離紙片3mm處打一個(gè)小孔，內(nèi)加菌液或破胞液，35℃孵育過夜，如出現(xiàn)待測(cè)菌液或破胞液干擾敏感菌株形成抑菌環(huán)的現(xiàn)象則判斷為陽(yáng)性。該試驗(yàn)敏感率達(dá)到95％。但操作繁瑣，須專業(yè)人員進(jìn)行操作。
以上表型檢測(cè)方法(除三維實(shí)驗(yàn)外)只對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，不檢測(cè)其他腸桿菌科細(xì)菌，也不能檢測(cè)AmpC，三維實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)AmpC，但臨床實(shí)驗(yàn)室很難進(jìn)行操作。
除上述檢測(cè)耐藥表型的方法外，另外還有一些分子方法進(jìn)行檢測(cè)，如檢測(cè)ESBLs的等電點(diǎn)(等電聚焦電泳IEF)，分析酶的底物譜及抑制物譜來分型或PCR擴(kuò)增等。其中分子生物學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速準(zhǔn)確，當(dāng)MIC處于耐藥的臨界值時(shí)，分子生物學(xué)方法可為治療提供有力的依據(jù)。但是，常規(guī)的分子生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)單一，因而實(shí)用性較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明所提供的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒，包括擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因的引物對(duì)，和檢測(cè)所述革蘭氏陰性菌菌株耐藥基因探針；
所述擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因的引物對(duì)的正向引物和反向引物的大小均為15-50個(gè)核苷酸，優(yōu)選為15-35個(gè)核苷酸；所述擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因的引物對(duì)中的正向引物或反向引物的5’端連接上通用加尾序列；所述通用加尾序列的5’端被熒光標(biāo)記；被連接上所述通用加尾序列的正向引物或反向引物的5’端被熒光標(biāo)記；所述通用加尾序列具有序列表中序列1的核苷酸序列；
所述檢測(cè)革蘭氏陰性菌菌株耐藥基因探針的大小均為15-50個(gè)核苷酸；所述探針的5’端連接上10-35個(gè)寡聚dT，優(yōu)選連接上12-18個(gè)寡聚dT。
該試劑盒中，所述革蘭氏陰性細(xì)菌是指經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏染色陰性的菌株。所述耐藥基因是指革蘭氏陰性菌的耐藥基因。所述引物是指用于進(jìn)行PCR，特別是多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增的核苷酸序列。所述探針是指和上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的核苷酸序列。
所述待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株包括大腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等腸桿菌科細(xì)菌。
所述耐藥基因包括tem，shv，ctx-m-1-type，ctx-m-9-type，mox，cit，dha，acc，ebc和fox。
所述tem是指144種tem型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶tem-1到tem-144基因；所述shv是指53種SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶shv-1～16，shv-2a，shv-18～22，shv-24～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70基因；所述ctx-m-1-type是指CTX-M-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，包括ctx-m-1、ctx-m-3、ctx-m-10、ctx-m-12、ctx-m-15和fec-1基因；所述ctx-m-9-type是指CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，包括ctx-m-9、ctx-m-13、ctx-m-14、ctx-m-16、ctx-m-17、ctx-m-19、ctx-m-21、ctx-m-27和Toho-2基因；所述mox是指cmy-1、cmy-8～11，mox-1和mox-2頭孢菌素酶基因；所述cit是指cmy-2、bil-1、cmy-2b，cmy-4～7、cmy-12、lat-1～4基因；所述dha是指DHA組頭孢菌素酶dha-1、dha-2基因；所述acc是指ACC組頭孢菌素酶aac-1基因；所述ebc是指EBC組頭孢菌素酶mir-1和act-1基因和陰溝腸桿菌染色體介導(dǎo)的ampC基因；所述fox是指FOX組頭孢菌素酶fox-1～6基因。
擴(kuò)增所述tem的正向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列3的核苷酸序列；可擴(kuò)增144種TEM型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶tem-1到tem-144基因。
擴(kuò)增所述shv的正向引物具有序列表中序列4的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列5的核苷酸序列；可擴(kuò)增53種SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-1～16，shv-2a，shv-18～22，shv-24～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
擴(kuò)增所述ctx-m-1-type的正向引物具有序列表中序列6的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列7的核苷酸序列；可擴(kuò)增6種CTX-M-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ctx-m-1、ctx-m-3、ctx-m-10、ctx-m-12、ctx-m-15和fec-1基因。
擴(kuò)增所述ctx-m-9-type的正向引物具有序列表中序列8的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列9的核苷酸序列；可擴(kuò)增9種CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因ctx-m-9、ctx-m-13、ctx-m-14、ctx-m-16、ctx-m-17、ctx-m-19、ctx-m-21、ctx-m-27和Toho-2。
擴(kuò)增所述mox的正向引物具有序列表中序列10的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列11的核苷酸序列；可擴(kuò)增7種頭孢菌素酶基因cmy-1、cmy-8～11，mox-1和mox-2。
擴(kuò)增所述cit的正向引物具有序列表中序列12的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列13的核苷酸序列；可擴(kuò)增12種基因cmy-2、bil-1、cmy-2b，cmy-4～7、cmy-12、lat-1～4。
擴(kuò)增所述dha的正向引物具有序列表中序列14的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列15的核苷酸序列；可擴(kuò)增2種DHA組頭孢菌素酶基因dha-1和dha-2。
擴(kuò)增所述acc的正向引物具有序列表中序列16的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列17的核苷酸序列；可擴(kuò)增1種ACC組頭孢菌素酶基因aac-1。
擴(kuò)增所述ebc的正向引物具有序列表中序列18的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列19的核苷酸序列；可擴(kuò)增3種EBC組頭孢菌素酶基因mir-1，act-1和陰溝腸桿菌染色體介導(dǎo)的ampC基因。
擴(kuò)增所述fox的正向引物具有序列表中序列20的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列21的核苷酸序列；可擴(kuò)增6種FOX組頭孢菌素酶基因fox-1～6基因。
所述試劑盒還包括表面化學(xué)質(zhì)控探針，雜交質(zhì)控探針，陰性對(duì)照探針和所述雜交質(zhì)控探針的靶標(biāo)；所述探針的大小均為15-35個(gè)核苷酸；所述雜交質(zhì)控探針和陰性對(duì)照探針的5’端均連接上10-35個(gè)寡聚dT，優(yōu)選連接上12-18個(gè)寡聚dT。
