專(zhuān)利名稱(chēng)：基于復(fù)制型痘苗病毒載體的sars疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病毒免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及基于復(fù)制型痘苗病毒載體的針對(duì)SARS-CoV的疫苗及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
自2002年11月在中國(guó)廣東省發(fā)現(xiàn)第一例傳染性非典型肺炎病例以來(lái)，該傳染病曾一度在全世界范圍內(nèi)廣泛流行。世界衛(wèi)生組織就此于2003年3月向全球發(fā)出警告，并將其命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acuterespiratory syndrome，SARS)。SARS主要通過(guò)呼吸道傳播，傳染性強(qiáng)，死亡率高達(dá)5％-15％，嚴(yán)重危害了人民的生命健康安全。世界衛(wèi)生組織于2003年4月16日宣布，引起SARS的病原體屬于冠狀病毒的一個(gè)新變種，并被命名為“SARS-CoV”(Peiris J S M，Lai S T，Poon M L L，et al.Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome.TheLancet.2003，April 8)。經(jīng)過(guò)包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家科學(xué)家的共同努力，SARS-CoV全基因組的測(cè)序工作已經(jīng)完成，序列分析顯示SARS-CoV基因組含有5個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，分別編碼DNA聚合酶蛋白、突起蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和核殼蛋白(NC蛋白)。
突起蛋白是冠狀病毒主要的細(xì)胞受體結(jié)合蛋白，其氨基酸的變化能夠顯著地影響病毒的毒力。另外對(duì)SARS-CoV的突起蛋白進(jìn)行功能部位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白中可能存在多個(gè)抗原決定簇，并且目前世界上流行的SARS-CoV的突起蛋白具有較高的保守性，可以作為疫苗研究的重要靶點(diǎn)(Walgate R.SARS vaccine raceUS and European groups movingforward，but WHO would rather put SARS“back in the box”，Available May2 at http://www.Biomedcentral.Com/news/20030502/03)。
核殼蛋白是冠狀病毒中另一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，它位于病毒顆粒的核心部分，對(duì)于病毒顆粒的準(zhǔn)確組裝有著重要意義。中國(guó)研究人員從SARS病人恢復(fù)期血液中獲得淋巴細(xì)胞，通過(guò)基因工程手段得到的人源化Fab抗體能夠與SARS-CoV核殼蛋白特異性結(jié)合，這說(shuō)明核殼蛋白也是SARS-CoV的重要的抗原位點(diǎn)(杜潤(rùn)蕾，于建石，梁米芳等.人源抗嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒基因工程抗體的初步研究.病毒學(xué)報(bào).2003，19(2)104-108)。
盡管SARS的疫情在全世界范圍內(nèi)已得到有效控制，但仍不排除其重新爆發(fā)的可能性?？筍ARS-CoV疫苗是預(yù)防SARS流行的最有效的一條途徑。目前中國(guó)研發(fā)的SARS全病毒滅活疫苗已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，該疫苗攜帶了病毒所有的抗原，免疫原性好。但是從SARS病理學(xué)來(lái)看，SARS全病毒滅活疫苗存在導(dǎo)致肌體自體免疫反應(yīng)的潛在危險(xiǎn)性；另外生產(chǎn)該類(lèi)疫苗的條件要求高，生物安全性方面也存在隱患。因此研發(fā)新一代安全有效的SARS基因工程疫苗也是當(dāng)務(wù)之急。
目前可供選擇的疫苗類(lèi)型包括下列幾種傳統(tǒng)疫苗(滅活疫苗和減毒活疫苗)、合成肽和蛋白亞單位疫苗、DNA疫苗以及活載體疫苗。與其它類(lèi)型疫苗相比，活載體疫苗的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在(1)能主動(dòng)感染靶組織或細(xì)胞，提高了外源基因進(jìn)入細(xì)胞的效率；(2)載體自身有佐劑效應(yīng)，能誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生；(3)多數(shù)能誘導(dǎo)長(zhǎng)期的免疫應(yīng)答。在針對(duì)SARS的活載體疫苗領(lǐng)域，目前使用的是非復(fù)制型載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供針對(duì)SARS-CoV感染的新的疫苗和免疫接種方法，以便為上面提到的現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題提供一種解決途徑。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種基于復(fù)制型痘苗病毒的針對(duì)SARS-CoV的疫苗，其包含復(fù)制型痘苗病毒作為載體，所述復(fù)制型痘苗病毒基因組的胸苷激酶(TK)區(qū)插入編碼SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述復(fù)制型痘苗病毒是痘苗病毒天壇株，且優(yōu)選地所述疫苗不含有選擇標(biāo)記基因。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，插入所述痘苗病毒天壇株的TK區(qū)中的編碼SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白的多核苷酸經(jīng)密碼子優(yōu)化改造，適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效率表達(dá)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，插入所述痘苗病毒天壇株的TK區(qū)中的所述編碼SARS-CoV的核殼蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列和/或所述編碼SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的疫苗可進(jìn)一步包含藥用可接受的合適的佐劑和/或載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，其包含一種載體，所述一種載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼SARS-CoV的核殼蛋白的多核苷酸和/或編碼SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸。