專利名稱：一種甲基對硫磷降解菌及其在降解甲基對硫磷中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物降解領域，具體地說是涉及一種甲基對硫磷降解菌，及其在降解甲基對硫磷中的應用。
背景技術：
甲基對硫磷(Methyl Parathion，簡稱MP)是一種高毒的有機磷殺蟲劑，其化學分子式為C8H10NO5PS，化學名稱為O，O-二甲基O-(對-硝基苯基)硫逐磷酸酯。由于這種殺蟲劑具有高效、經濟等特點，其被廣泛應用于農業(yè)生產與害蟲防治中。但是同時，由于其殘毒將造成環(huán)境與食品的嚴重污染，并產生大量的殺蟲劑廢物，嚴重影響了人們的身體健康及出口農產品的質量，帶來了一系列負面效應。如何有效地處理殘留的甲基對硫磷，避免對環(huán)境及人類的損害，成為人們亟待解決的問題。
使用傳統(tǒng)的物理化學方法處理殘留的甲基對硫磷，難度大、成本較高，處理效率低，而且容易造成二次污染。所以目前一般選用比較環(huán)保的微生物降解技術，通過微生物對農藥礦化、水解和共代謝等代謝方式，來處理殘留的甲基對硫磷。如在文獻1甲基對硫磷降解菌DLL-1的分離、鑒定及降解性研究，應用與環(huán)境生物學報[J]，1999，5(增刊)147-150中所公開的，將農藥作為其唯一碳源或氮、磷源，使用甲基對硫磷降解菌DLL-1將其水解或礦化。這種方法在對甲基對硫磷的降解時，產生的中間產物是對硝基苯酚，而對硝基苯酚是一具有中等毒性的物質，會給人類的健康帶來潛在的威脅。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種從長期受農藥污染土壤中篩選分離出的、具有廣譜性降解有機磷類化合物、可以以共代謝的方式高效轉化甲基對硫磷的甲基對硫磷降解菌，及其在降解甲基對硫磷中的應用。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種甲基對硫磷降解菌DM-1，該甲基對硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》(北京市海淀區(qū)中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所)，其保藏號為CGMCC No.1620，其分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis.。
本發(fā)明提供的甲基對硫磷降解菌，是從長期受農藥污染的土壤中分離和篩選的，具體步驟如下將采集的農藥污染土樣用無機鹽培養(yǎng)液配制成20wt％的懸浮液，然后以5wt％的接種量接到含50mg/L甲基對硫磷的無機鹽培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)6代，逐漸提高無機鹽培養(yǎng)液中甲基對硫磷的濃度至600ppm；從最后的培養(yǎng)液取出1mL菌液，稀釋后，涂布于含有500ppm甲基對硫磷的無機鹽固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫箱培養(yǎng)；選取生長快(平板上有透明圈)，菌落規(guī)則，傳代穩(wěn)定的菌落，純化2～3次后得到純菌株；將分離出的5株菌作為復篩菌株在LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至相同OD值1.0，以10％的接種量接入含100ppm甲基對硫磷的無機鹽培養(yǎng)基中，于30℃，180rpm搖床培養(yǎng)48h，用氣相色譜測定降解率，最終篩選到降解率最高的一株菌，轉入牛肉膏蛋白胨斜面保存。
所述的無機鹽培養(yǎng)液是按下述比例配制的在1000ml水中，0.5g NaCl，0.2gMgSO4，0.5g(NH4)2SO4，1.5g K2HPO4，0.5g KH2PO4，0.05g CaCl2，0.02g FeSO4，0.002g酵母粉，pH值7.0，121℃高壓滅菌20min；所述的無機鹽固體培養(yǎng)基是將上述無機鹽培養(yǎng)液加入占無機鹽培養(yǎng)液總重量的1.5～2％(w/v)的瓊脂。
所述的LB培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨與文獻2微生物學實驗[M]，北京高等教育出版社，1988，75-78中相同。