所述檢測(cè)耐藥基因探針包括tem通用探針，shv通用探針，ctx-m-1-type通用探針，ctx-m-9-type通用探針，mox通用探針，cit通用探針，dha通用探針，acc通用探針，ebc通用探針和fox通用探針及shv分型探針；所述shv分型探針由檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為E的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為K的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為L(zhǎng)的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為Q的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為R的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為D的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為N的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針和檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針。
所述tem通用探針具有序列表中序列22的核苷酸序列，可檢測(cè)144種TEM型的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因tem-1到tem-144。
所述shv通用探針具有序列表中序列33的核苷酸序列，可檢測(cè)53種SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-1～16，shv-2a，shv-18～22，shv-24～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述ctx-m-1-type通用探針具有序列表中序列24的核苷酸序列，可檢測(cè)6種CTX-M-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因ctx-m-1、ctx-m-3、ctx-m-10、ctx-m-12、ctx-m-15和fec-1。
所述ctx-m-9-type通用探針具有序列表中序列23的核苷酸序列，可檢測(cè)9種CTX-M-9型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因ctx-m-9、ctx-m-13、ctx-m-14、ctx-m-16、ctx-m-17、ctx-m-19、ctx-m-21、ctx-m-27和Toho-2。
所述mox通用探針具有序列表中序列25的核苷酸序列，可檢測(cè)7種頭孢菌素酶基因cmy-1、cmy-8～11，mox-1和mox-2。
所述cit通用探針具有序列表中序列26的核苷酸序列，可檢測(cè)12種基因cmy-2、bil-1、cmy-2b，cmy-4～7、cmy-12、lat-1～4。
所述dha通用探針具有序列表中序列27的核苷酸序列，可檢測(cè)2種DHA組頭孢菌素酶基因dha-1和dha-2。
所述acc通用探針具有序列表中序列28的核苷酸序列，可檢測(cè)1種ACC組頭孢菌素酶基因aac-1。
所述ebc通用探針具有序列表中序列29或30或31的核苷酸序列；具有序列表中序列29核苷酸序列的ebc通用探針可檢測(cè)1種EBC組陰溝腸桿菌染色體介導(dǎo)的頭孢菌素酶ampC基因；具有序列表中序列30核苷酸序列的ebc通用探針可檢測(cè)1種EBC組頭孢菌素酶基因mir-1；具有序列表中序列31核苷酸序列的ebc通用探針可檢測(cè)1種EBC組頭孢菌素酶基因act-1。
所述fox通用探針具有序列表中序列32的核苷酸序列，可檢測(cè)6種FOX組頭孢菌素酶基因fox-1到fox-6。
所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列34的核苷酸序列，可檢測(cè)32種自氨基端第238位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-1、shv-6、shv-8、shv-11、shv-14、shv-16、shv-19、shv-24～28、shv-31～33、shv-35～38、shv-40～44、shv-48～51、shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列35的核苷酸序列，可檢測(cè)18種自氨基端第238位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-2～5、shv-2a、shv-7、shv-9、shv-10、shv-12、shv-15、shv-20～22、shv-30、shv-34、shv-39、shv-45和shv-46。
所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列36的核苷酸序列，可檢測(cè)3種自氨基端第238位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-13、shv-18和shv-29。
所述檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為E的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列37的核苷酸序列，可檢測(cè)41種自氨基端第240位氨基酸殘基為E的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-1～3，shv-6，shv-8，shv-11，shv-13～14，shv-16，shv-2a，shv-19～21，shv-24～30，shv-32～44，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為K的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列38的核苷酸序列，可檢測(cè)12種自氨基端第240位氨基酸殘基為K的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-4、shv-5、shv-7、shv-9、shv-10、shv-12、shv-15、shv-18、shv-22、shv-31、shv-45和shv-46。
所述檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為L(zhǎng)的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列39的核苷酸序列，可檢測(cè)39種自氨基端第35位氨基酸殘基為L(zhǎng)的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-1～10，shv-14，shv-16，shv-18～22，shv-24，shv-26～28，shv-30，shv-32，shv-33～34，shv-38～39，shv-41～46，shv-48～51，shv-57和shv-59。
所述檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為Q的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列40的核苷酸序列，可檢測(cè)14種自氨基端第35位氨基酸殘基為Q的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-2a、shv-11～13、shv-15、shv-25、shv-29、shv-31、shv-35～37、shv-40、shv-53和shv-70。
所述檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為R的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列41的核苷酸序列，可檢測(cè)47種自氨基端第43位氨基酸殘基為R的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-1～6，shv-8～13，shv-15～16，shv-2a，shv-19～22，shv-24～28，shv-31～33，shv-35～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列42的核苷酸序列，可檢測(cè)6種自氨基端第43位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-7、shv-14、shv-18、shv-29、shv-30和shv-34。
