專利名稱：表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。本發(fā)明還涉及該重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的制備方法及其作為疫苗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，作為副粘病毒科的重要成員和模型病毒，得到深入研究。重組NDV作為活病毒疫苗載體具有非凡的優(yōu)點(diǎn)包括LaSota株在內(nèi)的NDV弱毒疫苗長(zhǎng)期以來(lái)一直用于家禽防疫，其安全有效性已被充分證明；NDV遺傳相對(duì)穩(wěn)定，僅有一個(gè)血清型，毒株間發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)可能性極小；復(fù)制過(guò)程在細(xì)胞漿內(nèi)完成，從RNA到RNA，不存在DNA階段及細(xì)胞基因組整合的可能；NDV弱毒疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)全身性體液免疫、局部粘膜免疫及細(xì)胞免疫的形成，形成更加全面、確實(shí)的免疫保護(hù)；可通過(guò)飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼或注射多種方式給苗，使用極為方便；NDV具有高滴度的雞胚生長(zhǎng)特性，生產(chǎn)成本極為低廉(1，7，8，11，12，13)。NDV為高度傳染性和高度致死性的家禽疫病原，我國(guó)每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百億羽份以上。NDV作為活病毒疫苗載體應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)意義十分巨大。
負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作(Reverse genetic)是通過(guò)操作病毒基因組cDNA制造新病毒的過(guò)程，其基本過(guò)程是①組裝完整的病毒基因組(或重組型基因組)cDNA克隆，5’末端精確地綴于T7啟動(dòng)子后，3’末端精確綴于自我剪切的核酸酶序列和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板；②以基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板與啟動(dòng)病毒復(fù)制必須的轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能結(jié)構(gòu)蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表達(dá)質(zhì)粒(T7啟動(dòng)子)一起，共轉(zhuǎn)染整合表達(dá)T7聚合酶的病毒復(fù)制許可細(xì)胞；③24-72小時(shí)后收獲培養(yǎng)上清，過(guò)濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲(rescue)病毒。對(duì)基因組cDNA進(jìn)行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過(guò)反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system，RGS系統(tǒng))可獲得相應(yīng)的突變或重組的負(fù)鏈RNA病毒(1，2，3，4，5，6)。
NDV基因組全長(zhǎng)15186核苷酸，與其它副粘病毒一樣，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄編碼單元(圖1A)。本研究將GFP蛋白克隆到P和M之間，來(lái)研究外源蛋白在NDV中的表達(dá)適當(dāng)位置。NDV和其它負(fù)鏈RNA病毒一樣，其最小感染單位是核糖核蛋白復(fù)合物，無(wú)蛋白包裹的RNA本身并無(wú)感染性。NDV的基因組RNA通過(guò)與NP、P、L蛋白一起組成核蛋白復(fù)合體，啟動(dòng)RNA的首輪轉(zhuǎn)錄及病毒蛋白的翻譯合成、產(chǎn)生感染性子代病毒(7，10)。根據(jù)這一原理，1999年歐洲學(xué)者率先建立了第一個(gè)高致病性NDV的反向遺傳操作系統(tǒng)(reversegenetic system，RGS系統(tǒng))(2)。目前在歐、美至少有4個(gè)實(shí)驗(yàn)室利用NDV的RGS技術(shù)在基礎(chǔ)與應(yīng)用研究方面開(kāi)展激烈的競(jìng)爭(zhēng)性研究。2001-2002年，Palese.P.等相繼構(gòu)建表達(dá)H1亞型流感病毒HA免疫原基因的重組NDV B1株和表達(dá)H7亞型流感病毒HA免疫原基因的重組NDVB1株，免疫試驗(yàn)表明這兩種NDV活載體疫苗可分別在小鼠和禽類誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。但是由于B1本身高度致弱，在免疫接種雞體內(nèi)的復(fù)制能力較差，因而誘導(dǎo)免疫雞形成有效免疫保護(hù)的能力也相對(duì)較弱，試驗(yàn)表明，表達(dá)H7亞型HA基因的NDV B1株對(duì)NDV及H7亞型高致病力禽流感致死性攻擊的存活保護(hù)分別僅為60％和40％，且不能阻止病毒在體內(nèi)的復(fù)制和排放(12)。研究表明，NDV基因組在不同位點(diǎn)插入外源報(bào)告基因或免疫原基因，經(jīng)細(xì)胞或雞胚連續(xù)高代次傳代仍保持高度的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性(11，12，13)。
