專利名稱：一種用于檢測男性個體痤瘡易感人群的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測男性個體痤瘡易感人群的試劑盒，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
痤瘡是人類最常見的一種損容性皮膚病，患病率高達45.6％，嚴重影響人們的容貌和身心健康，已成為醫(yī)學界所關(guān)注的熱點問題之一。近年來分子流行病學的研究表明，痤瘡的發(fā)生可能是具備某種遺傳易感基因的個體與特定的環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。本實驗室通過對多例痤瘡先證者和對照者的親屬進行遺傳模式研究，結(jié)果顯示痤瘡不符合單基因遺傳病，提示痤瘡屬于多基因遺傳病。運用微觀的分子生物學技術(shù)對多例云南漢族雄激素相關(guān)基因與痤瘡發(fā)病關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)與雄激素代謝密切相關(guān)的CYP17基因位點的多態(tài)性與男性痤瘡相關(guān)()男性重型痤瘡組C和T等位基因頻率分別為60.9％和39.1％，TT+TC基因型、CC基因型頻率分別為33.3％和66.7％，與對照組T、C等位基因(53.4％，46.6％)及基因型(81.8％，18.2％)頻率相比有明顯差異(P＜0.05)。
聚合酶反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對于CYP17基因分型是一個行之有效的方法。由于存在T(-34)C多態(tài)，CYP17基因T(-34)C位點有TT、CT和CC三種基因型。根據(jù)TT、CT和CC三種基因型的DNA片斷經(jīng)電泳后產(chǎn)生的處于不同位置的條帶可以判斷男性個體是否屬于痤瘡相對易感人群或相對非易感人群。相對易感人群(基因型為CC個體)或相對非易感人群(基因型為TT或TC個體)，這樣可以對人群進行早期篩查，為疾病的控制和早期預防提供較好的幫助。
參照文獻1.Mitrunen K，Jourenkova N，Kataja V，et al.Steroid metabolism geneCYP17 polymorphism and the development of breast cancer.CancerEpidemiol Biomarkers Prev，2000，91343-1348.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是通過設計專一性的引物，應用較為簡單的PCR擴增(聚合酶鏈式反應擴增)方法，擴增產(chǎn)物經(jīng)MspA1I內(nèi)切酶消化可檢測與雄激素代謝密切相關(guān)的CYP17基因位點的多態(tài)性，從而判斷樣本主人是否為痤瘡的相對易感人群(基因型為CC個體)或相對非易感人群(基因型為TT或TC個體)。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的用于檢測男性個體痤瘡易感人群的試劑盒，由標準樣本、PCR擴增試劑、PCR產(chǎn)物酶切試劑及分子量標準品組成，其中1.擴增引物片段為CYP17基因第一外顯子翻譯起始區(qū)上游-322至+92處，PCR產(chǎn)物長度為414bp，正向引物為CYP17-A(forward)5’-CAT TCG CAC TCT GGA GTC-3’反向引物為CYP17-M(reverse)5’-AGG CTC TTG GGG TAC TTG-3’；
2.標準樣本為陰性對照和陽性對照，具體為a.陰性對照為CYP17基因T(-34)C位點的基因型TT和CT擴增片段的MspA1I內(nèi)切酶消化產(chǎn)物，即-34TT型的酶切結(jié)果為414bp片段；-34TC酶切結(jié)果為414bp、289bp、125bp三種片段；b.陽性對照為CYP17基因T(-34)C位點的CC基因型的擴增片段的MspA1I內(nèi)切酶的消化產(chǎn)物，即-34CC酶切結(jié)果為289bp、125bp兩種片段。
用于檢測男性個體痤瘡易感人群的試劑盒由下列步驟得到樣本DNA抽提抽提取人外周血50μl，應用各種商業(yè)化的人血DNA抽提試劑盒(例如寶生物試劑盒)按使用說明抽提DNA，常規(guī)方法測定濃度，調(diào)整濃度為30-50ng/μl作為檢測用模版DNA。