所述檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列43的核苷酸序列，可檢測(cè)52種自氨基端第130位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-1～9，shv-11～16，shv-2a，shv-18～22，shv-24～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列44的核苷酸序列，可檢測(cè)1種自氨基端第130位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-10。
所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為D的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列45的核苷酸序列，可檢測(cè)50種自氨基端第179位氨基酸殘基為D的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-1～5、shv-7、shv-9～16，shv-2a，shv-18～22，shv-25～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列46的核苷酸序列，可檢測(cè)1種自氨基端第179位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-6。
所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為N的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列47的核苷酸序列，可檢測(cè)1種自氨基端第179位氨基酸殘基為N的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-8。
所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列48的核苷酸序列，可檢測(cè)1種自氨基端第179位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因shv-24。
所述表面化學(xué)質(zhì)控探針具有序列表中序列49的核苷酸序列，雜交質(zhì)控探針具有序列表中序列50的核苷酸序列，所述雜交質(zhì)控探針的靶標(biāo)具有序列表中序列51的核苷酸序列，陰性對(duì)照探針具有序列表中序列52的核苷酸序列。
上述探針固定于載體上。
所述載體可為硅片、用各種功能基團(tuán)修飾的玻片或用各種功能基團(tuán)衍生的膜，優(yōu)選為帶有醛基基團(tuán)的玻片。
所述試劑盒還包括進(jìn)行PCR反應(yīng)和分子雜交的反應(yīng)液，和50％的二甲基亞砜(DMSO)作為雜交反應(yīng)的空白對(duì)照。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用上述革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)的方法。
本發(fā)明所提供的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法，包括以下步驟
1)利用所述試劑盒中的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因；
2)將步驟1)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與所述試劑盒中的革蘭氏陰性菌耐藥基因探針進(jìn)行雜交，確定待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌所含耐藥基因。
所述PCR為多重不對(duì)稱PCR。
所述PCR擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株的耐藥基因的引物對(duì)中的兩條正反向引物濃度可均相同。
所述PCR擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株的耐藥基因的引物對(duì)中的兩條正反向引物中，5’端連接上所述5′通用加尾序列的一條引物的濃度可為另一條引物的5-100倍，優(yōu)選為2.5倍。
所述PCR擴(kuò)增溫度循環(huán)分為兩個(gè)階段第一階段的每個(gè)溫度循環(huán)由變性、退火和延伸三個(gè)步驟組成，包括10-25個(gè)(20個(gè)左右的具體范圍)溫度循環(huán)；第二階段的每個(gè)溫度循環(huán)由變性和延伸兩個(gè)步驟組成，包括10-25個(gè)(20個(gè)左右的具體范圍)溫度循環(huán)。
所述第二階段的延伸溫度為60-80℃，優(yōu)選為70℃。
革蘭氏染色是非常簡(jiǎn)便(＜10min)的臨床常規(guī)檢測(cè)，本發(fā)明通過染色將陽(yáng)性菌與陰性菌快速分開后，再用基因芯片進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明針對(duì)的是最常見的革蘭氏陰性菌及其最主要的耐藥基因，具有明顯的臨床針對(duì)性和實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明極大的縮短檢測(cè)時(shí)間和增強(qiáng)臨床實(shí)用性，對(duì)于細(xì)菌感染的合理用藥及個(gè)性化治療、控制耐藥菌株的傳播流行等，具有非常重要的意義。
本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法及其專用試劑盒具有集成化程度高、靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，特異性高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可靠性高的特點(diǎn)。


圖1為實(shí)施例1芯片的探針排布示意圖2為實(shí)施例1的芯片檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌耐藥基因的結(jié)果
圖3為實(shí)施例1的芯片檢測(cè)大腸桿菌Z302耐藥基因的結(jié)果
圖4為實(shí)施例1的芯片檢測(cè)陰溝腸桿菌的耐藥基因
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
在本發(fā)明的多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增體系里，DNA聚合酶、dNTP、Mg2+濃度和反應(yīng)緩沖液等組分與常規(guī)PCR相同，并可根據(jù)不同的反應(yīng)予以優(yōu)化。不同之處在于使用的引物一條基因特異性引物與常規(guī)PCR相同，而在另一條基因特異引物的5’末端加上一段與待擴(kuò)增靶序列無關(guān)的寡核苷酸尾(如表1中的5′通用加尾序列)。兩條引物的濃度可相同。不同基因特異性引物可加上相同序列尾(如表1中的5′通用加尾序列)。PCR擴(kuò)增溫度循環(huán)分為兩個(gè)階段(參見表4)第一階段同常規(guī)PCR，包括變性、退火和延伸三個(gè)步驟，退火溫度根據(jù)特異基因引物的Tm值可相應(yīng)調(diào)整，同樣地，延伸時(shí)間也可根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度調(diào)整。經(jīng)約20個(gè)溫度循環(huán)后，立即開始第二個(gè)階段。第二個(gè)階段的溫度循環(huán)只有變性和延伸兩個(gè)步驟，延伸反應(yīng)的溫度約為70℃。在前20個(gè)溫度循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)里，由于退火溫度與基因特異性引物Tm值相當(dāng)，兩條基因特異性引物可進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增。而在后20個(gè)溫度循環(huán)，只有加尾的基因特異性引物(較長(zhǎng)，其全長(zhǎng)的Tm值較高)可以退火延伸，從而達(dá)到制備單鏈的目的。其中，本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒包括的引物如表1。
表1 本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒包括的引物
表2 本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒包括的特異探針
注R＝A或G；雜交質(zhì)控靶標(biāo)用于對(duì)雜交過程進(jìn)行質(zhì)控。
探針(表2)和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的技術(shù)及條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如雜交條件如下中度嚴(yán)謹(jǐn)條件，即在50-60℃，5×SSC雜交1-2小時(shí)后，用溶液2×SSC，0.1％SDS，pH8.0進(jìn)行洗滌，然后用蒸餾水室溫洗滌2分鐘。作為高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件，也可能使用更高的溫度進(jìn)行雜交(例如在65-70℃)。