IBDV(Infectious Bursal Disease Virus)是危害我國(guó)乃至世界養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疫病原。IBDV屬雙股雙節(jié)段RNA病毒(Birnaviridae)，基因組較小的節(jié)段B編碼約90KD的RNA依賴聚合酶VP1，較長(zhǎng)的節(jié)段A編碼一個(gè)小的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5、一個(gè)大的裂解前體蛋白及其裂解產(chǎn)物VP2、VP4和VP3。真核細(xì)胞異源表達(dá)VP2-VP4-VP3前體蛋白并對(duì)VP3蛋白C段氨基酸進(jìn)行適當(dāng)修飾，可促進(jìn)成熟的病毒粒子的裝配形成。VP2及VP3構(gòu)成了病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP2是誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體的主要免疫原。感染雛雞后的靶細(xì)胞主要為處于分化階段的B細(xì)胞，引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞發(fā)育相關(guān)淋巴組織、特別是法氏囊的病理?yè)p傷及免疫抑制，結(jié)果導(dǎo)致對(duì)其他病原更為易感及疫苗免疫失敗。近20年來(lái)，IBDV流行株的毒力逐漸增強(qiáng)，世界各國(guó)不斷出現(xiàn)對(duì)感染雛雞致死率高達(dá)60～80％以上的超強(qiáng)毒株(vvIBDV)；另外，從1985年起美國(guó)開(kāi)始分離到抗原性不同于IBDV經(jīng)典株的變異株。疫苗免疫是防制IBD的主要手段。我國(guó)目前廣泛采用低致病力或中等致病力活毒疫苗，但每年因IBD造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失仍然數(shù)以億計(jì)。超強(qiáng)毒的出現(xiàn)給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)IBD的防制構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。造成IBD活毒疫苗免疫失敗的重要原因是生產(chǎn)現(xiàn)地新生雛雞廣泛存在母源抗體的干擾影響。由于母源抗體的存在，被迫采用毒力更強(qiáng)的中等毒力疫苗株，不可避免造成部分免疫雛雞淋巴組織的病理?yè)p傷及免疫抑制；長(zhǎng)期大量應(yīng)用活毒疫苗被認(rèn)為是超強(qiáng)毒及變異株出現(xiàn)的重要原因。長(zhǎng)期以來(lái)，各國(guó)學(xué)者采用生物技術(shù)手段研制IBD新型疫苗以取代傳統(tǒng)IBDV活毒疫苗的嘗試與努力從未間斷，并取得一系列重要進(jìn)展，先后研制了不同表達(dá)系統(tǒng)的VP2亞單位疫苗、表達(dá)VP2抗原的重組禽痘病毒、重組火雞皰疹病毒/馬立克氏病毒、重組禽腺病毒等活載體疫苗也相繼取得成功。但由于上述表達(dá)系統(tǒng)、活病毒載體本身的不足與缺陷以及使用成本等原因，均未實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)實(shí)際的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述研究背景，本發(fā)明人為進(jìn)一步提高IBDV表達(dá)抗原的免疫原性，避免NDV特異母源抗體對(duì)免疫效果的干擾，構(gòu)建表達(dá)我國(guó)IBDV超強(qiáng)毒分離株VP2抗原的重組NDV活載體二聯(lián)弱毒疫苗rLasota-VP2，用于芻雞新城疫與法氏囊病預(yù)防免疫的初次免疫或加強(qiáng)免疫。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。優(yōu)選所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615，更優(yōu)選所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-VP2。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)上述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，該方法包括
(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入傳染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)收獲上清液，過(guò)濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。
在上述生產(chǎn)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將IBDV的VP2基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組P，M之間人工引入的PmeI位點(diǎn)。優(yōu)選所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615。