PCR擴增材料與方法1、PCR擴增1.1 PCR引物設計引物設計參照文獻[1]，預擴增片段為CYP17基因第一外顯子翻譯起始區(qū)上游-322至+92處，PCR產(chǎn)物長度為414bp。
正向引物為CYP17-A(forward)5’-CAT TCG CAC TCT GGA GTC-3’反向引物為CYP17-M(reverse)5’-AGG CTC TTG GGG TAC TTG-3’1.2四類樣本并按如下順序病人樣本、陽性對照、陰性對照和無DNA樣本對照。
1.3PCR反應體系總體系 15μl10×Buffer(Mg2+) 1.5μldNTP(2.0mM/mL) 1μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)0.1μl正向引物(1μM/L) 1μl反向引物(1μM/L) 1μl模板DNA 1μl去離子水 9.4μl注10×Buffer(Mg2+)組成Tris-HCl(PH8.3)100mMKCl 500mMMgCl215mM1.4PCR反應條件94℃ 5 minutes94℃ 30 seconds58℃ 30 seconds72℃ 30 seconds35 cycles72℃ extension 7 minutes4℃ holdPCR產(chǎn)物進行酶切反應。
2酶切反應2.1酶切反應體系
總體系 10μl10×Buffer(Buffer 4) 1μlBSA(牛血清蛋白)0.1μlMspA1I內(nèi)切酶 0.3μl模板DNA(PCR產(chǎn)物) 3μl去離子水 5.6μl2.2酶切反應條件PCR產(chǎn)物用MspA1I內(nèi)切酶37℃消化3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5％瓊脂糖凝膠電泳，0.4％溴化乙錠染色。
3瓊脂糖電泳注電泳電壓為200V電泳時間為15minutes2.5％瓊脂糖取2.5克瓊脂糖加100mL去離子水。
0.4％溴化乙錠取4mg/ml溴化乙錠250ul；加水定容至25ml，室溫保存。
電泳時(1)將酶切產(chǎn)物注入瓊脂糖凝膠孔時用移液器。
(2)酶切產(chǎn)物按照病人樣本、陽性對照、陰性對照和無DNA樣本對照的順序注入瓊脂糖凝膠孔，以便于鑒別和記錄。
4凝膠成像將電泳后瓊脂糖凝膠放入CCD自動凝膠成像系統(tǒng)攝片，曝光時間為80ms，照片上作如下標記日期、樣本編號、樣本類別(分子量標準(Marker)、樣品擴增產(chǎn)物、陰性對照、陽性對照和無DNA樣本)。
注Marker為50bp DNA分子量標準，從小到大依次為150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp等。
5結(jié)果分析在所有研究對象中CYP17基因T(-34)C位點有TT、CT和CC三種基因型，即存在T(-34)C多態(tài)。如個體為-34CC型純合子，酶切結(jié)果產(chǎn)生289bp、125bp兩種片段；如為-34TC型雜合子，酶切結(jié)果產(chǎn)生414bp、289bp、125bp三種片段；如為-34TT型純合子，酶切結(jié)果產(chǎn)生414bp一種片段。
CYP17基因T(-34)C位點CC純合基因型的男性個體相對易患痤瘡，而TT純合和TC雜合的男性個體相對不易患痤瘡。
本發(fā)明具有操作簡便、檢測結(jié)果準確率高等優(yōu)點。


附圖為Marker及四類樣本(病人樣本、陽性對照、陰性對照和無DNA樣本)圖。
圖中marker50bpLadder；CC為CC基因型純合子；TT為TT基因型純合子；TC為TC基因型雜合子。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
首先抽提某男性的血樣1ml，按照發(fā)明內(nèi)容所述的內(nèi)容及步驟，在普通分子生物學實驗室中，完成對他CYP17基因T(-34)C位點的分型檢測。結(jié)果為CYP17基因T(-34)C位點CC純合基因型的男性個體為易患痤瘡，而TT純合和TC雜合的男性個體則不易患痤瘡。
發(fā)明人采用本發(fā)明對數(shù)百人進行檢測，其檢測結(jié)果準確率較高。