對(duì)于高選擇性，優(yōu)選地是使用相對(duì)較低的鹽濃度和/或較高的溫度條件，例如鹽濃度從0.02mol/L到0.15mol/L，溫度從50℃到65℃。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在檢測(cè)中使用的是反向雜交技術(shù)，即將探針固定在載體上，合適的載體優(yōu)選地是硅片、用各種功能基團(tuán)修飾的玻片及用各種功能基團(tuán)(例如硝基)衍生的膜(例如尼龍膜、硝酸纖維素膜等)，最優(yōu)選地是帶有醛基基團(tuán)的玻片。將來源于樣品的經(jīng)過標(biāo)記，優(yōu)選地是熒光標(biāo)記的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物變性后，與固定在玻片上的探針進(jìn)行雜交，在該過程中，根據(jù)核酸探針的長(zhǎng)度、組成及預(yù)期雜合子(即標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與探針的結(jié)合)的熔解溫度來選擇溫度、離子強(qiáng)度、pH和其他緩沖液條件(雜交參見Wahl，G.M.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76(1979)3683-3687)。
為了檢測(cè)待測(cè)革蘭氏陰性菌株所含耐藥基因，應(yīng)對(duì)靶核酸與探針雜交的雜交信號(hào)進(jìn)行分析例如，典型地，雜交信號(hào)通過熒光掃描儀，例如GenePix4000B掃描儀(Axon Instruments，Inc.，CA，USA)進(jìn)行檢測(cè)，并通過合適軟件(例如，Genepix3.0)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、利用本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌的耐藥基因檢測(cè)
1、檢測(cè)目標(biāo)及引物、探針
本試劑盒的檢測(cè)目標(biāo)包括革蘭氏陰性菌的耐藥基因tem，shv，ctx-m-1-type，ctx-m-9-type，mox，cit，dha，acc，ebc和fox。
引物和探針的詳細(xì)信息如表1，表2。
引物和探針均由上海博亞生物技術(shù)公司合成。部分引物5′端的TAMRA熒光標(biāo)記和探針5′端氨基修飾也由上海博亞生物技術(shù)公司完成。
2、革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥檢測(cè)基因芯片的制備
1)帶有醛基基團(tuán)的基質(zhì)制備
將玻璃基質(zhì)浸泡于洗液中，室溫過夜。用自來水沖洗以洗凈玻璃基質(zhì)上的酸液，蒸餾水沖洗三次，去離子水漂洗一次，再用去離子水沖洗一次。離心甩干玻璃基質(zhì)，在110℃干燥15分鐘，徹底干燥玻璃基質(zhì)。將玻璃基質(zhì)浸入1％APTES(異丙胺基-三乙氧基硅烷)的95％乙醇中，在室溫下用搖床輕搖1小時(shí)。用95％乙醇清洗處理過的玻璃基質(zhì)，先沖洗一次，再漂洗一次。將洗凈的玻璃基質(zhì)放入真空干燥箱，抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa)，關(guān)閉通氣閥，110℃處理20分鐘。然后將涼至室溫的玻璃基質(zhì)浸泡于12.5％的戊二醛溶液(400mL 12.5％戊二醛溶液100mL 50％的戊二醛，300mL磷酸鹽緩沖液(1mol/L NaH2PO430mL，2.628g NaCl)，調(diào)pH值到7.0)，室溫下輕搖4小時(shí)。將玻璃基質(zhì)從戊二醛溶液中取出，3×SSC漂洗一次，去離子水沖洗兩次，離心甩干，室溫干燥。
2)制備表面固定有探針的玻璃基質(zhì)(基因芯片)
將表2中的探針溶于50％的DMSO中，終濃度為10μmol/L。采用Cartesian的點(diǎn)樣儀(Cartesian Technologies，Inc.，CA，USA)按照?qǐng)D1的樣式(11行×9列)點(diǎn)樣，除表面化學(xué)質(zhì)控探針PBB-0201090和雜交質(zhì)控(EC)探針PBB-0204652重復(fù)點(diǎn)樣6個(gè)點(diǎn)外，每種探針每次重復(fù)點(diǎn)樣3個(gè)點(diǎn)，雜交質(zhì)控靶標(biāo)不點(diǎn)樣。圖1中，H表示表面化學(xué)質(zhì)控探針PBB-0201090，O表示作為雜交反應(yīng)的空白對(duì)照50％的二甲基亞砜(DMSO)，P表示雜交質(zhì)控(EC)探針PBB-0204652，S表示shv通用探針PBB-0201006，m238A表示shv分型探針238位A PBB-0201039，m238S表示shv分型探針238位S PBB-0201013，w238表示shv分型探針238位GPBB-0201012，w240表示shv分型探針240位E PBB-0201014，m240表示shv分型探針240位K PBB-0201015，w35表示shv分型探針35位L PBB-0201016，m35表示shv分型探針35位Q PBB-0201017，w43表示shv分型探針43位R PBB-0201029，m43表示shv分型探針43位S PBB-0201030，w130表示shv分型探針130位SpBB-0201044，m130表示shv分型探針130位G pBB-0201045，w179表示shv分型探針179位D pBB-0201040，m179A表示shv分型探針179位A pBB-0201041，m179N表示shv分型探針179位N pBB-0201042，m179G表示shv分型探針179位GpBB-0201043，9表示ctx-m-9-type通用探針PBB-0201032，1表示ctx-m-1-type通用探針PBB-0201033，T表示tem通用探針pBB-0201027，M表示mox通用探針PBB-0201031，C表示cit通用探針PBB-0201025，D表示dha通用探針PBB-0401031，A表示acc通用探針PBB-0201035，F(xiàn)表示fox通用探針PBB-0201063，E1表示ebc通用探針PBB-0401051，E2表示ebc通用探針PBB-0201036，E3表示ebc通用探針PBB-0201037，N表示陰性對(duì)照探針PBB-HC10。
將點(diǎn)好的玻璃基質(zhì)在室溫中放置過夜以干燥玻璃基質(zhì)，然后室溫下將玻璃基質(zhì)在0.2％的SDS中浸泡兩次，每次2分鐘，振動(dòng)。將玻璃基質(zhì)用去離子水沖洗兩次，去離子水漂洗一次，離心甩干。把玻璃基質(zhì)轉(zhuǎn)移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300mL 1×PBS中，再加入100mL無水乙醇)，室溫?fù)u床輕搖5分鐘。將玻璃基質(zhì)用去離子水沖洗一次，去離子水漂洗兩次，每次1分鐘，離心甩干。
3、細(xì)菌培養(yǎng)與核酸提取
使用表3中的3株革蘭氏陰性細(xì)菌菌株進(jìn)行試驗(yàn)。其中體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果為根據(jù)Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)方法所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表3 待檢測(cè)菌株的已知信息
注a藥物CAZ-t頭孢他啶；CLA-克拉維酸(固定濃度為4μg/ml；CTX-頭孢噻肟；FOX-頭孢西??；IMP-亞胺培南。
bK.pneumoniaeKlebsiella pneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。
在超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)菌劃線接種于MH(Mueller Hinton Agar Medium)培養(yǎng)基平板以分離單菌落，將平板在孵箱中倒置，35℃孵育24h。
從培養(yǎng)細(xì)菌的MH平板上沾取一單菌落，加到100μl 1×TE中。然后將離心管95℃水浴5min，置4℃?zhèn)溆谩?br> 4、核酸擴(kuò)增
多重不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系的組成如下1×MasterMix(北京天為時(shí)代)；表1中除5′通用加尾序列外的其余10對(duì)基因特異性引物(加尾引物0.1μmol/L，不加尾引物0.04μmol/L)；1μL菌液或1μL無菌水(作為空白對(duì)照)。反應(yīng)總體積為25μL。
PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)熱循環(huán)儀上進(jìn)行，采用表4的多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增熱循環(huán)程序。
表4 多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增熱循環(huán)程序
5、芯片雜交及信號(hào)檢測(cè)