在上述生產(chǎn)方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，包括在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的基因組cDNA序列位于T7啟動(dòng)子之后，而在編碼自我剪切的核酸酶的序列和T7轉(zhuǎn)錄終止子之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板。優(yōu)選所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎病毒核酶(Rib)。
在上述生產(chǎn)方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，包括在所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒中的編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7啟動(dòng)子之后。優(yōu)選所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pBRN-FL-VP2，所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是BHK-21。
本發(fā)明還提供了上述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株(特別是rLasota-VP2)在制備預(yù)防傳染性法氏囊病毒導(dǎo)致的疾病的疫苗中的應(yīng)用。
本研究通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增了NDV疫苗株LaSota 10個(gè)cDNA片段，利用片段之間互相重疊的部分進(jìn)行拼接，裝配成全長(zhǎng)cDNA克隆。序列測(cè)定結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為AY845400。將IBDV的VP2基因插入基因組P、M基因非編碼區(qū)到全長(zhǎng)基因組中，然后將其核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至表達(dá)T7聚合酶的痘病毒感染細(xì)胞內(nèi)，從而合成反基因組RNA。此RNA在NP、P和L蛋白的作用下，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。將轉(zhuǎn)染上清接種SPF胚，得到來(lái)自cDNA的具有感染性的病毒。通過(guò)堿基突變，產(chǎn)生了帶有遺傳標(biāo)簽的Lasota的派生株rLasota-VP2，救獲的病毒在雞胚上增殖特征與野毒相近，血凝價(jià)高達(dá)212，以上結(jié)果顯示，經(jīng)遺傳修飾的NDV可以從cDNA克隆救獲病毒，再一次證實(shí)NDV具有作為疫苗活載體的潛力，利用已建立的NDV弱毒株LasotaAV1615株的反基因操作系統(tǒng)研制出了可同時(shí)防制NDV及IBDV的重組病毒活載體雙價(jià)(二聯(lián))高效疫苗株。


圖1.從高保真RT-PCR產(chǎn)生的亞基因組重疊cDNA片段裝配全長(zhǎng)NDV cDNA。將cDNA片段在共有的限制位點(diǎn)連接，并且在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBR322中裝配，在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBR322中將RBZ和T7終止子序列預(yù)先克隆在EcoRI和salI位點(diǎn)之間(詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。(A)顯示親代NDV的整個(gè)全長(zhǎng)基因組的第一個(gè)和最后一個(gè)核苷酸。(B)顯示含有IBDV的VP2基因的NDV的cDNA克隆，在遺傳圖譜之下的水平線顯示單個(gè)cDNA的位置。
圖2.通過(guò)RT-PCR產(chǎn)生引入修飾酶位點(diǎn)的核苷酸變化，并通過(guò)使用PRISM試劑盒(Perkin-Elmer)和Applied Biosystems ABI310自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。加框的是通過(guò)PCR誘變?cè)趐BRN1-10中引入的一個(gè)核苷酸替代(由A突變?yōu)镚)。
圖3.重組新城疫病毒rLasota-VP2表達(dá)抗原蛋白的免疫熒光分析。rLasota-VP2雞胚傳代F2代感染BHK-21細(xì)胞(A & C)和未感染BHK-21細(xì)胞(B & D)，分別以雞抗新城疫高免血清(A & B)和雞抗IBDV高免血清(C & D)為一抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示傳染性法氏囊病毒VP2抗原在重組新城疫病毒rLasota-VP2獲得有效表達(dá)。
圖4.表達(dá)IBDV超強(qiáng)毒Gx株VP2抗原的重組新城疫病毒活載體疫苗雞胚生長(zhǎng)動(dòng)力測(cè)定比較。SPF雞胚傳代F2代次種子毒尿囊液以1×103EID50劑量接種10日齡SPF雞胚50枚。于不同時(shí)間點(diǎn)分別取出10枚雞胚，分別收獲尿原液，10倍連續(xù)梯度稀釋按常規(guī)進(jìn)行EID50滴定。
