專利名稱：一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多藥耐藥細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
肺癌為當(dāng)前世界最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占常見惡性腫瘤的首位，并且80％的患者在確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了手術(shù)治療的時(shí)機(jī)。諾維本(NVB)即去甲長春花堿，為上世紀(jì)九十年代才開始應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物，它具有廣譜的抗腫瘤活性，尤其是治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，是目前單藥治療非小細(xì)胞肺癌最有效的藥物之一，有效率為30％，諾維本與順伯聯(lián)合治療肺癌是目前公認(rèn)的最有效的化療方案之一。但仍有部分肺癌患者治療效果不佳，出現(xiàn)了腫瘤對藥物的多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了分析腫瘤細(xì)胞化療耐藥后的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)習(xí)性的變化，篩選化療藥物及判斷化療藥物的敏感性，分析腫瘤化療多藥耐藥機(jī)制，體外篩選耐藥逆轉(zhuǎn)劑，提供了一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系。肺癌多藥耐藥細(xì)胞系按以下步驟建立(一)將對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞放入含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中培養(yǎng)；(二)待培養(yǎng)器內(nèi)壁70％～90％的面積鋪滿Anip973細(xì)胞，取Anip973細(xì)胞放入經(jīng)生理鹽水稀釋、NVB濃度為0.01～0.02μg/mL的培養(yǎng)液中在37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24h；(三)棄去NVB液，加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待存活的Anip973細(xì)胞傳代、進(jìn)入對數(shù)生長期后放入經(jīng)生理鹽水稀釋、增加了NVB濃度的培養(yǎng)液中在37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24h；(四)重復(fù)操作步驟(三)，直到NVB經(jīng)生理鹽水稀釋后濃度為2.0～2.2μg/mL為止，即得到具有耐藥性的Anip973/NVB細(xì)胞系。本發(fā)明的肺癌多藥耐藥細(xì)胞系(Anip973/NVB)為世界首次選用諾維本(NVB)篩選建立人肺腺癌耐藥細(xì)胞系。由于藥物諾維本(NVB)具有廣譜的抗腫瘤活性，所以將來通過諾維本(NVB)篩選建立的肺癌多藥耐藥細(xì)胞系(Anip973/NVB)分析得到的腫瘤細(xì)胞化療耐藥后的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)習(xí)性的變化，篩選得到的化療藥物及判斷得出的化療藥物的敏感性，分析得到的腫瘤化療多藥耐藥機(jī)制，體外篩選得到的耐藥逆轉(zhuǎn)劑更具有代表性、針對性、可靠性和廣譜性。


圖1是光學(xué)顯微鏡下Anip973細(xì)胞觀察圖；圖2是光學(xué)顯微鏡下Anip973/NVB細(xì)胞觀察圖；圖3是透射電鏡下Anip973細(xì)胞觀察圖；圖4是透射電鏡下Anip973/NVB細(xì)胞觀察圖；圖5是Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞生長曲線圖，圖中粗曲線代表Anip973細(xì)胞生長曲線，圖中細(xì)曲線代表Anip973/NVB細(xì)胞生長曲線；圖6是Anip973細(xì)胞細(xì)胞周期分析圖；圖7是Anip973/NVB細(xì)胞細(xì)胞周期分析圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式肺癌多藥耐藥細(xì)胞系按以下步驟建立(一)將對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞放入含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中培養(yǎng)；(二)待培養(yǎng)器內(nèi)壁70％～90％的面積鋪滿Anip973細(xì)胞，取Anip973細(xì)胞放入經(jīng)生理鹽水稀釋、NVB濃度為0.01～0.02μg/mL的培養(yǎng)液中在37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24h；(三)棄去NVB液，加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待存活的Anip973細(xì)胞傳代、進(jìn)入對數(shù)生長期后放入經(jīng)生理鹽水稀釋、增加了NVB濃度的培養(yǎng)液中在37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24h；(四)重復(fù)操作步驟(三)，直到NVB經(jīng)生理鹽水稀釋后濃度為2.0～2.2μg/mL為止，即得到具有耐藥性的Anip973/NVB細(xì)胞系。
本實(shí)施方式中的Anip973細(xì)胞在液氮中保存(凍存液按體積百分比由60％的1640細(xì)胞培養(yǎng)液、30％的優(yōu)級胎牛血清和10％的DMSO組成)。凍存細(xì)胞復(fù)蘇將裝有凍存Anip973細(xì)胞的凍存管從液氮中取出后立即37℃水浴快速解凍，輕搖凍存管使其在1min內(nèi)全部融化，以70％酒精擦拭凍存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)；解凍細(xì)胞懸浮液用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至10mL后混均離心(1000r/min離心10min)，棄去上清液，加生理鹽水至10mL，再次離心(1000r/min離心10min)，棄去上清液，向細(xì)胞沉淀中加入RPMI-1640培養(yǎng)液，用移液槍打勻后移入培養(yǎng)瓶放入37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中培養(yǎng)。