雜交反應(yīng)液的配制如表5所示。
表5 雜交反應(yīng)液
在雜交盒(HybriCassettesTM，北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司)內(nèi)加入200μl蒸餾水，以防止雜交反應(yīng)液蒸發(fā)，將表面固定有反應(yīng)物的玻璃基質(zhì)及蓋片(SmartCoverTM，北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司)放置于雜交盒中。雜交反應(yīng)液加熱至95℃保持5分鐘使PCR產(chǎn)物充分變性后，立即置于冰水混合物中冷卻。取13μL雜交反應(yīng)液通過蓋片上的小孔加入蓋片和玻璃基質(zhì)之間的空隙中，蓋好雜交盒，54℃雜交90分鐘。取出芯片，浸入2×SSC，0.2％ SDS的溶液中，室溫?fù)u床輕搖5分鐘。再將芯片用去離子水漂洗兩次，每次2分鐘，離心甩干。
芯片熒光信號(hào)采用晶芯LuxScanTM-10K/B激光共聚焦掃描儀及其配套軟件(北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司)檢測(cè)，檢測(cè)條件為波長(zhǎng)(wavelength)，555nm；PMT，80％；功率(power)，80％。
6、結(jié)果分析
芯片雜交結(jié)果如圖2所示。
E298-芯片檢測(cè)含tem，ctx-m-3-like，dha-1基因，與測(cè)序結(jié)果相符，分析該菌株應(yīng)為對(duì)第三代頭孢菌素和頭孢西丁耐藥，而且不被酶抑制劑克拉維酸抑制，與體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符合；
BJ-7-芯片檢測(cè)含shv-2基因，與測(cè)序結(jié)果相符，分析該菌株應(yīng)為對(duì)第三代頭孢菌素和頭孢西丁耐藥，但對(duì)頭孢西丁敏感，而且可被酶抑制劑克拉維酸抑制，與體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符合；
BJ-35-芯片檢測(cè)含shv-1基因，與測(cè)序結(jié)果相符，分析該菌株應(yīng)為對(duì)第三代頭孢菌素和頭孢西丁敏感，而且可被酶抑制劑克拉維酸抑制，與體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符合。
本方法所得的結(jié)果與臨床常規(guī)方法所得的結(jié)果(MIC值)高度吻合。這說明本發(fā)明所提供的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥檢測(cè)基因芯片試劑盒可以特異地鑒定檢測(cè)目標(biāo)中常見革蘭氏陰性細(xì)菌肺炎克雷伯氏菌所含檢測(cè)目標(biāo)中的耐藥基因。
實(shí)施例2、利用本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行大腸桿菌的耐藥基因檢測(cè)
利用圖1的芯片按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)大腸桿菌Z302的耐藥基因，結(jié)果如表4和圖3所示，芯片檢測(cè)含tem，ctx-m-9-like，cit組基因，與測(cè)序結(jié)果相符，分析該菌株應(yīng)為對(duì)第三代頭孢菌素和頭孢西丁耐藥，而且不被酶抑制劑克拉維酸抑制，本方法所得的結(jié)果與臨床常規(guī)方法所得的結(jié)果(MIC值)高度吻合。這說明本發(fā)明所提供的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥檢測(cè)基因芯片試劑盒可以特異地鑒定檢測(cè)目標(biāo)中常見革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌中所含檢測(cè)目標(biāo)中的耐藥基因。
表4 待檢測(cè)菌株的已知信息
注a藥物CAZ-t頭孢他啶；CLA-克拉維酸(固定濃度為4μg/ml；CTX-頭孢噻肟；FOX-頭孢西?。籌MP-亞胺培南。
實(shí)施例3、利用本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行陰溝腸桿菌的耐藥基因檢測(cè)
利用圖1的芯片按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)陰溝腸桿菌TR3104的耐藥基因，結(jié)果如表5和圖4所示，芯片檢測(cè)含tem，ctx-m-3-like和染色體介導(dǎo)的EBC組基因，與測(cè)序結(jié)果相符，分析該菌株應(yīng)為對(duì)第三代頭孢菌素CTX和頭孢西丁耐藥，本方法所得的結(jié)果與臨床常規(guī)方法所得的結(jié)果(MIC值)高度吻合。這說明本發(fā)明所提供的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥檢測(cè)基因芯片試劑盒可以特異地鑒定檢測(cè)目標(biāo)中常見革蘭氏陰性細(xì)菌陰溝腸桿菌中所含檢測(cè)目標(biāo)中的耐藥基因。
表5 待檢測(cè)菌株的已知信息
注a藥物CAZ-t頭孢他啶；CLA-克拉維酸(固定濃度為4μg/ml；CTX-頭孢噻肟；FOX-頭孢西??；IMP-亞胺培南。
序列表
<160>52
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ggtttcggat gttacagcgt20
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cgcccttatt cccttttttg cgg23
<210>3
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ggtttcggat gttacagcgt tcagtgaggc acctatctca gcg 43
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
tcactcaagg atgtattgtg g 21
<210>5
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
ggtttcggat gttacagcgt ttagcgttgc cagtgctcg 39
<210>6
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ggtttcggat gttacagcgt ccgtcacgct gttgttagga agtg 44
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
ccttaggttg aggctgggtg aagt 24
<210>8
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
ggtttcggat gttacagcgt tgcaacggat gatgttcgcg g41
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
cctttgagcc acgtcaccaa c 21
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
ggtttcggat gttacagcgt gctgctcaag gagcacagga t41
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
cacattgaca taggtgtggt gc 22
<210>12
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
ggtttcggat gttacagcgt tggccagaac tgacaggcaa a41
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
tttctcctga acgtggctgg c 21
<210>14
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
ggtttcggat gttacagcgt aactttcaca ggtgtgctgg gt 42
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
ccgtacgcat actggctttg c 21
<210>16
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>16
ggtttcggat gttacagcgt aacagcctca gcagccggtt a41
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17
ttcgccgcaa tcatccctag c 21
<210>18
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>18
ggtttcggat gttacagcgt tcggtaaagc cgatgttgcg g41
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>19