圖5.Western-blot檢測(cè)重組新城疫病毒rLasota-VP2表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2抗原。rLasota-VP2株和NDV LaSota株，按MOI為1分別感染BHK-21細(xì)胞，感染24小時(shí)后收集感染細(xì)胞，SDS-PAGE電泳、以雞抗IBDV高免血清為一抗、HRP-偶聯(lián)的兔抗-雞IgG為二抗，進(jìn)行免疫Blot檢測(cè)。結(jié)果顯示傳染性法氏囊病毒VP2抗原在重組新城疫病毒rLasota-VP2獲得正確表達(dá)。(泳道1，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；泳道2，rLasota-VP2感染BHK-21細(xì)胞；泳道3，NDV LaSota株)。
圖6.表達(dá)IBDV超強(qiáng)毒Gx株VP2抗原重組新城疫病毒活載體雙價(jià)疫苗免疫1周齡SPF雛雞誘導(dǎo)新城疫病毒特異HI抗體免疫反應(yīng)。疫苗經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑免疫7日齡雛雞，每羽2×106EID50劑量，共100μl體積；免疫后第1、2、3、4周分別采集翅靜脈血，進(jìn)行NDV特異HI抗體檢測(cè)。
圖7.pBTRT的質(zhì)粒圖譜。
圖8.pBTRT質(zhì)粒的DNA序列。第一個(gè)斜體部分T7啟動(dòng)子；帶下劃線部分核酶序列；第二個(gè)帶下劃線的斜體部分T7終止子。
圖9.pBRN-FL-VP2的質(zhì)粒圖譜。
圖10.pBRN-FL-VP2質(zhì)粒的DNA序列。帶下劃線的斜體部分是VP2基因。
具體實(shí)施例方式
下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。
實(shí)施例1表達(dá)傳染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的構(gòu)建細(xì)胞和病毒BHK-21細(xì)胞(乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞ATCC CCL-10)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(Hyclone)的DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基)；NDV Lasota疫苗株AV1615(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC))。接種9-10日齡SPF雞胚尿囊腔擴(kuò)增并滴定雞胚半數(shù)感染量(EID50)后-70℃凍存?zhèn)溆?；雞抗NDV高免性血清由本研究室制備(Chu，H.P.，G.Snell，D.J.Alexander，和G.C.Schild.1982.Avian Pathol 11227-234)；SPF雞胚及SPF雞雛均由哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。IBDV超強(qiáng)毒株vvIBDV GX株購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所菌毒種保藏中心。
轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建基因組RNA轉(zhuǎn)錄載體pBTRT以低拷貝克隆載體pBR322(Invitrogen)為骨架并在EcoRI/salI位點(diǎn)插入T7啟動(dòng)子(T7promotor)、丁肝病毒核酶(Rib)和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(T7terminal)，由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建?？寺≡赥7啟動(dòng)子和核酶之間的DNA片段可以在T7RNA聚合酶的作用下得到轉(zhuǎn)錄，并且由于Rib的自身催化功能，可以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3′末端與克隆的DNA片斷精確一致。
插入IBDV的V2基因的重組NDV LaSota株基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建為建立NDV新城疫Lasota疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，必須首先構(gòu)建相應(yīng)基因組的全長(zhǎng)cDNA克隆，作為基因組負(fù)鏈RNA轉(zhuǎn)錄模板，為此構(gòu)建了覆蓋整個(gè)基因組的十個(gè)cDNA克隆片段，利用各個(gè)片斷間重疊部分的酶切位點(diǎn)，在低拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒pBTRT連接組裝獲得了15186nt的完整cDNA克隆，序列測(cè)定結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為AY845400，并將IBDV的V2基因(GenBank AY444873)克隆到P，M之間。在全長(zhǎng)cDNA片段5’末端前綴T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，在cDNA片斷后連有具有自我催化功能的肝炎δ核酶(GenBank X04451)和T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。構(gòu)建完成的質(zhì)粒命名為pBRN-FL-VP2。為避免Xba位點(diǎn)的甲基化，通過(guò)PCR基因組將基因組cDNA中F蛋白編碼區(qū)第6178位堿基由T同義突變?yōu)镃，并作為拯救病毒的分子標(biāo)記。與其他研究者一樣，我們同時(shí)在T7聚合酶啟動(dòng)子于基因組cDNA的5’末端引入兩個(gè)多余的G，這可能有助于副粘病毒反向遺傳操作的病毒拯救。具體如下