對本實(shí)施方式建立的具有多藥耐藥性的Anip973/NVB細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性檢測1、形態(tài)學(xué)觀察(1)光學(xué)顯微鏡觀察分別取對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞，生理鹽水清洗換液后，在倒置顯微鏡(×200倍)下觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。通過光鏡可觀察到Anip973細(xì)胞呈類圓形，大小及形態(tài)均較規(guī)則(如圖1所示)，Anip973/NVB細(xì)胞稍大，形態(tài)不規(guī)則，呈長偽足的多角形，體積增大出現(xiàn)巨大細(xì)胞(如圖2所示)。
(2)透射電鏡觀察分別取對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞2×107個(gè)，經(jīng)濃度為0.3％的胰酶消化1～5min后1000r/min離心10min，再用PBS緩沖液反復(fù)洗滌3次，之后細(xì)胞團(tuán)用4℃預(yù)冷、濃度為0.25％的戊二醛固定，常規(guī)梯度脫水、包埋，制備超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和鉛染液雙染后，在透射電子顯微鏡(×8000倍)下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。通過透射電子顯微鏡觀察到Anip973細(xì)胞表面有許多密集分布的微絨毛，胞核大，胞漿少，核漿比例大，胞漿內(nèi)可見散在游離核糖體，線粒體嵴粗大，基質(zhì)密度大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上單位膜核糖體顆粒清晰可見(如圖3所示)；而Anip973/NVB細(xì)胞表面微絨毛有脫失，胞核變小，核漿比例減小，核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)斑塊狀高密度分布，胞漿內(nèi)空泡結(jié)構(gòu)明顯增多，游離核糖體聚集且數(shù)量增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒(如圖4所示)。
通過光學(xué)顯微鏡和透射電鏡的觀察可以在細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上明顯區(qū)分Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞。
2、測定細(xì)胞生長曲線和倍增時(shí)間取對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞進(jìn)行消化后接種于24孔板，每孔細(xì)胞1×104個(gè)，于24、48、72、96、120小時(shí)計(jì)算細(xì)胞數(shù)，每次計(jì)數(shù)3孔，取平均值繪制細(xì)胞生長曲線，并計(jì)算倍增時(shí)間(Td)。按Patterson公式計(jì)算細(xì)胞在對數(shù)生長期的群體倍增時(shí)間Td(h)＝Tlg2/lg(N/N0)(T代表細(xì)胞對數(shù)增值時(shí)間，N和N0分別代表對數(shù)生長期的起始和終止時(shí)的細(xì)胞數(shù))。經(jīng)過多天連續(xù)測定兩細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn)，兩細(xì)胞系的生長曲線形態(tài)相似(如圖5所示)，無明顯差異，而Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞的倍增時(shí)間分別為23.45h和24.21h，Anip973/NVB細(xì)胞與Anip973細(xì)胞增殖速度接近，表明Anip973/NVB細(xì)胞的增殖未受到明顯抑制。
3、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分別取對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞2×107個(gè)，經(jīng)濃度為0.3％的胰酶消化1～5min后1000r/min離心10min，用4～10℃的PBS緩沖液洗滌兩次，再用濃度為70％的乙醇固定細(xì)胞24h；上機(jī)測定前離心去除乙醇，再用PBS緩沖液洗滌兩次，之后加入濃度為100μg/mL的RNase在37℃反應(yīng)30min后用濃度為50μg/mL的碘化丙錠(propidium iodide，PI)染色30min，然后尼龍網(wǎng)過濾，送入流式細(xì)胞儀測定，計(jì)算出細(xì)胞周期的分布。通過儀器分析得出Anip973/NVB細(xì)胞系較親代細(xì)胞的細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變，其主要改變表現(xiàn)為耐藥細(xì)胞系A(chǔ)nip973/NVB的G0～G1期細(xì)胞明顯增多，為62.90％，S期細(xì)胞明顯減少，為28.32％；而Anip973細(xì)胞上述各周期的百分比分別為53.73％、38.25％(數(shù)據(jù)如表1所示)，兩種細(xì)胞系G2～M期細(xì)胞無明顯變化(如圖6所示、如圖7所示)。
表1

4、耐藥譜分析(MTT法)分別取處于對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞，經(jīng)濃度為0.3％的胰酶消化1～5min后加10mL生理鹽水，在1000r/min的條件下離心10min并重復(fù)離心一次，計(jì)數(shù)，以每孔1×104個(gè)的細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加含10％優(yōu)級胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液180μL，培養(yǎng)24h后加入用生理鹽水稀釋(每種藥物設(shè)五個(gè)濃度，各濃度間相差10倍)的化療藥物(NVB、順鉑、吉西他濱、紫杉醇、伊立替康、足葉乙甙、異環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、表阿霉素)20μL，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對照孔加生理鹽水20μL，共同作用48h后，每孔加入20μL MTT溶液，再培養(yǎng)4h后去除培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜，震蕩后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上選擇波長為490nm測定吸光值(A值)，比色時(shí)空白孔調(diào)零，全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。根據(jù)A值采用線性回歸計(jì)算各藥物的半數(shù)抑制率(IC50)，計(jì)算相對耐藥指數(shù)(RI)，RI＝IC50(Anip973/NVB)/IC50(Anip973)。MTT法耐藥譜分析表明Anip973/NVB細(xì)胞系對NVB的耐藥倍數(shù)為21.81倍，除此之外，該細(xì)胞系對順鉑、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺、表阿霉素、氟尿嘧啶達(dá)卡巴嗪和足葉乙甙藥物也產(chǎn)生了交叉耐藥，耐藥倍數(shù)分別為11.89、11.68、6.12、3.95、2.86、2.64和2.15，而對伊立替康、吉西他濱仍保持敏感耐藥，倍數(shù)分別為1.38、1.27(均P＜0.05)，具體數(shù)據(jù)如表2所示。