云南大學陳穗云座瘡SEQUENCE LISTING<110>云南大學<120>一種用于檢測男性個體痤瘡易感人群的試劑盒<130>1<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>414<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>exon<222>(323)..(412)<400>1cattcgcact ctggagtcat tcaagcatgg ggagctcctc agagggtgat caactgacct60cccttaccta gctcctcctc cggaggtttg ccctggagtt gagccagccc ttgaggaggc120cttcactccc accgcctctc tcccttctgg atatgagctc aggcctggct gggctccagg180agaatctttc cacaaggcaa gagataacac aaagtcaagg tgaagatcag ggtagccctt240taaaaggcct ccttgtgccc tagagttgcc acagctcttc tactccactg ctgtctatct300tgcctgccgg cacccagcca cc atg tgg gag ctc gtg gct ctc ttg ctg ctt 352Met Trp Glu Leu Val Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10acc cta gct tat ttg ttt tgg ccc aag aga agg tgc cct ggt gcc aag 400Thr Leu Ala Tyr Leu Phe Trp Pro Lys Arg Arg Cys Pro Gly Ala Lys15 20 25tac ccc aag agc ct 414Tyr Pro Lys Ser30<210>2<211>18<212>DNA<213>artificial<220>
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<223>引物<400>3aggctcttgg ggtacttg 18
權(quán)利要求
1.一種用于檢測男性個體痤瘡易感人群的試劑盒，由標準樣本、PCR擴增試劑、PCR產(chǎn)物酶切試劑及分子量標準品組成，其特征至于1.1.擴增引物片段為CYP17基因第一外顯子翻譯起始區(qū)上游-322至+92處，PCR產(chǎn)物長度為414bp，正向引物為CYP17-A(forward)5’-CAT TCG CAC TCT GGA GTC-3’反向引物為CYP17-M(reverse)5’-AGG CTC TTG GGG TAC TTG-3’；1.2標準樣本為陰性對照和陽性對照，其中a.陰性對照為CYP17基因T(-34)C位點的TT和CT基因型擴增片段的MspA1I內(nèi)切酶消化產(chǎn)物，即-34TT型的酶切結(jié)果為414bp片段；-34TC酶切結(jié)果為414bp、289bp、125bp三種片段；b.陽性對照為CYP17基因T(-34)C位點CC基因型的擴增片段的MspA1I內(nèi)切酶消化產(chǎn)物，即-34CC酶切結(jié)果為289bp、125bp兩種片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測男性個體痤瘡易感人群的試劑盒，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明由標準樣本、PCR擴增試劑、PCR產(chǎn)物酶切試劑及分子量標準品組成.其中擴增引物片段為CYP17基因第一外顯子翻譯起始區(qū)上游－322至+92處，PCR產(chǎn)物長度為414bp，正向引物為CYP17－A(forward)5’－CAT TCG CAC TCT GGAGTC－3’；反向引物為CYP17－M(reverse)5’－AGG CTC TTG GGG TAC TTG－3’。陰性對照為CYP17基因T(－34)C位點TT和CT基因型的擴增片段的MspA1I內(nèi)切酶消化產(chǎn)物，即－34TT型的酶切結(jié)果為414bp片段；－34TC酶切結(jié)果為414bp、289bp、125bp三種片段。陽性對照為CYP17基因T(－34)C位點CC基因型的擴增片段的MspA1I內(nèi)切酶消化產(chǎn)物，即－34CC酶切結(jié)果為289bp、125bp兩種片段。本發(fā)明具有廣泛的應用領(lǐng)域。本發(fā)明具有操作簡便、檢測結(jié)果準確率高等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK1850986SQ20061001071
公開日2006年10月25日 申請日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者肖春杰, 何黎, 陳穗云 申請人:云南大學