在本發(fā)明的DNA疫苗的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述編碼SARS-CoV的核殼蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而所述編碼SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種針對(duì)SARS-CoV的免疫接種方法，其包括給個(gè)體施用免疫有效量的本發(fā)明的以復(fù)制型痘苗病毒、特別是痘苗病毒天壇株作為載體的針對(duì)SARS-CoV的疫苗。本發(fā)明的免疫接種方法還可包括在施用所述疫苗之前給個(gè)體施用一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，例如在此所述的本發(fā)明的DNA疫苗。
本發(fā)明還提供了一種免疫接種試劑盒，其包括一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，如在此所述的本發(fā)明的DNA疫苗，其還包括本發(fā)明的以復(fù)制型痘苗病毒作為載體的針對(duì)SARS-CoV的疫苗。任選地，所述試劑盒進(jìn)一步包括指示用所述一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗進(jìn)行初次免疫，然后用本發(fā)明的以復(fù)制型痘苗病毒作為載體的針對(duì)SARS-CoV的疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫的接種程序說(shuō)明書(shū)。
此外，本發(fā)明還提供了一種痘苗病毒的通用轉(zhuǎn)移載體pVTT1.0，其保藏號(hào)為CGMCC No.1458。


圖1顯示痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體pVTT1.0的構(gòu)建路線。
圖2顯示轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT-NS的構(gòu)建路線。
圖3顯示痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體pVTT1.0酶切分析鑒定結(jié)果。泳道M顯示為分子量標(biāo)記DL15000的DNA Marker(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；泳道1、2、3分別顯示痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體pVTT1.0經(jīng)KpnI、NdeI或EcoRV酶切的結(jié)果。
圖4PCR擴(kuò)增SARS-CoV核殼蛋白的編碼序列以及PCR融合擴(kuò)增啟動(dòng)子P E/L+P7.5和SARS-CoV核殼蛋白的編碼序列。泳道M為分子量標(biāo)記DL2000的DNA Marker(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；泳道1顯示PCR擴(kuò)增的SARS-CoV核殼蛋白的編碼序列的條帶；泳道2顯示PCR融合擴(kuò)增啟動(dòng)子P E/L+P7.5和SARS-CoV核殼蛋白的編碼序列的條帶。
圖5顯示T-NC質(zhì)粒酶切分析鑒定結(jié)果。泳道1顯示T-NC質(zhì)粒經(jīng)Spe I和Not I雙酶切結(jié)果；泳道2顯示T-NC質(zhì)粒經(jīng)Sal I單酶切結(jié)果。
圖6顯示T-NC+P+S質(zhì)粒酶切分析鑒定結(jié)果。泳道M為分子量標(biāo)記DL15000的DNA Marker(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；泳道1-4顯示挑取的T-NC+P+S質(zhì)粒(1-4號(hào))經(jīng)Sac I和Not I雙酶切結(jié)果。
圖7顯示痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體pVTT1.0以及痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pVTT-NS酶切分析鑒定結(jié)果。泳道M顯示為分子量標(biāo)記DL15000的DNAMarker(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；泳道1顯示痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體pVTT1.0經(jīng)Sac II和Spe I雙酶切結(jié)果；泳道2顯示痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pVTT-NS經(jīng)Sac II和Spe I雙酶切結(jié)果。
圖8顯示從第五代rVTT-NS傳代后隨機(jī)挑取9個(gè)第六代白病毒克隆，提取病毒DNA模板，以NC引物1、NC引物2為引物，擴(kuò)增SARS-CoV核殼蛋白編碼序列的結(jié)果檢驗(yàn)。其中泳道M顯示為分子量標(biāo)記DL15000的DNA Marker(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；泳道N顯示野生型病毒陰性對(duì)照的PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道1-9顯示隨機(jī)挑取9個(gè)第六代白病毒克隆基因組PCR擴(kuò)增SARS-CoV的NC蛋白編碼序列(1.2 Kb)結(jié)果。
圖9顯示從第五代rVTT-NS傳代后隨機(jī)挑取9個(gè)第六代白病毒克隆，提取病毒DNA模板，以S引物1、S引物2為引物，擴(kuò)增SARS-CoV的S蛋白編碼序列的結(jié)果檢驗(yàn)。其中泳道M顯示為分子量標(biāo)記DL15000的DNA Marker(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；泳道P顯示以質(zhì)粒pSK-S為模板的陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果；泳道N顯示野生型病毒陰性對(duì)照的PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道1-9顯示隨機(jī)挑取9個(gè)第六代白病毒克隆基因組PCR擴(kuò)增SARS-CoV的S蛋白編碼序列(3.6 Kb)結(jié)果。
