專利名稱：小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其表達方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其表達方法與應(yīng)用，特別涉及小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其表達方法，與該小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體在合成RNA中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根據(jù)對底物的選擇特異性，傳統(tǒng)上把核酸聚合酶分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。聚合酶對底物的選擇通常是非常嚴格的，因為它們分別承擔著遺傳物質(zhì)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄兩個生物學最基本的功能。
然而對聚合酶的分類可能并非象想像的那么簡單。DNA聚合酶和RNA聚合酶盡管在一級結(jié)構(gòu)上沒有同源性，但是它們的聚合酶結(jié)構(gòu)域的高級結(jié)構(gòu)卻非常類似，呈一個半張開的右手狀，包含有手掌，手指以及拇指亞結(jié)構(gòu)域。另外，它們的催化機制也非常的類似。而對作為底物的脫氧核糖核苷酸(dNTPs)和核糖核苷酸(rNTPs)而言，它們的唯一區(qū)別就是rNTPs的2’-OH基團。這說明DNA聚合酶和RNA聚合酶之間可能存在著某種關(guān)聯(lián)，或者說它們在進化上存在著某種相關(guān)性，有可能通過它們結(jié)構(gòu)上的一個小的改變，來實現(xiàn)DNA聚合酶和RNA聚合酶的角色轉(zhuǎn)換。
小鼠白血病病毒(Murine Leukemia Virus，簡稱MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase，簡稱RT，是由逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼的DNA聚合酶，能以RNA或DNA作為模板合成DNA。Guangxia Gao等于1997年發(fā)表在Proceedings of the NationalAcademy of sciences of the Unite States of America第407-411頁的文章(專利號US6136582)表明，當將MLV-RT的自N-端155位的苯丙氨酸(F155)突變成纈氨酸(V)時，RT-F155V能夠利用RNA或者DNA作為模板將rNTPs參入到產(chǎn)物，也就是說RT具有了RNA聚合酶的活性。RT-F155V-H帶有F155V和D524N雙突變的MMLV RT，F(xiàn)155V突變使RT具有了參入rNTPs的能力，D524N突變將消除MMLV RT的RNase H活性，這樣可以避免RT的RNase H活性對RNA產(chǎn)物的降解。
但是RT-F155V-H催化RNA合成的效率仍然很低，而且合成的RNA片段也很短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。
本發(fā)明所提供的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，是將小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的自N端第155位苯丙氨酸殘基取代為纈氨酸、自N端第524位天門冬氨酸殘基取代為天門冬酰胺殘基和自N端第84位谷氨酰胺殘基取代為氨基酸殘基X的蛋白質(zhì)，其中X為側(cè)鏈短于谷氨酰胺側(cè)鏈的氨基酸。該小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的名稱為RT-Q84X-F155V-H。
所述小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MLV-RT)的氨基酸序列如序列3所示。
所述X可為丙氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸或絲氨酸。
所述X為丙氨酸；所述小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列，該小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的名稱為RT-Q84A-F155V-H。
上述小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列；所述小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體編碼基因(RT-Q84A-F155V-H)具有序列表中序列1的自5′端第1515位至第3527位脫氧核苷酸的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達RT-Q84A-F155V-H的方法。
該表達RT-Q84X-F155V-H的方法，是將含有RT-Q84X-F155V-H編碼基因的表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)陽性克隆，表達得到小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。
所述含有RT-Q84X-F155V-H編碼基因的表達載體是具有序列表中序列1的核苷酸序列的質(zhì)粒pTacRT-Q84A-F155V-D524N。
所述大腸桿菌優(yōu)選為Escherichia coli BL21。
本發(fā)明利用蛋白質(zhì)工程方法，將一種DNA聚合酶小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MLV-RT)改造成具有較高酶活性和RNA合成能力的RNA聚合酶。實驗證明RT-Q84X-F155V-H具有比RT-F155V-H更高的RNA聚合酶比活性和RNA合成能力。


圖1是RT-Q84A-F155V-H純化后的SDS-PAGE電泳檢測圖。
圖2是RT-Q84A-F155V-H和RT-F155V-H的RNA聚合酶活性的比較圖。
圖3是RT-Q84A-F155V-H和RT-F155V-H合成RNA片段能力的比較圖。
具體實施例方式