所用的氣相色譜的檢測條件為HP5890II型氣相色譜儀，電子捕獲檢測器；色譜柱弱極性毛細管柱HP-1[100％聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane 25m×0.32mm(I.D.)×0.25μm]；操作溫度檢測器溫度300℃，進樣口溫度300℃，柱溫210℃；柱壓6.9psi；柱流量0.748ml/min；最小檢出量0.05μg/ml；標樣濃度0.5ppm；甲基對硫磷出峰時間約7.0min。
根據樣品峰面積、標樣峰面積及進樣量計算出培養(yǎng)液中甲基對硫磷的含量。計算公式為X=AXA0×a×V0VX]]>式中AX--待測樣峰面積；A0--標準樣峰面積；
a--標準樣濃度；V0--標準樣進樣量；VX--未知樣進樣量。
降解率計算公式為

采用微生物計算機分類鑒定系統(tǒng)(Biolog.Inc.，USA)對該菌株進行了鑒定。將純化的菌株在Biolog培養(yǎng)基上培養(yǎng)16～24h；采用干管法以GN/GP-IF制備菌懸液，調整濁度至52％T；菌懸液以每孔150μl接種于GN-Microplate鑒定板，鑒定板于30℃培養(yǎng)16～24h；以Reader掃描鑒定板，測定每個孔的吸光值，測定的結果與數據庫比對，由軟件自動給出鑒定結果。經Biolog技術鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，命名為甲基對硫磷降解菌DM-1。鑒定結果見表1。
表1、甲基對硫磷降解菌菌種鑒定結果

本發(fā)明提供的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株的形態(tài)特征和生長特點為革蘭氏陽性細菌，細胞為桿狀，長1.2～1.5μm，寬0.8μm，能形成芽孢，嚴格的好氧生長，屬于芽孢桿菌屬。在營養(yǎng)瓊脂上菌落形態(tài)規(guī)則，表面粗糙，邊緣為鋸齒狀。在液體培養(yǎng)基中振蕩通氣培養(yǎng)產生菌膜，不產生色素。菌株在7％NaCl培養(yǎng)基中生長，最適生長溫度為30℃，最適pH為7。
本發(fā)明提供的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株的生理生化性質為過氧化氫酶和氧化酶反應呈陽性；甲基紅和V.P.試驗呈陽性；吲哚試驗呈陰性；硝酸鹽還原試驗呈陰性；葡萄糖發(fā)酵產酸、產氣；能水解明膠和酪素；能利用檸檬酸鹽；不能水解淀粉和尿素。
本發(fā)明提供的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株的代謝特性為目前已報道的有機磷降解菌代謝甲基對硫磷是通過水解反應產生對硝基苯酚，而本發(fā)明的菌株DM-1是通過還原和水解反應將甲基對硫磷轉化為對氨基苯酚。該菌株能耐受0～600ppm的甲基對硫磷，并能迅速將其完全轉化。更為重要的是，菌株DM-1具有很寬的底物利用范圍，能高效地轉化其他有機磷農藥，如對氧磷、對硫磷和殺螟硫磷等，因此，該菌株在有機磷農藥污染的土壤和水體的原位生物修復中具有極大的應用潛力。
對本發(fā)明提供的甲基對硫磷降解菌DM-1的降解性能進行測定。
一、葡萄糖濃度對菌株生長及降解率的影響將所分離的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株在LB培養(yǎng)基(同前)中擴大培養(yǎng)OD值約1.5，離心后用無菌水洗滌，配制成菌懸浮液，以10％的接種量接入到含甲基對硫磷200ppm的無機鹽培養(yǎng)液(同前)中，分別加入不同濃度的葡萄糖的無機鹽液體培養(yǎng)液(葡萄糖的濃度分別為0g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，20g/L，pH值為7.0的)中，并以不接菌為對照，每個樣品設兩個平行。30℃，180r/min搖床振蕩培養(yǎng)32h。取培養(yǎng)液10ml，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，無水硫酸鈉干燥，稀釋，進行氣相色譜測定(檢測條件如前所述)，紫外分光光度計測定OD600。