cttccactgc ggctgccagt t 21
<210>20
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>20
ggtttcggat gttacagcgt aacatggggt atcagggaga tg 42
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>21
caaagcgcgt aaccggattg g 21
<210>22
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>22
tttttttttt ttcgacgagc gtgacaccac g 31
<210>23
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>23
tttttttttt ttggaatggc ggtattcagc gta 33
<210>24
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>24
tttttttttt ttttcgtctc ccagctgtcg g 31
<210>25
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>25
tttttttttt ttcgccttgt catccagctg ca 32
<210>26
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>26
tttttttttt ttgctttatc cctaacgtca tcggg 35
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>27
tttttttttt tttgtgatcc ccttccact 29
<210>28
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>28
tttttttttt tttactcagc gaacccactt ca 32
<210>29
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>29
tttttttttt ttagggaggc gttatccgt 29
<210>30
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>30
tttttttttt tttagagccc agctcaaaca g 31
<210>31
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>31
tttttttttt ttcaaggttt gtggagtgac ag 32
<210>32
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>32
tttttttttt ttcggtgtgg gtcagcgcga tc 32
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>33
tttttttttt ttggctggtt tatcgccgat a 31
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>34
tttttttttt ttcggagctg gccagcgggg t 31
<210>35
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>35
tttttttttt ttcggagcta gccagcgggg t 31
<210>36
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(25)
<223>r＝a或g
<400>36
tttttttttt ttcggagctg cccarcgggg t 31
<210>37
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>37
tttttttttt ttcggagctc gcgagcgggg t 31
<210>38
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>38
tttttttttt ttcggagctc gcaagcgggg t 31
<210>39
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>39
tttttttttt ttaattaaac taagcggaag cc 32
<210>40
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>40
tttttttttt ttaattaaac aaagcggaag cc 32
<210>41
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>41
tttttttttt tttgtcgggc cgcctaggca t 31
<210>42
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>42
tttttttttt tttgtcgggc agcctaggca t 31
<210>43
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>43
tttttttttt ttcattacca tgagcgctaa cag 33
<210>44
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>44
tttttttttt ttcattacca tgggcgctaa cag 33
<210>45
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>45
tttttttttt ttgacgcccg cgaccccact a 31
<210>46
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>46
tttttttttt ttgacgcccg cgcccccact a 31
<210>47
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>47
tttttttttt ttgacgcccg caaccccact a 31
<210>48
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>48
tttttttttt ttgacgcccg cggccccact a 31
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>49
tcacttgctt ccgttgagg 19
<210>50
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>50
tttttttttt ttcctcaacg gaagcaagtg at 32
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>51
atcacttgct tccgttgagg20
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>52
tttttttttt ttcaagcagc cac2權(quán)利要求
1、革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒，包括擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因的引物對(duì)，和檢測(cè)所述革蘭氏陰性菌菌株耐藥基因探針；
所述擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因的引物對(duì)的正向引物和反向引物的大小均為15-50個(gè)核苷酸，優(yōu)選為15-35個(gè)核苷酸；所述擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因的引物對(duì)中的正向引物或反向引物的5’端連接上通用加尾序列；所述通用加尾序列的5’端被熒光標(biāo)記；被連接上所述通用加尾序列的正向引物或反向引物的5’端被熒光標(biāo)記；所述通用加尾序列具有序列表中序列1的核苷酸序列；
所述檢測(cè)革蘭氏陰性菌菌株耐藥基因探針的大小均為15-50個(gè)核苷酸；所述探針的5’端連接上10-35個(gè)寡聚dT，優(yōu)選連接上12-18個(gè)寡聚dT。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株包括大腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述耐藥基因包括tem，shv，ctx-m-1-type，ctx-m-9-type，mox，cit，dha，acc，ebc和fox。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于擴(kuò)增所述tem的正向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列3的核苷酸序列；擴(kuò)增所述shv的正向引物具有序列表中序列4的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列5的核苷酸序列；擴(kuò)增所述ctx-m-1-type的正向引物具有序列表中序列6的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列7的核苷酸序列；擴(kuò)增所述