本發(fā)明通過分析MLV-RT的晶體結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)該酶第84位的谷氨酰胺(Q84)位于酶的活性中心附近，參與調(diào)控酶的催化能力，其較長的側(cè)鏈妨礙合成產(chǎn)物的延伸，影響RNA聚合酶的活性和合成RNA的能力。本發(fā)明將這個位于酶的活性中心的大的氨基酸殘基替換成小的氨基酸殘基，協(xié)助這些DNA聚合酶更好的容納RNA產(chǎn)物。本發(fā)明將RT-F155V-H基因進行突變，使Q84殘基突變成側(cè)鏈較短的殘基，產(chǎn)生了新的突變酶RT-F155V-Q84X，其中X為側(cè)鏈短于谷氨酰胺側(cè)鏈的氨基酸，如天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)等。同時，本發(fā)明將Q84X突變引入RT-F155V-H中，使之成為RT-Q84X-F155V-H。本發(fā)明比較了將MLV-RT中第84位的谷氨酰胺突變?yōu)楸彼岷螽a(chǎn)生的RT-Q84A-F155V-H和RT-F155V-H的RNA聚合酶活性及RNA合成能力，實驗證明RT-Q84A-F155V-H具有比RT-F155V-H更高的RNA聚合酶比活性和RNA合成能力。
本發(fā)明還提供了一種在大腸桿菌E.coli中表達重組RT-Q84X-F155V-H逆轉(zhuǎn)錄酶的方法。
下面通過優(yōu)選實例對本發(fā)明做更詳細的描述。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、RT-Q84A-F155V-H的合成及其功能本實施例中將RT-F155V-H(Guangxia Gao等于1997年發(fā)表在Proceedings ofthe National Academy of sciences of the Unite States of America第407-411頁的文章，專利號US6136582)中的第84位的谷氨酰胺突變?yōu)楸彼幔怪蔀镽T-Q84A-F155V-H。
1、質(zhì)粒pTacRT-Q84A-F155V-D524N的構(gòu)建RT-Q84A-F155V-H的定點突變采用將兩段PCR產(chǎn)物AflII-EcoRI和EcoRI-MfeI替換掉pTacRT-F155V-D524N的AflII-MfeI片段(nt1467-2280)。引物Q84A-SP(5’CGGAATTCTGGTACCCTGCCAGTC)包含有一個由于同義突變產(chǎn)生的EcoRI酶切位點(用下劃線表示)，它和下游引物PCR擴增得到一個300bp的EcoRI-MfeI片段。引物Q84A-AP(5’CGGAATTCCCGCGTCCAACAGTCTCTGTA)同樣包含有一個由于同義突變產(chǎn)生的EcoRI酶切位點以及突變的丙氨酸密碼子(黑體表示)，它和上游引物經(jīng)PCR擴增得到一個500bp的AflII-EcoRI片段。所得重組質(zhì)粒通過酶切鑒定為陽性克隆。具體方法如下(1)EcoRI-MfeI片段的合成以pTacRT-F155V-D524N(Guangxia Gao等于1997年發(fā)表在Proceedings of theNational Academy of sciences of the Unite States of America第407-41l頁的文章，專利號US6136582)為模板，利用上游引物Q84A-SP和下游引物MfeI-AP(5’-TGGGAGTCTGGTCCAGG-3’PCR擴增得到300bp的EcoRI-MfeI片段。其中，PCR的溫度條件為先95℃預(yù)變性2min；然后95℃30s，55℃1min，72℃1min，20個循環(huán)；最后72℃，10min補平末端。
(2)AflII-EcoRI片段的合成以pTacRT-F155V-D524N(Guangxia Gao等于1997年發(fā)表在Proceedings of theNational Academy of sciences of the Unite States of America第407-411頁的文章，專利號US6136582)為模板，利用上游引物AflII-SP(5’-GTGGAATTGTGAGCGGA-3’)和下游引物Q84A-AP PCR擴增得到一個500bp的AflII-EcoRI片段。其中，PCR的溫度條件為先95℃預(yù)變性2min；然后95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，20個循環(huán)；最后72℃，10min補平末端。
(3)質(zhì)粒pTacRT-Q84A-F155V-D524N的構(gòu)建將經(jīng)AflII和EcoRI酶切后的AflII-EcoRI片段，EcoRI和MfeI酶切后的EcoRI-MfeI片段和經(jīng)AflII和MfeI酶切pTacRT-F155V-D524N(Guangxia Gao等于1997年發(fā)表在Proceedings of the National Academy of sciences of the UniteStates of America第407-411頁的文章，專利號US6136582)后得到的6.7kb片段連接，得到AflII-EcoRI和EcoRI-MfeI替換掉pTacRT-F155V-D524N的AflII-MfeI片段(nt1467-2280)的質(zhì)粒pTacRT-Q84A-F155V-D524N，測序表明pTacRT-Q84A-F155V-D524N(序列1)含有具有序列表中序列1的自5′端第1515位至第3527位脫氧核苷酸的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體編碼基因RT-Q84A-F155V-H，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體RT-Q84A-F155V-H。
2、RT-Q84A-F155V-H在大腸桿菌中的誘導(dǎo)和表達將pTacRT-Q84A-F155V-D524N轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21，挑取單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至0D600≈0.5時，加入IPTG至終濃度0.5mM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時，收集菌體，將菌體用預(yù)冷的50mMTris-HCl(pH 7.5)洗滌一次后備用。