結果如圖1所示，可知，無葡萄糖時(葡萄糖的濃度為0g/L)，甲基對硫磷幾乎不被降解；在葡萄糖作為外加碳源的條件下，DM-1對MP有較好的降解能力，能高效降解甲基對硫磷。葡萄糖濃度偏低時，菌株的生長較差，對農藥的降解效果也不佳；葡萄糖濃度為2～20g/L范圍內DM-1菌株均有良好的降解效果。
由此推斷，DM-1是通過共代謝作用來降解MP，其在降解過程中需要環(huán)境提供初級碳源。由上圖可知，葡萄糖存在與否對MP的降解起著決定性作用，其濃度高低對降解率也有一定的影響。本發(fā)明表明有毒化合物的共代謝降解過程是一個特殊的耗能過程，外界環(huán)境中能量的輸人是必要的。自然界中某些有毒難降解化合物不能被微生物直接降解，但添加少量易被微生物利用的底物如葡萄糖等，可以促進或啟動難降解化合物的降解，并將其導人循環(huán)。
二、初始pH值對菌株的生長及降解影響將所分離的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株在LB培養(yǎng)基(同前)中擴大培養(yǎng)至OD值約1.5，離心后用無菌水洗滌，配制成菌懸浮液，以10％的接種量接入含200ppm甲基對硫磷的無機鹽培養(yǎng)液(同前)中，將培養(yǎng)液的初始pH值分別調為6.0，6.5，7.0，8.0，9.0，并以不接菌為對照，每個樣品設兩個平行。30℃，180r/min搖床培養(yǎng)32h。取培養(yǎng)液10ml，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，無水硫酸鈉干燥，稀釋，進行氣相色譜測定(檢測條件如前所述)，紫外分光光度計測定OD600。
結果如圖2所示，可知，在pH值6.0～9.0的范圍內，DM-1菌株生長和降解效果均較好，其中為pH值為7.0時的降解率最高，生長量最大。
三、底物濃度對菌株生長及降解率的影響將所分離的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株在LB培養(yǎng)基(同前)中擴大培養(yǎng)至OD值約1.5，離心后用無菌水洗滌，配制成菌懸浮液，以10％的接種量接入含50ppm，100ppm，200ppm，300ppm，400ppm，500ppm甲基對硫磷、pH值為7.0、葡萄糖濃度為5g/L的無機鹽培養(yǎng)液(同前)中，并以不接菌為對照，每個樣品設兩個平行。30℃，180r/min搖床培養(yǎng)32h。取培養(yǎng)液10ml，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，無水硫酸鈉干燥，稀釋，進行氣相色譜測定(檢測條件如前所述)，紫外分光光度計測定OD600。
結果如圖3所示，可知，底物(甲基對硫磷)濃度為50～500ppm時菌株生長和降解效果均較好，底物濃度高于300ppm后降解率有所下降，表明菌株對甲基對硫磷的降解受甲基對硫磷的濃度影響，甲基對硫磷的濃度超過一定濃度對菌株的代謝有抑制作用。
四、DM-1菌株對MP的降解動態(tài)研究將所分離的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株在LB培養(yǎng)基(同前)中擴大培養(yǎng)至OD值約1.5，離心后用無菌水洗滌，配制成菌懸浮液，以10％的接種量接入含200ppm甲基對硫磷、pH值為7.0、葡萄糖濃度為5g/L的無機鹽培養(yǎng)液(同前)中，并以不接菌為對照，每個樣品設兩個平行。30℃，180r/min搖床培養(yǎng)。分別在3h，6h，12h，20h，28h，38h取培養(yǎng)液10ml，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，無水硫酸鈉干燥，稀釋，進行氣相色譜測定(檢測條件如前所述)，紫外分光光度計測定OD600。
結果如圖4所示，可知，菌株經過12h的培養(yǎng)后，生長速度開始加快，28h后進入生長平臺期，此后有緩慢下降。甲基對硫磷的濃度隨著菌株的生長而降低，0～28h內降解較快，28h后由于農藥含量很少，降解速率有所下降?？梢娋甑墓泊x能力跟菌株的生長量密切相關，隨著OD600值的增加，甲基對硫磷的濃度逐漸降低，在28h后幾乎被轉化完全。
