專利名稱：固定化細(xì)胞有機(jī)－無機(jī)復(fù)合材料膜狀載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化載體材料，特別是一種應(yīng)用于糖蜜或淀粉原料酒精酵母發(fā)酵的固定化細(xì)胞有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料膜狀載體。
背景技術(shù)：
固定化細(xì)胞技術(shù)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一門新興生物技術(shù)，與傳統(tǒng)游離細(xì)胞發(fā)酵方法相比，具有處理效率高，穩(wěn)定性好，微生物負(fù)載量大，有著游離細(xì)胞發(fā)酵無法比擬的優(yōu)點，因此固定化細(xì)胞技術(shù)成為近10余年來研究的重點。
固定化微生物催化劑的活性與固定化載體的種類及其制備方法有很大關(guān)系，傳統(tǒng)的固定化載體材料如聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、聚氯乙烯、硅藻土、陶瓷等，具有生化穩(wěn)定性差、傳質(zhì)效果差、機(jī)械強(qiáng)度低、易被生物分解以及成本較高的缺點，很難符合工業(yè)化要求。美國專利4983299報道通過聚氨酯、吸附活性炭而作為固定化生物載體；中國專利CN1105649A通過在聚氨酯制備過程中添加活性炭、發(fā)泡成型后作為固定化微生物載體，中國專利CN1478891A在聚醚型聚氨酯發(fā)泡過程中添加活性炭、多異氰酸酯、吸水劑以改善載體微生物親和性及吸水性，這些載體仍存在吸附能力差，微生物親和性、吸水性及穩(wěn)定性仍待加強(qiáng)的問題。開發(fā)新型固定化微生物載體材料，就要求克服傳統(tǒng)載體的以上缺點，通過制備新型無機(jī)-無機(jī)、有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料并對材料進(jìn)行改性與修飾，以調(diào)節(jié)載體負(fù)載性能對微生物進(jìn)行固定化。與上述載體材料相比，聚氨酯、海藻酸鈉，聚乙烯醇等作為常用的包埋載體，具有對微生物無毒、來源豐富，價格低廉等優(yōu)點，但強(qiáng)度較差，比表面小。氧化鋁及其前驅(qū)體如擬薄水鋁石、薄水鋁石以及介孔分子篩MCM-41，有著良好的生物相容性以及獨(dú)特的孔道結(jié)構(gòu)，可提供微生物細(xì)胞適宜的生長環(huán)境，將上述無機(jī)物加入高分子物質(zhì)中改性后，復(fù)合載體強(qiáng)度增強(qiáng)，具有更多孔道網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，通透性更好，從而使微生物繁殖速度加快，單位體積內(nèi)數(shù)量更多，提高了酒精發(fā)酵效率，而這些無機(jī)材料的添加改性高分子物質(zhì)未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有微生物細(xì)胞高密度棲居、繁殖微環(huán)境的獨(dú)特多孔道網(wǎng)格結(jié)構(gòu)、形成一種具有獨(dú)特孔道結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料膜狀載體。
本發(fā)明的膜狀載體是在普通聚醚型聚氨酯泡沫、海藻酸鈉、聚乙烯醇(聚合度1750±50，以下同)等高分子聚合物材料中添加氧化鋁前驅(qū)體擬薄水鋁石、薄水鋁石、介孔分子篩等無機(jī)物質(zhì)，制成有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料，利用這些無機(jī)物獨(dú)特的孔道結(jié)構(gòu)，并結(jié)合高分子物質(zhì)細(xì)胞親和性好，包埋量大及無機(jī)物質(zhì)強(qiáng)度好，比表面大，通透性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，可再生利用等優(yōu)點，以這種吸附包埋的耦合，得到具有有機(jī)-無機(jī)疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