NDV Lasota疫苗株病毒雞胚接種尿囊液經(jīng)常規(guī)方法(動(dòng)物病毒學(xué)，第二版)提取基因組RNA；整個(gè)基因組分為末端部分重疊的10個(gè)片段(F1-F10)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，cDNA片段克隆至pBluescript(Clontech)SmaI位點(diǎn)并經(jīng)序列分析確證與病毒基因組RNA序列完全一致；序列測(cè)定結(jié)果已經(jīng)登錄GenBank，登錄號(hào)為AY845400。為引入特異的分子遺傳標(biāo)簽，選擇Lasota疫苗株基因組cDNA 6172bp處存在一甲基化的XbaI位點(diǎn)，序列為TCTAGATCA，利用PCR手段將其突變?yōu)門CTAGACCA，使其不再受甲基化酶識(shí)別，因而能夠被限制性內(nèi)切酶XbaI所識(shí)別；利用相鄰片段重疊部分存在的限制酶切位點(diǎn)連接成組裝完整的NDV基因組cDNA(圖1A)；另外，參照文獻(xiàn)[15]，SDS-蛋白酶-K法提出IBDV基因組，-70℃保存?zhèn)溆米鳛镽T-PCR模板。RT-PCR反轉(zhuǎn)錄體系為20μl。在500μl的EP管中依次加入如下成分，病毒RNA，IBDV的VP2基因上、下游引物，dNTP，水。65℃水浴5min；再向管中加入5×1st buffer 4μl，0.1mol/L DTT 2μl，RNase抑制劑(20U/μl)1μl，混勻后37℃水浴2min；加入M-MLV(鼠源反轉(zhuǎn)錄酶)(10U/μl)1μl，37℃水浴反應(yīng)50min，70℃水浴終止反應(yīng)15min。以RT-PCR擴(kuò)增的VP2基因ORF的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系中加入如下引物。上游引物5’gtttaaacttagaaaaaatacgggtagaacgccaccatgacgaacctgcaagat3’，下游引物5’gtttaaacgtcaccttagggcccgg3’。PCR反應(yīng)步驟95℃預(yù)變性10min，按94℃1min，53.8℃1min，72℃2min的順序，30個(gè)循環(huán)后，72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PmeI酶切后克隆到LaSota新城疫病毒株基因組P、M之間人工引入的PmeI位點(diǎn)，并在前裝上基因終止和基因起始序列(GE/GS)(TTAAGAAAAAA/T/ACGGGTAGAA)，并克隆在轉(zhuǎn)錄載體pBTRT上，構(gòu)建成含有IBDV VP2基因的新城疫LaSota弱毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBRN-FL-VP2(圖1B)；表達(dá)核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的開(kāi)放閱讀框架(ORF)cDNA分別緊接著克隆在pBluescriptII(+/-)質(zhì)粒T7啟動(dòng)子下游，分別構(gòu)成轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。
從重組全長(zhǎng)cDNA克隆救獲感染性NDV(病毒拯救)
為了從克隆的重組cDNA中拯救感染性重組NDV，首先以pBRN-FL-VP2及表達(dá)NDV NP、P、L蛋白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。NDV的融合蛋白F0必須裂解成F1和F2才具有感染性，對(duì)于Lasota弱毒株而言，BHK-21細(xì)胞不能分泌裂解F0蛋白所需的蛋白酶，因此在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)蛋白酶，所以此時(shí)應(yīng)換成無(wú)血清培養(yǎng)基并加入TPCK(Sigma)(1μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清接種于9-11日齡的SPF雞胚。4天后收獲雞胚尿囊液，血凝(HA)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，不同雞胚的HA價(jià)介于28-11；NDV免疫血清血凝抑制(HI)試驗(yàn)分析同樣呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。收獲病毒陽(yáng)性尿囊液作為救獲病毒rLasota-VP2的F1代。進(jìn)一步的RT-PCR及序列分析結(jié)果顯示，F(xiàn)1代救獲病毒基因組cDNA的6178位點(diǎn)堿基為C，而非原LaSota親本株的C，和預(yù)期完全相符(圖2)。結(jié)果表明，通過(guò)反遺傳操作技術(shù)，利用NDV LaSota疫苗株基因組cDNA克隆成功地救獲具有感染性的子代病毒rLasota-VP2。