采用氣譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)對本發(fā)明菌株DM-1降解甲基對硫磷的產物進行研究，GC-MS檢測條件為采用Agilent6890N-5973N-MSDGC-MS分析儀，色譜柱DB-5MS[60m×0.25mm(I.D.)×0.25μm]毛細管柱。操作條件——色譜柱溫度程序升溫，60℃開始，保持1min，以20℃/min上升到120℃，保持2min，以10℃/min上升到280℃，保持2min；進樣口溫度250℃；載氣(He)流量1.0mL/min；進樣量1μL；電離方式EI；電離能量70eV；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；掃描質量范圍30～280amu；掃描速度1.0s/scan。
對本發(fā)明的降解產物進行質譜分析，其質譜圖如圖5和圖6所示，分析可知該代謝物分別是O，O-二甲基O-(對氨基苯基)硫逐磷酸酯(氨基甲基對硫磷，C8H12NO3PS)，分子量為233，特征峰為233，124，108；和對氨基苯酚，分子量為109，特征峰為109，80，53。
以現(xiàn)有技術的方法對甲基對硫磷進行降解時，一般得到代謝產物為對硝基苯酚，其在中性或堿性水溶液中顯黃色。而在本發(fā)明中，在降解過程中從未看見到黃色的現(xiàn)象，將培養(yǎng)后的無機鹽溶液調pH值7.5，紫外掃描OD410(對硝基苯酚特征峰)，也沒有吸收峰出現(xiàn)?？梢?，本發(fā)明的DM-1菌對甲基對硫磷的共代謝途徑是一條完全不同于常規(guī)降解代謝的途徑。
使用本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌對甲基對硫磷進行降解時，使用含有5g/L葡萄糖pH值為7的無機鹽培養(yǎng)液按10％接種量接種本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌，在30℃對50～500ppm的甲基對硫磷有良好的降解效果。


圖1是葡萄糖濃度對甲基對硫磷的降解率和菌株生長的影響曲線；圖2是初始pH值對甲基對硫磷的降解率和菌株生長的影響曲線；圖3是底物濃度對甲基對硫磷的降解率和菌株生長的影響曲線；圖4是MP的降解曲線及DM-1的生長曲線；圖5是DM-1降解甲基對硫磷的降解產物I氨基甲基對硫磷的質譜圖；圖6是DM-1降解甲基對硫磷的降解產物II氨基甲基對硫磷的質譜圖。
具體實施例方式
實施例1、分離和篩選本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌從天津農藥廠周圍采集的長期受農藥污染的土壤中取樣，將采集的農藥污染土樣用無機鹽培養(yǎng)液配制成20wt％的懸浮液，然后以5wt％的接種量接到含50mg/L甲基對硫磷的無機鹽培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)6代，逐漸提高無機鹽培養(yǎng)液中甲基對硫磷的濃度至600ppm；從最后的培養(yǎng)液取出1mL菌液，稀釋后，涂布于含有500ppm甲基對硫磷的無機鹽固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫箱培養(yǎng)；選取生長快(平板上有透明圈)，菌落規(guī)則，傳代穩(wěn)定的菌落，純化2～3次后得到純菌株；將分離出的5株菌作為復篩菌株在LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至相同OD值1.0，以10％的接種量接入含100ppm甲基對硫磷的無機鹽培養(yǎng)基中，于30℃，180rpm搖床培養(yǎng)48h，用氣相色譜測定降解率，最終篩選到降解率最高的一株菌，轉入牛肉膏蛋白胨斜面保存。該甲基對硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》(北京市海淀區(qū)中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所)，其保藏號為CGMCCNo.1620，其分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis.。