3、RT-Q84A-F155V-H的純化將收集的菌體懸浮于緩沖液A(20mM PBS，pH 7.4，0.5M NaCl)，凍融后，加入溶菌酶至終濃度0.5mg/ml，4℃消化30min，超聲波破碎3次，每次20秒，離心，收集上清。經(jīng)過金屬螯合層析柱HiTrap chelating HP column(購自Pharmacia)分離純化后，純度即達80％以上，收集活性蛋白峰，經(jīng)過離子交換層析柱MonoS(購自Pharmacia)進一步分離純化后，電泳檢測考馬斯亮藍染色，結(jié)果顯示該蛋白為一分子量約為76KD的均一條帶，未見雜質(zhì)(圖1)，達到對RT進行酶學研究分析的要求。圖1中各泳道分別為M分子量標準；1RT-Q84A-F155V-H；2、RT-F155V-H(Guangxia Gao等于1997年發(fā)表在Proceedings of the National Academy ofsciences of the Unite States of America第407-411頁的文章；US6136582)。
4、RT-Q84A-F155V-H的RNA聚合酶活性測定及動力學分析50μl反應(yīng)體系中包括40ng RT純酶樣品，60mM Tris.HCl(pH 8.0)，75mM NaCl，0.7mM MnCl2，5mM DTT，12μg/ml Poly(rA)模板，6μg/ml oligo(dT)18引物，10μCi/ml(1Ci＝37GBq)32P標記的UTP以及12μM未標記的UTP，反應(yīng)于37℃進行。分別于反應(yīng)開始后不同時間點取樣4μl點于DE81濾紙，終止反應(yīng)。然后將DE81濾紙用2×SSC洗滌三次，95％乙醇漂洗兩次，將濾紙晾干后，放射自顯影。定量分析采用液閃計數(shù)儀測定。
動力學分析采用公知的雙倒數(shù)作圖法進行。用每個樣品中“保留在DE81濾紙的放射強度/同一樣品總的放射強度”來表示參入到產(chǎn)物中的UTP的量。
選用poly(rA)-oligo(dT)18作為模板-引物，rUTP為底物對這三個變體酶進行RNA聚合酶酶活分析，結(jié)果顯示，當將Q84替換成A后，能提高RT-F155V-H的RNA聚合酶的活性(圖2，比較RT-Q84A-F155V-H和RT-F155V-H)。將Q84突變成天冬酰氨(N)(比Q少一個甲基基團)得到的RT-Q84N-F155V-H(RT-Q84N-F155V-H也由671個氨基酸殘基組成，除自氨基端第84位氨基酸殘基為Asn外，其它氨基酸殘基與序列2相同，可參照RT-Q84A-F155V-H的表達方法進行制備)，同樣能提高RT-F155V-H的RNA聚合酶活性(圖2，RT-Q84N-F155V-H))。作為對照，將Q84替換成大的氨基酸殘基如RT-Q84R-F155V-H(RT-Q84R-F155V-H也由671個氨基酸殘基組成，除自氨基端第84位氨基酸殘基為Arg外，其它氨基酸殘基與序列2相同，可參照RT-Q84A-F155V-H的表達方法進行制備)時，則不能提高RT-F155V-H的RNA聚合酶活性(圖2，RT-Q84R-F155V-H)。需要指出的是，是F155V突變使得MMLV RT具有了RNA聚合酶活性，只帶有Q84A和D524N雙突變的RT-Q84A-H(RT-Q84A-H也由671個氨基酸殘基組成，除自氨基端第84位氨基酸殘基為Ala、第155位氨基酸殘基為Phe、第524位氨基酸殘基為Asn外，其它氨基酸殘基與序列2相同，可按常規(guī)方法制備)與RT-WT-H(RT-WT-H也是由671個氨基酸殘基組成，除自氨基端第84位氨基酸殘基為Gln、第155位氨基酸殘基為Phe、第524位氨基酸殘基為Asn外，其它氨基酸殘基與序列2相同，可按常規(guī)方法制備)一樣，不具有RNA聚合酶活性。
動力學分析顯示，在以UTP為底物時，RT-Q84A-F155V-H和RT-F155V-H具有相似的Km(分別為2.98μM和2.88μM)，而RT-Q84A-F155V-H的最大反應(yīng)速率Vmax值則是RT-F155V-H的4.3倍(分別為9.94nmol.min-1.ng-1和2.31nmol.min-1.ng-1)(見表1)。
表1.RT-Q84A-F155V-H與RT-F155V-H RNA聚合酶動力學參數(shù)比較。

5、RT合成RNA實驗將寡核苷酸P21(5’-AAGCCCCACATACAGAGACTG-3’)用[γ-32P]ATP進行末端標記。此標記產(chǎn)物*P21先過G25柱純化，然后與作為模板的一段寡核苷酸T36(3’-TTCGGGGTGTATGTCTCTGACAACCTGGTCGTCCCT-5’)退火。退火反應(yīng)先在65℃保溫10min，然后緩慢降溫至室溫。RNA合成反應(yīng)60μl反應(yīng)體系中包括3μg RT純酶樣品，60mM Tris.HCl(pH 8.0)，75mM NaCl，0.7mM MnCl2，5mM DTT，0.1μM*P21/T36以及500μM未標記的超純的rNTP(Amersham)。反應(yīng)于37℃進行，反應(yīng)開始后于不同時間點取樣中止反應(yīng)。然后通過23％尿素PAGE分離產(chǎn)物，放射自顯影檢測，采用PhosphorImager定量。
和Gguangxia Gao等1997年發(fā)表的結(jié)果一致，RT-F155V-H在反應(yīng)120min后仍然只能合成7個核苷酸的一段RNA(圖3，泳道6箭頭示)。與之相比較，經(jīng)過30min反應(yīng)RT-Q84A-F155V-H就能合成出更長的RNA產(chǎn)物。并且RT-Q84A-F155V-H合成RNA的速率要比RT-F155V-H快得多(圖3，比較第2和7，3和8，4和9，5和10，6和11泳道)。同樣的反應(yīng)條件下，以dNTPs作為底物充分延伸得到的全長DNA(36nt)的遷移速率明顯比RT-Q84A-F155V-H合成的最長的RNA快，表明RT-Q84A-F155V-H的合成產(chǎn)物不是由于dNTPs的污染造成的。RT-Q84A-F155V-H合成的最長RNA產(chǎn)物是一段全長的15-nt RNA(圖3，第11泳道)。圖3中，泳道1為*P21的電泳結(jié)果，泳道2、3、4、5、6分別為RT-F155V-H反應(yīng)5、10、30、60和120分鐘的產(chǎn)物電泳結(jié)果，泳道7、8、9、10、11分別為RT-Q84A-F155V-H反應(yīng)5、10、30、60和120分鐘的產(chǎn)物電泳結(jié)果，泳道12為同樣的反應(yīng)條件下，以dNTPs作為底物RT-Q84A-F155V-H合成的DNA電泳結(jié)果。