)載體，利于增殖和傳質(zhì)，有著廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過在普通聚醚型聚氨酯泡沫或海藻酸鈉和聚乙烯醇等高分子聚合物材料中添加氧化鋁前驅(qū)體擬薄水鋁石、薄水鋁石以及介孔分子篩MCM-41改性，這種固定化細(xì)胞復(fù)合膜狀載體所用的原料配比為聚醚2.50-5.00，硅油0.02-0.05，三乙烯二胺0.01-0.02，辛酸亞錫0.01-0.02，甲苯二異氰酸酯1.20-2.40，聚乙烯醇3.00-10.00，氧化鋁前驅(qū)體0.40-1.00，水0.08-0.20；或者海藻酸鈉1.00-7.00，聚乙烯醇3.00-10.00，氧化鋁前驅(qū)體0.40-1.00，MCM-41介孔分子篩0.40-1.00，菌懸液10.00-40.00，水88-90。
前者生產(chǎn)方法對于普通聚醚型聚氨酯泡沫，根據(jù)原料配比，將聚醚、硅油、三乙烯二胺、辛酸亞錫、水在20-24℃下混合攪拌均勻后，添加聚乙烯醇、氧化鋁前驅(qū)體、MCM-41介孔分子篩無機(jī)材料，于攪拌下加入甲苯二異氰酸酯，混勻后置于模具中發(fā)泡成膜狀，即制得微生物固定化載體成品；將此微生物固定化載體加入菌懸液后，放入糖蜜培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，訓(xùn)化培養(yǎng)3-6天后，可用于酒精發(fā)酵過程。
后者生產(chǎn)方法對于海藻酸鈉，根據(jù)原料配比將海藻酸鈉、聚乙烯醇和水在100-120℃加熱攪拌的條件下使其充分溶解混合，添加氧化鋁前驅(qū)體、MCM-41介孔分子篩無機(jī)材料攪拌混合均勻，經(jīng)滅菌后，加入菌懸液攪拌均勻，用制膜機(jī)涂膜后放入1％-5％wt的氯化鈣溶液中交聯(lián)1-5h，放入糖蜜培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)。以上固定化細(xì)胞有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料膜狀載體，經(jīng)過3-6天的培養(yǎng)增殖，載體包埋量可達(dá)到30-50億個/mL，滲出游離細(xì)胞達(dá)1.2億個/mL以上，可將其放入發(fā)酵罐中以糖蜜為原料進(jìn)行發(fā)酵，其固定化發(fā)酵周期可縮短到10h之內(nèi)。
本發(fā)明所提供的固定化復(fù)合材料膜狀載體，利用在普通聚醚型聚氨酯泡沫、海藻酸鈉、聚乙烯醇等高分子聚合物材料中添加氧化鋁前驅(qū)體擬薄水鋁石、薄水鋁石以及介孔分子篩MCM-41改性，制備出新型有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料。利用這些無機(jī)物質(zhì)獨(dú)特的孔道結(jié)構(gòu)，高分子物質(zhì)細(xì)胞親和性好，包埋吸附量大及無機(jī)物質(zhì)強(qiáng)度好，比表面大，通透性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，可再生利用等優(yōu)點，通過這種包埋吸附的耦合，得到具有疏松網(wǎng)結(jié)構(gòu)有機(jī)-無機(jī)復(fù)合載體，增加了細(xì)胞負(fù)載量，及材料的彈性和穩(wěn)定性，利于增殖和傳質(zhì)，從而增加了本發(fā)明提供的固定化復(fù)合材料膜狀載體的工業(yè)化應(yīng)用優(yōu)勢。
將其用于固定化細(xì)胞，特別是應(yīng)用于酒精發(fā)酵領(lǐng)域，具有通透性強(qiáng)，機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性好，微生物親和性優(yōu)良，包埋吸附量大(達(dá)30-60億/mL)的特點。其酵周期縮短至10小時以內(nèi)，載體乙醇產(chǎn)率可達(dá)175.50L.Et-OH/M3.h，容積乙醇產(chǎn)率可達(dá)11.00L.Et-OH/M3.h，使用壽命可達(dá)一年以上，可再生利用。本發(fā)明的制備方法簡單，易于實現(xiàn)，本發(fā)明所制備的是一種高效的固定化細(xì)胞載體。