更具體地，實(shí)驗(yàn)步驟如下BHK-21細(xì)胞接種于35mm六孔板內(nèi)生長(zhǎng)達(dá)50-80％單層時(shí)人工感染表達(dá)T7聚合酶的重組痘病毒，轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒pBRN-FL-VP2、pBSNP、pBSP和pBSL分別以5μg、2.5μg、1.25μg 1.25μg，共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，采用CaPO4轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogene)，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后8-12小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克細(xì)胞2.5分鐘，加入完全DMEM過(guò)夜孵育，第二天換成無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入TPCK(1μg/ml)繼續(xù)孵育2-3天后，收獲培養(yǎng)物上清，0.22um孔徑濾器過(guò)濾后接種9-11天的SPF胚尿囊腔；接種后的SPF胚繼續(xù)培養(yǎng)，3-5天，取雞胚尿囊液50μl進(jìn)行按常規(guī)進(jìn)行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)(Thayer SG，Nersessian BN，Rivetz B，F(xiàn)letcher OJ.Comparison ofserological tests for antibodies against Newcastle disease virus and infectiousbronchitis virus using ImmunoComb solid-phase immunoassay，a commercialenzyme-linked immunosorbent assay，and the hemagglutination-inhibitionassay.Avian Dis.1987Jul-Sep；31(3)459-63.)。收獲HA及HI試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性尿囊液，-70℃凍存，并按常規(guī)方法分別于9-10日齡雞胚及雞胚成纖維細(xì)胞滴定每毫升EID50及PFU病毒含量(14)。救獲新城疫病毒命名為rLasota-VP2。
實(shí)施例2重組新城疫病毒rLasota-VP2表達(dá)抗原蛋白的免疫熒光分析NDV LaSota疫苗株能一過(guò)性感染體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為證明rLasota-VP2病毒在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及病毒抗原表達(dá)，將rLasota-VP2雞胚傳代F2代感染BHK-21細(xì)胞(3A & 3C)和未感染BHK-21細(xì)胞(3B& 3D)，分別以雞抗新城疫高免血清(3A & 3B)和雞抗IBDV高免血清(3C& 3D)為一抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示病毒感染細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(圖3A & 3C)，而SPF雞對(duì)照血清熒光染色則為陰性(圖3B & 3D)。
實(shí)施例3重組NDV表達(dá)IBDV VP2蛋白的Western-Blot鑒定取擴(kuò)增的rLaSota-VP2的BHK-21細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入1/10體積的PBS，懸起細(xì)胞，加入等體積的2×SDS裂解緩沖液沸水裂解10min后，12000g離心10min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE(Bio-Rad)；將蛋白電轉(zhuǎn)移(Bio-Rad)到尼龍膜上(Ameresco)，10％脫脂乳封閉過(guò)夜，PBST(0.05％Tween20)洗滌后加入1∶50 PBST稀釋的一抗(雞抗IBDV高免血清)。二抗為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗雞山羊抗鼠IgG(Sigma)，1∶2500倍PBST稀釋。DAB(二氨基聯(lián)苯膠，Sigma)顯色3～5分鐘后用去離子水終止反應(yīng)。結(jié)果如圖5，證明傳染性法氏囊病毒VP2抗原在重組新城疫病毒rLasota-VP2獲得有效表達(dá)。
實(shí)施例4rNDV在雞胚的生長(zhǎng)特性及致病特性為確定反向遺傳操作救獲rLaSota-VP2的雞胚生長(zhǎng)特性及其對(duì)雞胚的致病性，進(jìn)行表達(dá)IBDV超強(qiáng)毒Gx株VP2抗原的重組新城疫病毒活載體疫苗雞胚生長(zhǎng)動(dòng)力測(cè)定比較。將SPF雞胚傳代F2代次種子毒尿囊液以1×103EID50劑量接種10日齡SPF雞胚50枚。于不同時(shí)間點(diǎn)10枚雞胚，每雞胚分別收獲尿原液100μl，10倍連續(xù)梯度稀釋按常規(guī)進(jìn)行EID50滴定，結(jié)果顯示rLaSota-VP2雞胚生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)與野生型新城疫LaSota弱毒疫苗株相似。按照OIE標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定rLaSota-VP2腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為0.35，靜脈內(nèi)致病指數(shù)(IVPI)為0，雞胚平均致死時(shí)間(MDT)大于96小時(shí)。結(jié)果表明反向遺傳操作救獲病毒rLasota-VP2仍然保持NDV LaSota疫苗親本株在雞胚的高滴度生長(zhǎng)及低致死的生物學(xué)特性。