圖10顯示各代rVTT-NS感染CEF細(xì)胞，48小時(shí)后收獲細(xì)胞和上清，以人多抗血清(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制中心提供)進(jìn)行Western Blot分析結(jié)果。泳道N顯示野生型病毒陰性對(duì)照的免疫雜交結(jié)果；泳道M顯示預(yù)染蛋白Marker；泳道1、3、5、6分別顯示第1、3、5、6代次的rVTT-NS感染CEF細(xì)胞的免疫雜交條帶。
圖11顯示ELISPOT檢測(cè)體外N抗原表位肽(A)和S抗原表位肽(B)刺激后分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。分別采用NC蛋白刺激肽和S蛋白刺激肽對(duì)每孔1×106個(gè)小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行刺激30小時(shí)，檢測(cè)分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)。
圖12表示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血清SARS-CoV的NC蛋白(A)和S蛋白(B)特異性抗體IgG的滴度水平。
圖13SARS-CoV DNA疫苗pDRVISV1.0-S和pDRVISV1.0-N結(jié)構(gòu)示意圖。
保藏轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT 1.0，于2005年9月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCC No.1458。
質(zhì)粒pSC65，于2004年2月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)是CGMCC No.1097。
質(zhì)粒pSK-N，于2005年9月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)是CGMCC No.1459。
質(zhì)粒pSK-S，于2005年9月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)是CGMCC No.1457。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的針對(duì)SARS-CoV的疫苗是基于復(fù)制型痘苗病毒載體而構(gòu)建的，這不同于目前常規(guī)使用的非復(fù)制型痘苗病毒載體，如MVA(Modifiedvirus Ankara)、NYVAC(New York Vaccinia)和ALVAC(avipoxviruscanarypox)(Paoletti E.Applications of poxvirus vectors to vaccinationAnupdate.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.93，pp.11349-11353)。在本發(fā)明的疫苗中，所述復(fù)制型痘苗病毒的TK區(qū)插入了編碼SARS-CoV的核殼蛋白(NS)和突起蛋白(S)的多核苷酸，經(jīng)施用后能夠引發(fā)個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)SARS-CoV的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
術(shù)語(yǔ)“復(fù)制型”是指可以在人體內(nèi)復(fù)制的痘苗病毒載體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述復(fù)制型痘苗病毒載體是痘苗病毒天壇株(vaccine virus TianTan strain，VTT)。痘苗病毒天壇株曾為中國(guó)消滅天花做出了巨大貢獻(xiàn)，其在活載體疫苗研究中的應(yīng)用也十分活躍，具有安全性好、接種方便，不需佐劑等優(yōu)點(diǎn)。
優(yōu)選地，可對(duì)插入復(fù)制型痘苗病毒基因組TK區(qū)中的編碼SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白的多核苷酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造。術(shù)語(yǔ)“密碼子優(yōu)化改造”，是指根據(jù)人類(lèi)遺傳密碼子偏愛(ài)性表中的遺傳密碼子使用頻率，選擇人類(lèi)最偏愛(ài)的遺傳密碼子，將一種多肽的氨基酸序列反向翻譯回核苷酸序列，以使得所述核苷酸序列適合在人類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)。在本發(fā)明中，通過(guò)密碼子優(yōu)化策略，根據(jù)已知的SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白的氨基酸序列(參照Genebank公布的SARS-CoV香港株HKU-39849分離株氨基酸序列)，通過(guò)反向翻譯可得到經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化改造的編碼所述核殼蛋白和突起蛋白的核苷酸序列?？蓪?duì)獲得的核苷酸序列進(jìn)行小的調(diào)整和修飾，利用遺傳密碼子簡(jiǎn)并性消除多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，并消除潛在的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)等不利于基因合成的序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述編碼SARS-CoV的核殼蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而所述編碼SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明中，編碼SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白的多核苷酸通過(guò)合適的方法例如同源重組而被插入至痘苗病毒基因組中的胸苷激酶(TK)基因中，以形成攜帶目的基因的重組的復(fù)制型痘苗病毒。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗，即所述重組的復(fù)制型痘苗病毒，不含有選擇標(biāo)記基因。