ctx-m-9-type的正向引物具有序列表中序列8的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列9的核苷酸序列；擴(kuò)增所述mox的正向引物具有序列表中序列10的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列11的核苷酸序列；擴(kuò)增所述cit的正向引物具有序列表中序列12的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列13的核苷酸序列；擴(kuò)增所述dha的正向引物具有序列表中序列14的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列15的核苷酸序列；擴(kuò)增所述acc的正向引物具有序列表中序列16的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列17的核苷酸序列；擴(kuò)增所述ebc的正向引物具有序列表中序列18的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列19的核苷酸序列；擴(kuò)增所述fox的正向引物具有序列表中序列20的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列21的核苷酸序列。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括表面化學(xué)質(zhì)控探針，雜交質(zhì)控探針，陰性對(duì)照探針和所述雜交質(zhì)控探針的靶標(biāo)；所述探針的大小均為15-35個(gè)核苷酸；所述雜交質(zhì)控探針和陰性對(duì)照探針的5’端均連接上10-35個(gè)寡聚dT，優(yōu)選連接上12-18個(gè)寡聚dT。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)耐藥基因探針包括tem通用探針，shv通用探針，ctx-m-1-type通用探針，ctx-m-9-type通用探針，mox通用探針，cit通用探針，dha通用探針，acc通用探針，ebc通用探針和fox通用探針及shv分型探針；所述shv分型探針由檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為E的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為K的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為L(zhǎng)的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為Q的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為R的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為D的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為N的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針和檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述tem通用探針具有序列表中序列22的核苷酸序列；所述shv通用探針具有序列表中序列33的核苷酸序列；所述ctx-m-1-type通用探針具有序列表中序列24的核苷酸序列；所述
ctx-m-9-type通用探針具有序列表中序列23的核苷酸序列；所述mox通用探針具有序列表中序列25的核苷酸序列；所述cit通用探針具有序列表中序列26的核苷酸序列；所述dha通用探針具有序列表中序列27的核苷酸序列；所述acc通用探針具有序列表中序列28的核苷酸序列；所述ebc通用探針具有序列表中序列29或30或31的核苷酸序列；所述fox通用探針具有序列表中序列32的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列34的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列35的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列36的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為E的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列37的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為K的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列38的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為L(zhǎng)的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列39的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為Q的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列40的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為R的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列41的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列42的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列43的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列44的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為D的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列45的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列46的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為N的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列47的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列48的核苷酸序列。
8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述表面化學(xué)質(zhì)控探針具有序列表中序列49的核苷酸序列，雜交質(zhì)控探針具有序列表中序列50的核苷酸序列，雜交質(zhì)控探針的靶標(biāo)具有序列表中序列51的核苷酸序列，陰性對(duì)照探針具有序列表中序列52的核苷酸序列。
9、根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于所述探針固定于載體上。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述載體為硅片、用功能基團(tuán)修飾的玻片或用功能基團(tuán)衍生的膜。
11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于所述載體為帶有醛基基團(tuán)的玻片。
12、根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括進(jìn)行PCR反應(yīng)和分子雜交的反應(yīng)液，和50％的二甲基亞砜。
13、利用權(quán)利要求1-12中任一權(quán)利要求所述的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)的方法，包括以下步驟
1)利用所述試劑盒中的引物PCR擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株的耐藥基因；
2)將步驟1)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與所述試劑盒中的檢測(cè)革蘭氏陰性菌耐藥基因探針進(jìn)行雜交，確定待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株所含耐藥基因。
14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述PCR為多重不對(duì)稱PCR。