實(shí)施例5誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的免疫效果為測(cè)定反向遺傳操作救獲病毒rLasota-VP2作為弱毒疫苗對(duì)SPF雞雛的免疫原性，將rLasota-VP2經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑免疫7日齡SPF雛雞(哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，每羽2×106EID50劑量，共100ul體積；免疫后第1、2、3、4周分別采集翅靜脈血，進(jìn)行NDV特異HI抗體檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，rLasota-VP2重組病毒一次免疫雛雞后3周，即可誘導(dǎo)高水平的NDV特異HI抗體水平反應(yīng)。
表達(dá)IBDV超強(qiáng)毒Gx株VP2抗原重組新城疫病毒rLasota-VP2免疫1周齡SPF雛雞，免疫后3周可檢測(cè)到顯著的IBDV病毒VP2抗原特異的抗體免疫反應(yīng)。(結(jié)果見(jiàn)表1)表1.表達(dá)IBDV超強(qiáng)毒Gx株VP2抗原重組新城疫病毒rLasota-VP2免疫1周齡SPF雛雞攻毒前后IBDV特異抗體免疫反應(yīng)

*重組新城疫病毒rLasota-VP2經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑免疫7日齡雛雞，每羽共100ul體積；免疫后21天采用傳染性法氏囊病毒超強(qiáng)毒GX株4×103ELD50經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼途徑感染進(jìn)行攻擊；**免疫后19天(26日齡)采集血清進(jìn)行NDV特異HI抗體，包括基于原核表達(dá)VP2抗原的ELISA抗體檢測(cè)及IBDV常規(guī)血清瓊脂擴(kuò)散(AGP)抗體檢測(cè)；攻毒后第7天存活雞進(jìn)行基于原核表達(dá)VP2抗原的ELISA抗體檢測(cè)及常規(guī)血清AGP抗體檢測(cè)；a/b，差異顯著最后，將rLasota-VP2重組病毒對(duì)1周齡SPF雛雞免疫，評(píng)估其對(duì)新城疫強(qiáng)毒致死性攻擊和IBDV超強(qiáng)毒致死性攻擊的免疫保護(hù)作用。結(jié)果分別如表2和表3，結(jié)果表明，rLasota-VP2重組病毒疫苗免疫雛雞對(duì)新城疫強(qiáng)毒株和IBDV超強(qiáng)毒病毒致死攻擊形成100％完全免疫保護(hù)，不發(fā)病、不死亡，效果非常顯著。
表2.表達(dá)IBDV超強(qiáng)毒Gx株VP2抗原重組新城疫病毒rLasota-VP2免疫1周齡SPF雛雞對(duì)新城疫強(qiáng)毒致死攻擊的免疫保護(hù)

a.重組新城疫病毒rLasota-VP2經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑免疫7日齡雛雞，每羽2×106EID50劑量共100ul體積；b.免疫后21天(28日齡)采用NDV強(qiáng)毒F48E9株(中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供)1×104ELD50劑量經(jīng)肌肉注射途徑攻擊，持續(xù)觀察14天。
表3.表達(dá)IBDV超強(qiáng)毒Gx株VP2抗原重組新城疫病毒rLasota-VP2免疫1周齡SPF雛雞對(duì)IBDV超強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)

重組新城疫病毒rLasota-VP2經(jīng)滴鼻加點(diǎn)眼途徑免疫7日齡雛雞，每羽2×106EID50劑量，共100ul體積；免疫后21天(28日齡)采用IBDV超強(qiáng)毒Gx株經(jīng)鼻腔感染途徑攻擊，劑量均為每羽4000ELD50，攻毒后持續(xù)觀察7天；a.3d為攻毒后觀察3天撲殺組；b.7d為攻毒后觀察7天撲殺組；c.體重根據(jù)7d組的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；d.囊重指數(shù)試驗(yàn)雞囊重比與同齡健康對(duì)照雞囊重比的比值e.3d組含病死及撲殺雞，“+”數(shù)目與囊淋巴濾泡炎癥損傷程度成正比；7d組包含自然死亡及人工撲殺組，“+”數(shù)目與囊淋巴濾泡萎縮程度成正比；f.發(fā)病率及死亡率均根據(jù)7d組統(tǒng)計(jì)結(jié)果；A/B，差異極顯著新城疫病毒(NDV)為不分節(jié)單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)與功能背景清楚，遺傳相對(duì)穩(wěn)定，重組NDV中插入的外源基因在細(xì)胞或雞胚經(jīng)高代次傳代后仍可保持穩(wěn)定表達(dá)，非常適合作為表達(dá)或疫苗載體。NDV弱毒疫苗可通過(guò)飲水、噴霧、滴鼻或點(diǎn)眼給苗，使用方便，成本極為低廉，以NDV作為禽流感疫苗活載體構(gòu)建的二聯(lián)弱毒疫苗，具十分巨大的有經(jīng)濟(jì)意義。