為此，本發(fā)明提供了一種痘苗病毒的通用轉(zhuǎn)移載體，以便將目的基因重組到痘苗病毒基因組DNA的TK區(qū)中。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體是含有neo基因和lacZ基因雙重篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT 1.0(CGMCC No.1458)。該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體含有以下元件①三個(gè)篩選標(biāo)記Amp抗性基因、lacZ基因和neo基因。由p7.5啟動(dòng)子啟動(dòng)的lacZ基因用于重組痘苗病毒的藍(lán)白斑篩選，由PE6啟動(dòng)子啟動(dòng)的neo基因用于既帶有篩選標(biāo)記又帶有目的基因的重組痘苗病毒的純化(在G418的作用下痘苗病毒野毒株的增殖將被抑制)，為了使neo基因能夠更好的發(fā)揮作用，neo基因的尾部帶有200bp的poly(A)序列。②同源臂tkL和tkR序列tkL和tkR是痘苗病毒胸苷激酶(TK)的部分片段，是痘苗病毒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒發(fā)生分子間同源重組的同源序列。③lacZ’序列這一段200bp的序列與lacZ基因尾部的200bp的序列完全同源，使既帶有篩選標(biāo)記又帶有目的基因的重組痘苗病毒發(fā)生分子內(nèi)同源重組，從而丟掉篩選標(biāo)記。④痘苗病毒的早晚期啟動(dòng)子pE/L。⑤多克隆位點(diǎn)，位于啟動(dòng)子pE/L的下游。
采用本發(fā)明的通用轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0，可將目的基因重組到痘苗病毒基因組DNA的TK區(qū)中，并使得痘苗病毒基因組中不含有選擇標(biāo)記基因。因此，本發(fā)明還提供了用于構(gòu)建基于復(fù)制型痘苗病毒的針對(duì)SARS-CoV的疫苗的方法，所述方法包括使用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT 1.0(CGMCC No.1458)將編碼SARS-CoV核殼蛋白(NS)和突起蛋白(S)的多核苷酸置于pVTT 1.0的啟動(dòng)子pE/L下，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVTT-NS；pVTT-NS在雞胚細(xì)胞內(nèi)與痘苗病毒天壇株發(fā)生同源重組，使SARS-CoV的目的基因與含neo基因和lacZ基因的雙重篩選標(biāo)記一同重組到痘苗病毒基因組DNA的TK區(qū)中；在抗生素G418選擇壓力下，用加有X-gal和中性紅的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪斑，挑取既含有目的基因又含篩選標(biāo)記的藍(lán)色重組痘苗病毒，共經(jīng)過(guò)三輪單斑純化；然后在無(wú)G418壓力選擇下，藍(lán)色重組痘苗病毒自身會(huì)因?yàn)檗D(zhuǎn)移質(zhì)粒中一小段約200bp的lacZ’片段與完整的lacZ基因發(fā)生分子內(nèi)的同源重組，從而丟失neo基因和lacZ基因，由此得到只含有SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白的編碼序列的重組痘苗病毒天壇株。
本發(fā)明的疫苗可進(jìn)一步包含藥用可接受的合適的佐劑、載體和/或賦形劑，合適的佐劑、載體和賦形劑是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明還提供了針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，所述DNA疫苗包含一種載體，所述一種載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼SARS-CoV的核殼蛋白的多核苷酸和/或編碼SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸。用于構(gòu)建DNA疫苗的載體是本領(lǐng)域已知的，例如真核表達(dá)載體pcDNA3.1。在獲得了目的基因之后，可通過(guò)已知的方法將目的基因的序列連接到合適的載體中構(gòu)建DNA疫苗。在本發(fā)明的DNA疫苗的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述編碼SARS-CoV的核殼蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而所述編碼SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種針對(duì)SARS-CoV的免疫接種方法，其包括給個(gè)體施用免疫有效量的本發(fā)明的基于復(fù)制型痘苗病毒、特別是基于痘苗病毒天壇株的針對(duì)SARS-CoV的疫苗。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指足以刺激個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)病原體的細(xì)胞免疫和/或體液免疫的本發(fā)明的疫苗的量，具體的施用量以及施用速度和施用時(shí)間將依賴于個(gè)體的狀況，并可由醫(yī)生根據(jù)情況做出判斷。本發(fā)明的免疫接種方法還可包括在施用所述疫苗之前給個(gè)體施用一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，例如在此所述的本發(fā)明的DNA疫苗。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)先采用含有SARS-CoV核殼蛋白和/或突起蛋白的編碼序列的DNA疫苗進(jìn)行初始免疫，再用SARS-CoV天壇株重組痘苗病毒疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫的免疫方案(即Prime-boost策略)，能夠成功誘導(dǎo)肌體產(chǎn)生高水平的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)及高滴度中和抗體。
本發(fā)明還提供了一種免疫接種試劑盒，其包括一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，如在此所述的本發(fā)明的DNA疫苗，其還包括本發(fā)明的基于復(fù)制型痘苗病毒的針對(duì)SARS-CoV的疫苗。任選地，所述試劑盒進(jìn)一步包括指示用所述一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗進(jìn)行初次免疫，然后用本發(fā)明的基于復(fù)制型痘苗病毒的針對(duì)SARS-CoV的疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫的接種程序說(shuō)明書(shū)。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例實(shí)施例1痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0的構(gòu)建