所述的無機鹽培養(yǎng)液是按下述比例配制的在1000ml水中，0.5g NaCl，0.2gMgSO4，0.5g(NH4)2SO4，1.5g K2HPO4，0.5g KH2PO4，0.05g CaCl2，0.02g FeSO4，0.002g酵母粉，pH值7.0，121℃高壓滅菌20min；所述的無機鹽固體培養(yǎng)基是將上述無機鹽培養(yǎng)液加入占無機鹽培養(yǎng)液總重量的1.5～2％(w/v)的瓊脂。
所述的LB培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨與文獻2微生物學實驗[M]，北京高等教育出版社，1988，75-78中相同。
所用的氣相色譜的檢測條件為HP5890II型氣相色譜儀，電子捕獲檢測器；色譜柱弱極性毛細管柱HP-1[100％聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane 25m×0.32mm(I.D.)×0.25μm]；操作溫度檢測器溫度300℃，進樣口溫度300℃，柱溫210℃；柱壓6.9psi；柱流量0.748ml/min；最小檢出量0.05μg/ml；標樣濃度0.5ppm甲基對硫磷出峰時間約7.0min。
根據樣品峰面積、標樣峰面積及進樣量計算出培養(yǎng)液中甲基對硫磷的含量。計算公式為X=AXA0×a×V0VX]]>式中AX--待測樣峰面積；A0--標準樣峰面積；
a--標準樣濃度；V0--標準樣進樣量；VX--未知樣進樣量。
降解率計算公式為

實施例2、鑒定實施例1的甲基對硫磷降解菌采用微生物計算機分類鑒定系統(tǒng)(Biolog.Inc.，USA)對實施例1得到的菌株進行了鑒定。將純化的菌株在Biolog培養(yǎng)基上培養(yǎng)16～24h；采用干管法以GN/GP-IF制備菌懸液，調整濁度至52％T；菌懸液以每孔150μl接種于GN-Microplate鑒定板，鑒定板于30℃培養(yǎng)16～24h；以Reader掃描鑒定板，測定每個孔的吸光值，測定的結果與數據庫比對，由軟件自動給出鑒定結果。經Biolog技術鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，命名為甲基對硫磷降解菌DM-1。鑒定結果見表1。
表1、甲基對硫磷降解菌菌種鑒定結果

實施例3、葡萄糖濃度對本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌DM-1的生長及降解率的影響將實施例1中所分離的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株在LB培養(yǎng)基(同前)中擴大培養(yǎng)OD值約1.5，離心后用無菌水洗滌，配制成菌懸浮液，以10％的接種量接入到含甲基對硫磷200ppm的無機鹽培養(yǎng)液(同前)中，分別加入不同濃度的葡萄糖的無機鹽液體培養(yǎng)液(葡萄糖的濃度分別為0g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，20g/L，pH值為7.0的)中，并以不接菌為對照，每個樣品設兩個平行。30℃，180r/min搖床振蕩培養(yǎng)32h。取培養(yǎng)液10ml，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，無水硫酸鈉干燥，稀釋，進行氣相色譜測定(檢測條件如前所述)，紫外分光光度計測定OD600。
結果如圖1所示，可知，無葡萄糖時(葡萄糖的濃度為0g/L)，甲基對硫磷幾乎不被降解；在葡萄糖作為外加碳源的條件下，DM-1對MP有較好的降解能力，能高效降解甲基對硫磷。葡萄糖濃度偏低時，菌株的生長較差，對農藥的降解效果也不佳；葡萄糖濃度為2～20g/L范圍內DM-1菌株均有良好的降解效果。
由此推斷，DM-1是通過共代謝作用來降解MP，其在降解過程中需要環(huán)境提供初級碳源。由上圖可知，葡萄糖存在與否對MP的降解起著決定性作用，其濃度高低對降解率也有一定的影響。本發(fā)明表明有毒化合物的共代謝降解過程是一個特殊的耗能過程，外界環(huán)境中能量的輸人是必要的。自然界中某些有毒難降解化合物不能被微生物直接降解，但添加少量易被微生物利用的底物如葡萄糖等，可以促進或啟動難降解化合物的降解，并將其導人循環(huán)。