本發(fā)明以新城疫病毒(NDV)的RGS為平臺(tái)，以IBDV的保護(hù)性免疫原VP2蛋白為目的基因，在5’端加上NDV基因組P基因相應(yīng)轉(zhuǎn)錄終止(GE)序列和M基因轉(zhuǎn)錄起始(GS)序列，插入基因組內(nèi)P基因和M基因間非編碼區(qū)，構(gòu)建了表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2保護(hù)性免疫原基因的重組新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株rLaSota-VP2，作為預(yù)防傳染性法氏囊病的雙價(jià)弱毒疫苗。免疫熒光及Western-blot檢測(cè)表明VP2抗原在重組病毒獲得正確、穩(wěn)定的高效表達(dá)。雞胚生長(zhǎng)動(dòng)力試驗(yàn)及腦內(nèi)致病指數(shù)測(cè)定證明rLaSota-VP2保持了新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株雞胚高滴度生長(zhǎng)及低致病力特性。新城疫強(qiáng)毒致死性攻擊和IBDV超強(qiáng)毒致死性攻擊實(shí)驗(yàn)證明rLasota-VP2重組病毒對(duì)新城疫強(qiáng)毒株和IBDV超強(qiáng)毒病毒致死攻擊形成有效的免疫保護(hù)。
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1.一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-VP2。
4.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，該方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入傳染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組cDNA序列；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)收獲上清液，過(guò)濾后繼續(xù)敏感細(xì)胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中將IBDV的VP2基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因組P，M之間的人工引入的PmeI位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中包括在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的基因組cDNA序列位于T7啟動(dòng)子之后，而在編碼自我剪切的核酸酶的序列和T7轉(zhuǎn)錄終止子之前，構(gòu)成基因組cDNA轉(zhuǎn)錄模板。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎病毒核酶(Rib)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中包括在所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒中的編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7啟動(dòng)子之后。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒是pBRN-FLVP2。
11.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是質(zhì)粒pBSNP，pBSP和pBSL。
12.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述宿主細(xì)胞是BHK-21。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株在制備預(yù)防傳染性法氏囊病毒導(dǎo)致的疾病的疫苗中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-VP2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)傳染性法氏囊病毒(Infectiousbursal disease virus，IBDV)的VP2基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota－VP2。本發(fā)明還公開(kāi)了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗株在制備預(yù)防新城疫病毒(Newcastal disease virus，NDV)和IBDV導(dǎo)致的疾病的疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/33GK1880448SQ20061000169
公開(kāi)日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者步志高, 王笑梅, 陳化蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所