1.重組質(zhì)粒pSC-neo的構(gòu)建質(zhì)粒pIRESneo(購(gòu)自Clontech公司)先用XhoI酶切，再用SmaI酶切(反應(yīng)溫度為25℃)，Klenow酶補(bǔ)平，回收1.2kb的目的片段neo-polyA；過(guò)渡載體質(zhì)粒pSC65(保藏號(hào)CGMCC No.1 097)用BglII酶切，Klenow酶補(bǔ)平，去磷酸化酶(CIAP)處理，回收載體；二者16℃連接4h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。挑取多個(gè)單菌落，小量提取質(zhì)粒，用XbaI和PstI鑒定，正確重組克隆命名為pSC-neo。
2.人工合成痘苗病毒載體早期啟動(dòng)子PE6和lacZ融合片段。
采用重疊PCR(Overlaping PCR)的方法合成基因。首先把序列PE6和lacZ融合多核苷酸片段的正鏈和負(fù)鏈分別列出，然后根據(jù)基因長(zhǎng)度把正鏈和負(fù)鏈序列分割成長(zhǎng)度為50bp的寡核苷酸(兩條鏈最5’端的一條長(zhǎng)度為25bp左右)，除兩端的序列外，每條正鏈和負(fù)鏈序列都與兩條互補(bǔ)鏈的寡核苷酸有25bp左右的互補(bǔ)。8條寡核苷酸都與同樣數(shù)目的互補(bǔ)寡核苷酸混合成一個(gè)退火體系，在PCR管中先升溫再慢慢退火。以退火產(chǎn)物為模板，以配對(duì)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到429bp的PE6和lacZ融合多核苷酸片段。合成的痘苗載體早期啟動(dòng)子PE6和lacZ融合片段連接到T-easy通用測(cè)序載體，得到質(zhì)粒pT-lacZ’-PE6，測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期設(shè)計(jì)(SEQ ID NO9)。
3.獲得痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0。
如上制備的質(zhì)粒pT-lacZ’-PE6經(jīng)SmaI+HindIII消化，回收0.4kb的lacZ’-PE6片段；連接到質(zhì)粒pSC-neo，得到痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1)。經(jīng)KpnI、NdeI和EcoRV鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3。
實(shí)施例2SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白編碼序列的密碼子優(yōu)化以及構(gòu)建DNA疫苗
1.遺傳密碼子優(yōu)化。根據(jù)人類(lèi)遺傳密碼子偏愛(ài)性表中的遺傳密碼子使用頻率，選擇最偏愛(ài)遺傳密碼子，根據(jù)SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白的氨基酸序列(參照Genebank公布的SARS-CoV香港株HKU-39849分離株氨基酸序列)，及其反向翻譯回核苷酸序列。
2.基因序列修飾和調(diào)整。小的調(diào)整和修飾，利用遺傳密碼子簡(jiǎn)并性消除多余的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，消除潛在的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)等不利于基因合成的序列。
3.人工合成目的基因。采用重疊PCR的方法合成基因。首先把核殼蛋白和突起蛋白基因序列正鏈和負(fù)鏈分別列出，然后根據(jù)基因長(zhǎng)度把正鏈和負(fù)鏈序列分割成長(zhǎng)度為50bp的寡核苷酸(兩條鏈最5’端的一條長(zhǎng)度為25bp左右)，除兩端的序列外，每條正鏈和負(fù)鏈序列都與兩條互補(bǔ)鏈的寡核苷酸有25bp左右的互補(bǔ)。每10條左右的寡核苷酸都與同樣數(shù)目的互補(bǔ)寡核苷酸混合成一個(gè)退火體系，在PCR管中先升溫再慢慢退火。以退火產(chǎn)物為模板，以配對(duì)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到500bp左右的基因片段。多個(gè)重疊的片段先混合，然后升溫、退火，以退火體系為模板，以兩端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到更長(zhǎng)的基因片段。超過(guò)1Kb以上的片段通過(guò)預(yù)先設(shè)定的酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR拼接可得到全長(zhǎng)的基因序列。
4.將合成的編碼SARS-CoV的核殼蛋白(N)和突起蛋白(S)的目的基因連接到pSK通用測(cè)序載體，測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期設(shè)計(jì)(經(jīng)密碼子優(yōu)化的SARS-CoV的N和S目的基因序列分別示于SEQ ID NO1和SEQ IDNO2)。得到質(zhì)粒pSK-S，于2005年9月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)是CGMCC No.1457。質(zhì)粒pSK-N，于2005年9月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)是CGMCC No.1459。
然后SmaI+SalI雙酶切質(zhì)粒pSK-S和pSK-N，將得到的編碼SARS-CoV的核殼蛋白(NC)和突起蛋白(S)的多核苷酸連接到SmaI+SalI雙酶切處理的DNA疫苗載體pDRVISV1.0(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200410028280.3)中，得到SARS-CoV的DNA疫苗pDRVISV1.0-S和pDRVISV1.0-N(圖13)。