實施例4、初始pH值對本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株的生長及降解影響將實施例1所分離的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株在LB培養(yǎng)基(同前)中擴大培養(yǎng)至OD值約1.5，離心后用無菌水洗滌，配制成菌懸浮液，以10％的接種量接入含200ppm甲基對硫磷的無機鹽培養(yǎng)液(同前)中，將培養(yǎng)液的初始pH值分別調為6.0，6.5，7.0，8.0，9.0，并以不接菌為對照，每個樣品設兩個平行。30℃，180r/min搖床培養(yǎng)32h。取培養(yǎng)液10ml，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，無水硫酸鈉干燥，稀釋，進行氣相色譜測定(檢測條件如前所述)，紫外分光光度計測定OD600。
結果如圖2所示，可知，在pH值6.0～9.0的范圍內，DM-1菌株生長和降解效果均較好，其中為pH值為7.0時的降解率最高，生長量最大。
實施例5、底物濃度對本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株生長及降解率的影響將實施例1所分離的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株在LB培養(yǎng)基(同前)中擴大培養(yǎng)至OD值約1.5，離心后用無菌水洗滌，配制成菌懸浮液，以10％的接種量接入含50ppm，100ppm，200ppm，300ppm，400ppm，500ppm甲基對硫磷、pH值為7.0、葡萄糖濃度為5g/L的無機鹽培養(yǎng)液(同前)中，并以不接菌為對照，每個樣品設兩個平行。30℃，180r/min搖床培養(yǎng)32h。取培養(yǎng)液10ml，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，無水硫酸鈉干燥，稀釋，進行氣相色譜測定(檢測條件如前所述)，紫外分光光度計測定OD600。
結果如圖3所示，可知，底物(甲基對硫磷)濃度為50～500ppm時菌株生長和降解效果均較好，底物濃度高于300ppm后降解率有所下降，表明菌株對甲基對硫磷的降解受甲基對硫磷的濃度影響，甲基對硫磷的濃度超過一定濃度對菌株的代謝有抑制作用。
實施例6、本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株對MP的降解動態(tài)研究將實施例1所分離的甲基對硫磷降解菌DM-1菌株在LB培養(yǎng)基(同前)中擴大培養(yǎng)至OD值約1.5，離心后用無菌水洗滌，配制成菌懸浮液，以10％的接種量接入含200ppm甲基對硫磷、pH值為7.0、葡萄糖濃度為5g/L的無機鹽培養(yǎng)液(同前)中，并以不接菌為對照，每個樣品設兩個平行。30℃，180r/min搖床培養(yǎng)。分別在3h，6h，12h，20h，28h，38h取培養(yǎng)液10ml，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，無水硫酸鈉干燥，稀釋，進行氣相色譜測定(檢測條件如前所述)，紫外分光光度計測定OD600。
結果如圖4所示，可知，菌株經過12h的培養(yǎng)后，生長速度開始加快，28h后進入生長平臺期，此后有緩慢下降。甲基對硫磷的濃度隨著菌株的生長而降低，0～28h內降解較快，28h后由于農藥含量很少，降解速率有所下降?？梢娋甑墓泊x能力跟菌株的生長量密切相關，隨著OD600值的增加，甲基對硫磷的濃度逐漸降低，在28h后幾乎被轉化完全。
實施例7、采用氣譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)對本發(fā)明菌株DM-1降解甲基對硫磷的產物進行研究GC-MS檢測條件為采用Agilent6890N-5973N-MSDGC-MS分析儀，色譜柱DB-5MS[60m×0.25mm(I.D.)×0.25μm]毛細管柱。操作條件——色譜柱溫度程序升溫，60℃開始，保持1min，以20℃/min上升到120℃，保持2min，以10℃/min上升到280℃，保持2min；進樣口溫度250℃；載氣(He)流量1.0mL/min；進樣量1μL；電離方式EI；電離能量70eV；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；掃描質量范圍30～280amu；掃描速度1.0s/scan。