序列表<160>3<210>1<211>7488<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ccgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga 60gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg 120gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 180cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac 240aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc 300acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg 360tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc 420ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca 480ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga 540cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc 600tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg 660cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag 720cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga 780atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa 840tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg 900acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc 960gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga1020agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata1080cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt1140
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權(quán)利要求
1.小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，是將小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的自N端第155位苯丙氨酸殘基取代為纈氨酸、自N端第524位天門冬氨酸殘基取代為天門冬酰胺殘基和自N端第84位谷氨酰胺殘基取代為氨基酸殘基X的蛋白質(zhì)，其中X為側(cè)鏈短于谷氨酰胺側(cè)鏈的氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于所述X為丙氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸或絲氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于所述X為丙氨酸；所述小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
4.權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的編碼基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼基因，其特征在于所述小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列；所述小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體編碼基因具有序列表中序列1的自5′端第1515位至第3527位脫氧核苷酸的核苷酸序列。
6.一種表達權(quán)利要求1所述的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的方法，是將含有權(quán)利要求1所述的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體編碼基因的表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)陽性克隆，表達得到小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述含有權(quán)利要求1所述的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體編碼基因的表達載體是具有序列表中序列1的核苷酸序列的質(zhì)粒pTacRT-Q84A-F155V-D524N。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌為Escherichiacoli BL21。
9.含有權(quán)利要求4或5所述的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的編碼基因的表達載體，細胞系或宿主菌。
10.權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體在合成RNA中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其表達方法與應(yīng)用。該小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，是將小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的自N端第84位谷氨酰胺殘基取代為氨基酸殘基X的蛋白質(zhì)，其中X為側(cè)鏈短于谷氨酰胺側(cè)鏈的氨基酸。本發(fā)明的小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體具有比RT－F155V－H更高的RNA聚合酶比活性和RNA合成能力。
文檔編號C12N15/63GK1807605SQ20061000135
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月19日
發(fā)明者高光俠, 劉樹峰 申請人:中國科學院生物物理研究所