實(shí)施例3目的基因表達(dá)元件及痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建1.PCR擴(kuò)增融合啟動(dòng)子P E/L+P7.5序列設(shè)計(jì)引物P7.5引物15’-GAAGATCTGTCGACTTCGAGCTTATTT-3’(SEQ ID NO3)；PE/L引物25’-GAGAATTCGTTTAAACCGATGC-3’(SEQ ID NO4)pE/L+p7.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下質(zhì)粒pSC65(質(zhì)粒pSC65的保藏號(hào)是CGMCC No.1097。)1μl，正、反向引物(P 7.5引物1、PE/L引物2)各1μl，10×Pyrobest緩沖液5μl，dNTP混合物(各2.5mM)5μl，Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml)0.5μl，ddH2O37.5μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2 min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃。
pE/L+p7.5PCR擴(kuò)增反應(yīng)延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.ACycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收。
2.PCR擴(kuò)增SARS-CoV的核殼蛋白(NC)編碼序列設(shè)計(jì)引物NC引物15’-CATCGGTTTAAACGAATTCTCACCATGAGCGATAATGGCCC-3’(SEQID NO5)；NC引物25’CCGGATCCTTATCAGGCCTGTGTAGAATC-3’(SEQ ID NO6)SARS-CoV的NC基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下質(zhì)粒pSK-N(質(zhì)粒pSK-N的保藏號(hào)是CGMCC No.1459)1μl，正、反向引物(NC引物1、NC引物2)各1μl，10×Pyrobest緩沖液5μl，dNTP混合物(各2.5mM)5μl，Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml)0.5μl，ddH2O 37.5μl。
PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 7min；4℃。
NC PCR擴(kuò)增反應(yīng)延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收(核殼蛋白編碼序列見(jiàn)SEQ ID NO1)。
3.PCR融合擴(kuò)增啟動(dòng)子PE/L+P7.5和SARS-CoV的核殼蛋白編碼序列反應(yīng)體系如下pE/L+p7.5 PCR反應(yīng)回收模板5μl，SARS-CoV的核殼蛋白編碼基因PCR反應(yīng)回收模板5μl，正、反向引物(P 7.5引物1、NC引物2)各1μl，10×Pyrobest緩沖液5μl，dNTP混合物(各2.5mM)5μl，PyrobestDNA聚合酶(5U/ml)0.5μl，ddH2O 37.5μl。
PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃。
P E/L+P7.5和SARS-CoV的核殼蛋白編碼序列融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收，結(jié)果見(jiàn)圖4。產(chǎn)物連接Promega公司的T-easy通用載體得到T-NC質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果正確。用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見(jiàn)圖5。
4.SARS-CoV的S、NC基因表達(dá)元件的獲得采用SalI和SacI雙酶切連接人工合成SARS-CoV的突起蛋白編碼序列(SEQ ID NO2)的pSK-S(質(zhì)粒pSK-S的保藏號(hào)是CGMCC No.1457)載體，將酶切得到的SARS-CoV的突起蛋白編碼序列連接到SalI和SacI雙酶切處理的T-NC質(zhì)粒中，獲得帶有SARS-CoV的S、NC基因表達(dá)元件的質(zhì)粒T-NC+P+S(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2)。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見(jiàn)圖6。
5.SARS-CoV的S、NC基因痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVTT-NS的構(gòu)建將攜帶目的基因表達(dá)元件的質(zhì)粒T-NC+P+S用SpeI酶切補(bǔ)平以及SacII酶切。采用Omega公司的膠回收試劑盒回收SARS-CoV的S、NC基因表達(dá)元件的酶切片段，然后連接到SmaI和SacII雙酶切處理的痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0中，得到攜帶SARS-CoV的S、NC基因表達(dá)元件的痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVTT-NS(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2)。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見(jiàn)圖9。
實(shí)施例4含有編碼SARS-CoV的核殼蛋白和突起蛋白的核苷酸序列的天壇株重組痘苗病毒疫苗rVTT-NS的構(gòu)建和篩選痘苗病毒天壇株以0.1～0.01pfu/細(xì)胞病毒量感染80％成片雞胚細(xì)胞CEF，細(xì)胞吸附1～1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)(INVITROGEN公司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒pVTT-NS轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞中，使SARS-CoV的S、NC基因表達(dá)元件與neo基因和lacZ基因雙重篩選標(biāo)記同源重組到痘苗病毒基因組DNA的TK區(qū)序列中。前三輪重組痘苗病毒挑選是在400ug/ml G 418加壓篩選后，用加有X-gal和中性紅的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪斑，這樣就可以挑取既含目的基因又含篩選標(biāo)記的藍(lán)色重組痘苗病毒(未發(fā)生重組的野毒株因G418的存在而被抑制生長(zhǎng))。接著在無(wú)抗生素G418壓力選擇下，藍(lán)色重組痘苗病毒自身會(huì)因?yàn)檗D(zhuǎn)移質(zhì)粒的SARS-CoV的S、NC基因表達(dá)元件上游一小段約200bp的lacZ’片段與完整的lacZ基因發(fā)生分子內(nèi)的同源重組，從而丟失neo基因和lacZ基因而得到了只含SARS-CoV的S、NC基因表達(dá)元件的重組痘苗病毒，用加有X-gal和中性紅的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪斑，就能挑取只含目的基因的白色重組病毒。初篩得到的白斑病毒再經(jīng)過(guò)五輪單斑純化，可得到單一克隆的含有SARS-CoV的S、NC基因表達(dá)元件的重組痘苗病毒的疫苗rVTT-NS。