對本發(fā)明的降解產物進行質譜分析，其質譜圖如圖5和圖6所示，分析可知該代謝物分別是O，O-二甲基O-(對氨基苯基)硫逐磷酸酯(氨基甲基對硫磷，C8H12NO3PS)，分子量為233，特征峰為233，124，108；和對氨基苯酚，分子量為109，特征峰為109，80，53。
權利要求
1.一種甲基對硫磷降解菌DM-1，該甲基對硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCCNo.1620，其分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis.。
2.如權利要求1所述的甲基對硫磷降解菌，是從長期受農藥污染的土壤中分離和篩選的，具體步驟如下將采集的農藥污染土樣用無機鹽培養(yǎng)液配制成20wt％的懸浮液，然后以5wt％的接種量接到含50mg/L甲基對硫磷的無機鹽培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)6代，逐漸提高無機鹽培養(yǎng)液中甲基對硫磷的濃度至600ppm；從最后的培養(yǎng)液取出1mL菌液，稀釋后，涂布于含有500ppm甲基對硫磷的無機鹽固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫箱培養(yǎng)；選取生長快，菌落規(guī)則，傳代穩(wěn)定的菌落，純化2～3次后得到純菌株；將分離出的5株菌作為復篩菌株在LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至相同OD值1.0，以10％的接種量接入含100ppm甲基對硫磷的無機鹽培養(yǎng)基中，于30℃，180rpm搖床培養(yǎng)48h，用氣相色譜測定降解率，最終篩選到降解率最高的一株菌，轉入牛肉膏蛋白胨斜面保存。
3.如權利要求2所述的甲基對硫磷降解菌，其特征在于所述的無機鹽培養(yǎng)液是按下述比例配制的在1000ml水中，0.5g NaCl，0.2g MgSO4，0.5g(NH4)2SO4，1.5gK2HPO4，0.5g KH2PO4，0.05g CaCl2，0.02g FeSO4，0.002g酵母粉，pH值7.0，121℃高壓滅菌20min。
4.如權利要求2所述的甲基對硫磷降解菌，其特征在于所述的無機鹽固體培養(yǎng)基是將上述無機鹽培養(yǎng)液加入占無機鹽培養(yǎng)液總重量的1.5～2％(w/v)的瓊脂。
5.一種權利要求1所述的甲基對硫磷降解菌在降解甲基對硫磷中的應用。
6.如權利要求5所述的甲基對硫磷降解菌在降解甲基對硫磷中的應用，其特征在于使用含有5g/L葡萄糖pH值為7的無機鹽培養(yǎng)液按10％接種量接種本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌，在30℃對50～500ppm的甲基對硫磷進行降解。
全文摘要
本發(fā)明提供一種甲基對硫磷降解菌DM－1，該甲基對硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1620，其分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis.。本發(fā)明提供的甲基對硫磷降解菌，是從長期受農藥污染的土壤中分離和篩選的。使用本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌對甲基對硫磷進行降解時，使用含有5g/l葡萄糖pH值為7的無機鹽培養(yǎng)液按10％接種量接種本發(fā)明的甲基對硫磷降解菌，在30℃對50～500ppm的甲基對硫磷有良好的降解效果。
文檔編號C12N1/20GK101024819SQ20061000827
公開日2007年8月29日 申請日期2006年2月20日 優(yōu)先權日2006年2月20日
發(fā)明者喬傳令, 楊超, 董明, 黃瑤 申請人:中國科學院動物研究所