圖1是本發(fā)明的二級邊續(xù)流動固定化酵母發(fā)酵流程中，1-無油一級空氣過濾器，2-無油二級空氣過濾器，3-糖蜜配料罐，4-儲罐，5-料液流量計，6-氣體流量計，7-一級發(fā)酵罐，8-二級發(fā)酵，9-1#液面管，10-2#液面管，11-發(fā)酵液儲罐，12-泵。
具體實施例方式
實施例1按照質(zhì)量取聚醚2.50份、硅油0.02份、三乙烯二胺0.01份、辛酸亞錫0.01份、水0.08份在20-24℃下混合攪拌均勻后，添加聚乙烯醇10.00份、薄水鋁石0.40份、MCM-41介孔分子篩0.40份，于攪拌下加入甲苯二異氰酸酯1.20份，混勻后置于模具中發(fā)泡成膜狀得微生物固定化載體；將此微生物固定化載體加入酵母菌菌濃為15-20億個/mL的菌懸液中，放入糖蜜培養(yǎng)基(添加成分與YEPD培養(yǎng)基類似，以下同)中增殖培養(yǎng)；訓(xùn)化培養(yǎng)3-6天后，載體包埋量可達(dá)到30-50億個/mL，滲出游離細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.0億個/mL以上，轉(zhuǎn)入發(fā)酵階段。
在體積為1L的柱狀發(fā)酵罐中，按照10.00％的填充率加入上述固定化載體，加入150g/L的原糖蜜，并不斷鼓氧，進(jìn)行批式發(fā)酵，發(fā)酵周期為5小時，殘余總糖為7g/L，酒精度為9.3％(v/v)。載體使用6個月仍保持上述發(fā)酵效率。所使用設(shè)備及過程如附圖所示，在兩個體積為300L的發(fā)酵罐中，按照7.50％的填充率加入上述固定化復(fù)合材料膜狀載體，將兩個發(fā)酵罐串聯(lián)為二級發(fā)酵罐，以0.10h-1的稀釋率連續(xù)流加200g/L的原糖蜜，停留時間7.5h，發(fā)酵醪酒精度為11.00％(v/v)；糖醇轉(zhuǎn)化率99.87％，載體乙醇產(chǎn)率為175.50L.Et-OH/M3.h，容積乙醇產(chǎn)率11.00L.Et-OH/M3.h；載體使用6個月仍保持上述發(fā)酵效率。
實施例2按照質(zhì)量取聚醚5.00份、硅油0.05份、三乙烯二胺0.02份、辛酸亞錫0.02份、水0.18份在20-24℃下混合攪拌均勻后，添加聚乙烯醇3.00份、擬薄水鋁石1.00份、MCM-41介孔分子篩1.00份，于攪拌下加入甲苯二異氰酸酯2.40份，混勻后置于模具中發(fā)泡成膜狀。將此微生物固定化載體加入酵母菌菌濃為15-20億個/mL的菌懸液中，放入糖蜜培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)。訓(xùn)化培養(yǎng)3-6天后，載體包埋量可達(dá)到30-50億個/mL，滲出游離細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.2億個/mL以上，轉(zhuǎn)入發(fā)酵階段。
在體積為1L的柱狀發(fā)酵罐中，按照15.00％的填充率加入固定化載體，加入200g/L的原糖蜜，并不斷鼓氧，進(jìn)行批式發(fā)酵，發(fā)酵周期為8小時，殘余總糖為1.96g/L，酒精度為12.6％(v/v)；載體使用6個月仍保持上述發(fā)酵效率。所使用設(shè)備與實施例1相同。
實施例3
按照質(zhì)量取海藻酸鈉4.00份，聚乙烯醇8.00份，水88.00份在100-120℃攪拌加熱條件下至溶解并混合均勻，依次加入0.40份薄水鋁石，0.40份MCM-41混合均勻；滅菌后冷卻至室溫，加入酵母菌菌濃為15-20億個/mL的菌懸液20份，攪拌均勻后，用涂膜機(jī)涂膜，膜厚3mm；將膜浸入2％的氯化鈣溶液中固化4小時；用大量水沖洗后，放入糖蜜培養(yǎng)基中鼓氧增殖，培養(yǎng)40-72小時后，載體包埋量可達(dá)到30-50億個/mL，滲出游離細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.6億個/mL以上，轉(zhuǎn)入發(fā)酵階段。