實(shí)施例5PCR、Western blot檢測(cè)rVTT-NS傳代穩(wěn)定性rVTT-NS往下傳代后隨機(jī)挑取9個(gè)第六代白病毒，提取病毒DNA模板(杭州維特潔生物技術(shù)公司提取病毒基因組試劑盒)，分別以NC引物1，NC引物2擴(kuò)增NC目的基因(引物序列和方法參照實(shí)施例3)；以S引物15’-CTCTACGTAGCGGCCGCTAACCATGTTTATCTTTCTGCTG-3’(SEQID NO7)；和S引物25’-TCCCCCGGGTTATCAGGTGTAG-3’(SEQ ID NO8)為引物擴(kuò)增S目的基因，反應(yīng)體系如下rVTT-NS DNA 5μl；正、反向引物(S引物1、S引物2)各1μl；10×Pyrobest緩沖液5μl；dNTP混合物(各2.5mM)5μl；LA DNA聚合酶(5U/ml)0.5μl；ddH2O 32.5μl。
PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，58℃30s，72℃3min，共30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃。
瓊脂糖凝膠電泳顯示，隨機(jī)挑取的病毒基因組中都擴(kuò)增出陽(yáng)性目的條帶，NC基因?yàn)?.2kb；S基因?yàn)?.6kb。如圖6和7所示。
第五代rVTT-NS感染CEF細(xì)胞，48小時(shí)后收獲細(xì)胞和上清，以人多抗血清(首都兒科研究所提供)進(jìn)行Westerrn Blot分析，出現(xiàn)了特異的陽(yáng)性反應(yīng)條帶，NC蛋白為4.4KDa；S蛋白為120KDa，說(shuō)明所構(gòu)建的rVTT-NS疫苗可以穩(wěn)定的表達(dá)目的基因，如圖10所示。
實(shí)施例6使用含有SARS-CoV的NC和S編碼序列的DNA疫苗和天壇痘苗病毒疫苗rVTT-NS的Prime-Boost免疫實(shí)驗(yàn)1.含有SARS-CoV的NC和S編碼序列的DNA疫苗和天壇痘苗病毒疫苗rVTT-NS的Prime-Boost免疫接種策略。
本實(shí)施例中使用6-8周齡BALB/c(H-2d)雌性小鼠(體重19-25克，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)檢測(cè)本發(fā)明疫苗的效力。將實(shí)施例2的含有SARS-CoV的NC和S目的基因的DNA疫苗用1×PBS制備成1mg/ml的注射液。重組痘苗病毒rVTT-NS1×108pfu/mL。免疫4組，每組6只小鼠。各免疫組接種策略見(jiàn)表1。DNA疫苗脛骨前肌注射100ug/鼠/次(每后肢50ug)。rVTT-NS重組痘苗病毒劑量為107pfu/鼠/次。第10周進(jìn)行免疫檢測(cè)。對(duì)照使用pCDNA空載體、不插入目的基因的痘苗病毒天壇株。
表1.針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗和天壇痘苗病毒疫苗rVTT-NS的Prime-Boost免疫接種方案

2.ELISPOT檢測(cè)體外抗原表位肽刺激后分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
檢測(cè)IFN-γ的ELISPOT實(shí)驗(yàn)采用荷蘭U-CyTech公司的試劑盒，具體規(guī)程參照U-CyTech公司的使用說(shuō)明書(shū)。刺激多肽為S蛋白的16條肽(S1，VFNATKFPSVYAWERKKI；S2，SVYAWERKKISNCVADY；S3，STFFSTFKCYGVSATKL；S4，KCYGVSATKLNDLCFSNV；S5，NIDATSTGNYNYKYRYLR；S6，NYNYKYRYLRHGKLRPF；S7，RASANLAATKMSECVL；S8，AATKMSECVLGOSKRVDF；S9，LMSFPQAAPHGVVFLHV；S10，APHGVVFLHVTYVPSQER)和NC蛋白的1條肽(N1，QIGYYRRATRRVRGGDGK)。結(jié)果顯示單針或雙針SARS-CoV(NC和S基因)DNA疫苗初始免疫，然后以本發(fā)明的針對(duì)SARS-CoV的痘苗病毒疫苗加強(qiáng)免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)肌體產(chǎn)生高水平T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，具體結(jié)果見(jiàn)圖11。
3.檢測(cè)免疫的小鼠血清中的特異性抗SARS-CoV核殼蛋白和突起蛋白的IgG結(jié)合抗體為檢測(cè)SARS-CoV重組痘苗病毒單獨(dú)免疫和加強(qiáng)免疫所誘導(dǎo)的特異性體液免疫水平，在第10周取小鼠血清，用SARS-CoV核殼蛋白和突起蛋白抗原(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院疫苗研究中心惠贈(zèng))包被酶標(biāo)板，間接ELISA法檢測(cè)SARS-CoV核殼蛋白和突起蛋白特異性IgG抗體的水平。各免疫組SARS-CoV核殼蛋白和突起蛋白特異性IgG抗體滴度列于圖12。
4.免疫的小鼠的血清中SARS-CoV中和抗體滴度。
應(yīng)用空斑減少中和試驗(yàn)對(duì)免疫小鼠血清進(jìn)行中和抗體測(cè)定以評(píng)價(jià)其免疫效果。采用Vero-E6細(xì)胞接種2孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板，加兩層含瓊脂糖培養(yǎng)基。以中性紅為染色劑建立空斑試驗(yàn)。以能減少50％的空斑為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定抗SARS-CoV BJ01株中和抗體。各組檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血清體外中和SARS-CoV抗體的滴度