表2

5、高效液相(HPLC)色譜法測定細(xì)胞內(nèi)NVB的濃度取出對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞，以NVB濃度為2.0μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，24h后消化細(xì)胞進(jìn)行如下處理(1)取105～106個(gè)細(xì)胞用4℃的PBS緩沖溶液洗滌，再在1000r/m的條件下離心30min，棄去上清；(2)重復(fù)操作(1)3次后反復(fù)凍融3次(-80℃ 30s，37℃ 5min)，再在4℃、10000r/min的條件下離心10min，加4℃甲醇渦旋2min，然后在在4℃、10000r/min的條件下離心10min，取上清液；(3)向(2)提取上清液后剩余的細(xì)胞沉淀中加4℃甲醇渦旋2min，再在4℃、10000r/min的條件下離心10min，取上清液；(4)合并(2)和(3)提取的上清液，吹干上清液，再用流動(dòng)相溶解，進(jìn)行HPLC檢測。
經(jīng)過高效液相(HPLC)色譜法測定發(fā)現(xiàn)，加藥24h后，Anip973細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度為0.22±0.05μg/mL，未檢測到Anip973/NVB細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(三)中經(jīng)生理鹽水稀釋的NVB液濃度為0.03～0.04μg/mL。其它步驟與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(四)中重復(fù)操作步驟(三)197～216次，每次增加NVB液濃度0.01μg/mL。其它步驟與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(四)中重復(fù)操作步驟(三)100～120次，每次增加NVB液濃度0.01～0.02μg/mL。其它步驟與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(四)中重復(fù)操作步驟(三)50～80次，每次增加NVB液濃度0.02～0.04μg/mL。其它步驟與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(四)中重復(fù)操作步驟(三)20～30次，前10次每次增加NVB液濃度0.02～0.04μg/mL，之后每次增加NVB液濃度0.09～0.18μg/mL。其它步驟與實(shí)施方式一相同。
權(quán)利要求
1.一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于肺癌多藥耐藥細(xì)胞系按以下步驟建立(一)將對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞放入含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中培養(yǎng)；(二)待培養(yǎng)器內(nèi)壁70％～90％的面積鋪滿Anip973細(xì)胞，取Anip973細(xì)胞放入經(jīng)生理鹽水稀釋、NVB濃度為0.01～0.02μg/mL的培養(yǎng)液中在37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24h；(三)棄去NVB液，加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待存活的Anip973細(xì)胞傳代、進(jìn)入對數(shù)生長期后放入經(jīng)生理鹽水稀釋、增加了NVB濃度的培養(yǎng)液中在37℃、CO2濃度為5％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24h；(四)重復(fù)操作步驟(三)，直到NVB經(jīng)生理鹽水稀釋后濃度為2.0～2.2μg/mL為止，即得到具有耐藥性的Anip973/NVB細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于步驟(三)中經(jīng)生理鹽水稀釋的NVB液濃度為0.03～0.04μg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于步驟(四)中重復(fù)操作步驟(三)197～216次，每次增加NVB液濃度0.01μg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于步驟(四)中重復(fù)操作步驟(三)100～120次，每次增加NVB液濃度0.01～0.02μg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于步驟(四)中重復(fù)操作步驟(三)50～80次，每次增加NVB液濃度0.02～0.04μg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于步驟(四)中重復(fù)操作步驟(三)20～30次，前10次每次增加NVB液濃度0.02～0.04μg/mL，之后每次增加NVB液濃度0.09～0.18μg/mL。
全文摘要
一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系，它涉及一種多藥耐藥細(xì)胞系。本發(fā)明的為了分析腫瘤細(xì)胞化療耐藥后的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)習(xí)性的變化，篩選化療藥物及判斷化療藥物的敏感性，分析腫瘤化療多藥耐藥機(jī)制，體外篩選耐藥逆轉(zhuǎn)劑，提供了一種肺癌多藥耐藥細(xì)胞系。肺癌多藥耐藥細(xì)胞系建立(一)將Anip973細(xì)胞放入含胎牛血清、青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)液中，置于37℃、CO
文檔編號C12N5/08GK1884493SQ20061001025
公開日2006年12月27日 申請日期2006年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月5日
發(fā)明者陳公琰, 楊朝陽, 王萌, 洪璇 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)