15、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因的引物對(duì)中的兩條正反向引物濃度均相同。
16、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株耐藥基因的引物對(duì)中的兩條正反向引物中，5’端連接上所述5′通用加尾序列的一條引物的濃度是另一條引物的1-100倍，優(yōu)選為2.5倍。
17、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增溫度循環(huán)分為兩個(gè)階段第一階段的每個(gè)溫度循環(huán)由變性、退火和延伸三個(gè)步驟組成，包括10-25個(gè)溫度循環(huán)；第二階段的每個(gè)溫度循環(huán)由變性和延伸兩個(gè)步驟組成，包括10-25個(gè)溫度循環(huán)。
18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述第二階段的延伸溫度為60-80℃，優(yōu)選為70℃。
19、革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)芯片，包括tem通用探針，shv通用探針，ctx-m-1-type通用探針，ctx-m-9-type通用探針，mox通用探針，cit通用探針，dha通用探針，acc通用探針，ebc通用探針和fox通用探針及shv分型探針；所述shv分型探針由檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為E的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為K的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為L(zhǎng)的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為Q的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為R的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為D的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針、檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為N的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針和檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針。
20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的芯片，其特征在于所述tem通用探針具有序列表中序列22的核苷酸序列；所述shv通用探針具有序列表中序列33的核苷酸序列；所述ctx-m-1-type通用探針具有序列表中序列24的核苷酸序列；所述
ctx-m-9-type通用探針具有序列表中序列23的核苷酸序列；所述mox通用探針具有序列表中序列25的核苷酸序列；所述cit通用探針具有序列表中序列26的核苷酸序列；所述dha通用探針具有序列表中序列27的核苷酸序列；所述acc通用探針具有序列表中序列28的核苷酸序列；所述ebc通用探針具有序列表中序列29或30或31的核苷酸序列；所述fox通用探針具有序列表中序列32的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列34的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列35的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第238位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列36的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為E的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列37的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第240位氨基酸殘基為K的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列38的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為L(zhǎng)的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列39的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第35位氨基酸殘基為Q的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列40的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為R的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列41的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第43位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列42的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為S的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列43的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第130位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列44的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為D的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列45的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為A的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列46的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為N的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列47的核苷酸序列；所述檢測(cè)自氨基端第179位氨基酸殘基為G的SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的探針具有序列表中序列48的核苷酸序列。
21、根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的芯片，其特征在于所述芯片還包括表面化學(xué)質(zhì)控探針，雜交質(zhì)控探針和陰性對(duì)照探針；所述探針的大小均為15-35個(gè)核苷酸；所述雜交質(zhì)控探針和陰性對(duì)照探針的5’端均連接上10-35個(gè)寡聚dT，優(yōu)選連接上12-18個(gè)寡聚dT。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法及其專用芯片與試劑盒。該試劑盒包括擴(kuò)增待測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌菌株的耐藥基因的引物對(duì)，和檢測(cè)所述革蘭氏陰性菌菌株的耐藥基因探針。利用該試劑盒進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)的方法，包括1)利用試劑盒中的引物PCR擴(kuò)增待測(cè)菌株的耐藥基因；2)將擴(kuò)增產(chǎn)物與所述檢測(cè)革蘭氏陰性菌耐藥基因探針進(jìn)行雜交，確定待測(cè)菌株所含耐藥基因。本發(fā)明的試劑盒具有集成化程度高、靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，特異性高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可靠性高的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1840693SQ200610001309
公開日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2006年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月18日
發(fā)明者祝令香, 張治位, 蔣迪, 杜寧, 王璨, 楊華衛(wèi), 張瓊, 高華方, 周玉祥, 程京 申請(qǐng)人:北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司, 清華大學(xué)