以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其無(wú)意于對(duì)本發(fā)明的范圍做出任何限制。顯然，在不脫離本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)的情況下，本領(lǐng)域人員可以對(duì)本發(fā)明作出多種改動(dòng)和變化，因此，這些改動(dòng)和變化同樣在本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心<120>基于復(fù)制型痘苗病毒載體的SARS疫苗<130>I200501573CB<160>9<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1293<212>DNA<213>SARS-CoV N gene<400>1gccaccatga gcgataatgg cccccagagc aaccagagaa gcgcccccag aatcacattt 60ggcggcccta ccgacagcac cgacaacaat cagaacggcg gcagaaatgg cgccagaccc120aagcagagga gacctcaggg cctgcccaat aataccgcca gctggttcac agccctgaca180cagcacggaa aggaggagct gagattccct agaggccagg gcgtgcccat caataccaac240agcggccctg acgatcagat cggctactac cggagggcca ccagaagagt gagaggcggc300gacggcaaga tgaaggagct gagcccccgg tggtactttt actacctggg caccggacct360gaagccagcc tgccttacgg cgccaataag gagggcattg tgtgggtggc cacagagggc420gccctgaaca cccctaagga ccacatcggc accaggaacc ccaacaacaa tgccgccacc480gtgctgcagc tgcctcaggg aaccacactg cccaagggct tttacgccga gggcagcaga540ggaggatctc aggccagcag caggagcagc agcagaagca ggggcaacag cagaaatagc600acccccggca gcagcagagg aaatagcccc gccagaatgg cctctggcgg aggagagaca660gccctggccc tgctgctgct ggacagactg aatcagctgg agagcaaggt gagcggaaag720ggacagcagc agcagggaca gaccgtgaca aagaagtctg ccgccgaggc ctctaagaag780
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權(quán)利要求
1.一種基于復(fù)制型痘苗病毒的針對(duì)SARS-CoV的疫苗，其包含復(fù)制型痘苗病毒作為載體，其中所述痘苗病毒基因組的胸苷激酶(TK)區(qū)插入了編碼SARS-CoV核殼蛋白和突起蛋白的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述復(fù)制型痘苗病毒是痘苗病毒天壇株。
3.權(quán)利要求1或2的疫苗，其中所述疫苗不含有選擇標(biāo)記基因。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述多核苷酸經(jīng)密碼子優(yōu)化改造，適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效率表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的疫苗，其中所述編碼SARS-CoV核殼蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列和/或所述編碼SARS-CoV突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的疫苗，其還包含藥用可接受的佐劑和/或載體。
7.一種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，其包含一種載體，所述載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼SARS-CoV核殼蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
8.一種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，其包含一種載體，所述載體包含可操縱地連接于啟動(dòng)子的編碼SARS-CoV突起蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
9.一種針對(duì)SARS-CoV的免疫接種方法，其包括給個(gè)體施用免疫有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的疫苗。
10.權(quán)利要求9的免疫接種方法，其還包括在施用所述疫苗之前給個(gè)體施用一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗。
11.權(quán)利要求10的免疫接種方法，其中所述一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗是權(quán)利要求7和/或權(quán)利要求8的DNA疫苗。
12.一種免疫接種試劑盒，其包括一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗，還包括權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的疫苗，以及任選地包括指示用所述一或多種針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗進(jìn)行初次免疫，然后用權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫的接種程序說(shuō)明書(shū)。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述針對(duì)SARS-CoV的DNA疫苗是權(quán)利要求7和/或8的DNA疫苗。
14.一種痘苗病毒的通用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT 1.0，其保藏號(hào)為1458。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)SARS－CoV核殼蛋白和突起蛋白的重組SARS疫苗及其用途，所述SARS疫苗基于復(fù)制型痘苗病毒如痘苗病毒天壇株而構(gòu)建。本發(fā)明提供了用于構(gòu)建所述SARS疫苗的載體。本發(fā)明也提供了編碼SARS核殼蛋白和突起蛋白的DNA疫苗。本發(fā)明還涉及使用所述DNA疫苗和所述SARS疫苗的免疫接種方案。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101020055SQ20061000756
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日
發(fā)明者邵一鳴, 劉穎, 劉勇, 孫萌, 劉建元, 王寧 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心