在體積為1L的柱狀發(fā)酵罐中，按照10.00％的填充率加入上述固定化載體，加入150g/L的原糖蜜，并不斷鼓氧，進(jìn)行批式發(fā)酵，發(fā)酵周期為5h，殘余總糖為7.80g/L，酒精度為9.0％(v/v)；載體使用6個月仍保持上述發(fā)酵效率。所使用設(shè)備與實施例1相同。
實施例5按照質(zhì)量取海藻酸鈉7.00份，聚乙烯醇3.00份，水90.00份在攪拌加熱條件下至溶解并混合均勻，加入1.00份薄水鋁石，1.00份MCM-41混合均勻；滅菌后冷卻至室溫，加入酵母菌菌濃為15-20億個/mL的菌懸液30份，攪拌均勻后，用涂膜機(jī)涂膜，膜厚3mm；將膜浸入2％的氯化鈣溶液中固化3小時；用大量水沖洗后，放入糖蜜培養(yǎng)基中鼓氧增殖，培養(yǎng)40-72小時后，載體包埋量可達(dá)到30-50億個/mL，滲出游離細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.2億個/mL以上，轉(zhuǎn)入發(fā)酵階段。
在體積為1L的柱狀發(fā)酵罐中，按照10.00％的填充率加入上述固定化載體，加入150g/L的原糖蜜，并不斷鼓氧，進(jìn)行批式發(fā)酵，發(fā)酵周期為5h，殘余總糖為7.80g/L，酒精度為9.0％(v/v)；載體使用6個月仍保持上述發(fā)酵效率。所使用設(shè)備與實施例1相同。
權(quán)利要求
1.一種固定化細(xì)胞有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料膜狀載體，其特征在于用以下配比的原料制成聚醚2.50-5.00，硅油0.02-0.05，三乙烯二胺0.01-0.02，辛酸亞錫0.01-0.02，甲苯二異氰酸酯1.20-2.40，聚乙烯醇3.00-10.00，氧化鋁前驅(qū)體0.40-1.00，水0.08-0.20；按此方法制備將聚醚、硅油、三乙烯二胺、辛酸亞錫、水在20-24℃下混合攪拌均勻后，添加聚乙烯醇、氧化鋁前驅(qū)體、MCM-41介孔分子篩無機(jī)材料，于攪拌下加入甲苯二異氰酸酯，混勻后置于模具中發(fā)泡成膜狀，即制得微生物固定化載體成品；或者用以下配比的原料制成海藻酸鈉1.00-7.00，聚乙烯醇3.00-10.00，氧化鋁前驅(qū)體0.40-1.00，MCM-41介孔分子篩0.40-1.00，菌懸液10.00-40.00，水88-90；按此方法制備將海藻酸鈉、聚乙烯醇和水在100-120℃加熱攪拌的條件下使其充分溶解混合，添加氧化鋁前驅(qū)體、MCM-41介孔分子篩無機(jī)材料攪拌混合均勻，經(jīng)滅菌后，加入菌懸液攪拌均勻，用制膜機(jī)涂膜后放入1％-5％wt的氯化鈣溶液中交聯(lián)1-5h，放入糖蜜培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，經(jīng)過3-6天的培養(yǎng)增殖，使載體包埋量達(dá)到30-50億個/mL，滲出游離細(xì)胞達(dá)1.2億個/mL以上時得到成品。
全文摘要
本發(fā)明是一種固定化細(xì)胞有機(jī)－無機(jī)復(fù)合材料膜狀載體。該載體是在普通聚醚型聚氨酯泡沫、海藻酸鈉、聚乙烯醇(聚合度1750±50)等高分子聚合物材料中添加氧化鋁前驅(qū)體如薄水鋁石、擬薄水鋁石以及介孔分子篩MCM－41等無機(jī)物質(zhì)進(jìn)行改性，制備出的克服傳統(tǒng)細(xì)胞固定化載體材料缺點的有機(jī)—無機(jī)復(fù)合材料，是一種有獨(dú)特孔道結(jié)構(gòu)能提供微生物細(xì)胞棲居、繁殖微環(huán)境的多孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)膜狀載體。包埋吸附量達(dá)30－60億/ml，發(fā)酵醪游離細(xì)胞可達(dá)0.8－1.6億/ml，將其用于固定化細(xì)胞，特別是應(yīng)用于酒精發(fā)酵領(lǐng)域，發(fā)酵周期縮短至10小時以內(nèi)，載體乙醇產(chǎn)率可達(dá)175.50L.Et－OH/M
文檔編號C12N1/16GK1888061SQ20061001107
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月25日
發(fā)明者鄭春明, 關(guān)乃佳, 耿長江, 陶耀佳, 鐘元俊 申請人:南開大學(xué)云南研究院