專利名稱：應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法。
背景技術(shù)：
目前獲得批準生產(chǎn)的流感疫苗仍是雞胚來源的滅活疫苗，但其仍存在許多不足，如，雞胚連續(xù)傳代后常常引起毒株變異；雞胚有可能存在外源病毒因子的污染；用雞胚生產(chǎn)流感疫苗不能滿足應(yīng)急情況下的需要，尤其是禽流感的爆發(fā)，也會影響雞胚的正常供應(yīng)。因此，世界衛(wèi)生組織敦促世界各國尋找對流感病毒敏感的細胞株大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法。中國專利號為02112013.7的發(fā)明專利說明書公開了一種大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)病毒疫苗的方法，該方法包括下列步驟a)在具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen Plus⑧生物反應(yīng)器中，以聚酯切片F(xiàn)ibra-CelTMDisks為載體，培養(yǎng)細胞生產(chǎn)病毒；b)在細胞生長至一定密度時，接種所述病毒，使所述病毒感染細胞；c)使病毒在合適的條件下大量增殖；d)經(jīng)純化后收獲病毒。這是一種利用細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)病毒疫苗的方法，具有培養(yǎng)的細胞密度高、可連續(xù)培養(yǎng)和病毒產(chǎn)量高等優(yōu)點，實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)疫苗的目的。由于細胞培養(yǎng)技術(shù)中，病毒吸附到細胞上繁殖，上述狂犬，出血熱、乙腦、小兒脊髓灰質(zhì)炎病毒容易吸附在細胞上，所以上述方法正如文中所提出的適合于狂犬疫苗、出血熱疫苗、乙腦疫苗、小兒脊髓灰質(zhì)炎疫苗和輪狀病毒疫苗的制備，而流感病毒未經(jīng)Vero細胞適應(yīng)采用上述專利中所提出的方法生產(chǎn)流感疫苗是困難的，這也就是至今流感疫苗還是借助雞胚制備而不能應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法。
本發(fā)明采取如下方法將流感當年流行毒株在Vero細胞上進行適應(yīng)傳代，經(jīng)傳代適應(yīng)的病毒毒種保存于-70℃以下待用；在生物反應(yīng)器中加入微載體，接種Vero細胞，待Vero細胞生長至一定密度時接種上述流感毒種，使病毒在合適的條件下大量增殖，將收獲的病毒液經(jīng)滅活、濃縮、純化及裂解，根據(jù)純化的單價原液的血凝素含量，配制成三價流感疫苗半成品。
上述流感流行毒株在Vero細胞上的適應(yīng)傳代采取如下措施將細胞Vero置于培養(yǎng)器皿中用EDTA或胰蛋白酶消化傳代，細胞長成單層后，倒掉生長液，用Hank’s液或PBS將細胞表面清洗1～2遍，接種流感毒種，加入含一定濃度的胰蛋白酶的維持液后培養(yǎng)，收獲前將細胞凍融1～2次，按上述同樣方法繼續(xù)傳代。
所采用的生物反應(yīng)器為固定床籃式攪拌反應(yīng)器，載體是片狀載體，其成分是聚酯纖維。
所采用的生物反應(yīng)器為懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器，微載體是葡聚糖聚合物。
本發(fā)明采用將流感毒種在非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)上進行傳代適應(yīng)，在適當濃度的裂解劑的作用下，流感病毒對Vero細胞感染能力增強，并很快適應(yīng)Vero細胞，然后將在Vero細胞適應(yīng)的流感毒種接種到在生物反應(yīng)器已增殖到107個/ml以上細胞密度的Vero細胞中，調(diào)節(jié)反應(yīng)器各種控制參數(shù)，如攪拌速度、PH值、D0值、灌流速度等，使病毒在高細胞密度的生物反應(yīng)器中高校繁殖，并連續(xù)灌流，收獲病毒液，然后進行病毒的滅活、濃縮、純化、裂解等步驟制成流感疫苗。
本發(fā)明的應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗，解決了以往采用雞胚生產(chǎn)流感疫苗所存在的外源病毒污染難以控制、付反應(yīng)大、成本高、生產(chǎn)規(guī)模不易擴大的缺點，它具有安全有效、抗原量高、質(zhì)量穩(wěn)定、易于擴大規(guī)模等優(yōu)點。
具體實施例方式
實施例1流感疫苗的制備方法如下在流感疫苗的的制備中，首先要解決的是流感病毒適應(yīng)Vero細胞，這是本制備方法的關(guān)鍵，采取如下步驟從種子細胞庫中復(fù)蘇一支Vero細胞，將細胞加入有生長液的細胞培養(yǎng)器皿中，生長液是MEM或M199+8％牛血清PH7.0～7.2，37℃培養(yǎng)48小時長成單層后，倒掉生長液，用Hank’s液將細胞表面清洗1～2遍，將生長液中殘余的牛血清洗凈(由于牛血清中含有流感病毒的非特異性抑制素，會影響流感病毒的復(fù)制)，接著接種流感毒種，置33～35℃吸附1-2小時，然后加入維持液，維持液采取無血清培養(yǎng)基(含1～5μg/ml胰蛋白酶)，加胰蛋白酶的目的是為了提高流感病毒在細胞中的復(fù)制能力，經(jīng)33-35℃培養(yǎng)三天收獲，收獲前將細胞凍融1-2次，細胞破裂病毒釋放，可提高收獲液的病毒滴度。按同樣的方法將流感毒種繼續(xù)傳代，經(jīng)6～8代收獲，病毒血凝滴度穩(wěn)定到1∶320，將毒種保存于-70℃以下待用。通過上述方法獲得的病毒已適應(yīng)Vero細胞。
工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)流感疫苗所用主要設(shè)備是購自美國NBS公司14升生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器采用的攪拌系統(tǒng)是固定床籃式攪拌系統(tǒng)(FibrousTM-Bed Basket system)，罐體為夾套式耐高溫壓玻璃罐體。工作體積10升。
在14升生物反應(yīng)器的罐體中加入400克片狀載體，片狀載體由美國NBS公司生產(chǎn)，其成份為聚酯切片，在上述罐體中同時加入10升磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.3)，121℃消毒1小時，消毒后，排空PBS，加入Vero細胞生長液(DMEM+8％小牛血清)，37℃預(yù)熱30分鐘。接種27瓶(3L細胞瓶)細胞于罐體內(nèi)，調(diào)整反應(yīng)罐參數(shù)，攪拌速度為60-90rpm，溶氧50-80％，pH7.0-7.2，按葡萄糖含量在0.8-1.8g/L連續(xù)灌流5-6天后全部排空罐內(nèi)生長液，并用Hank’s液將罐體及載體洗3遍后，加入10L維持液(含1～5μg/ml胰蛋白酶)，同時接種上述流感毒種，調(diào)節(jié)反應(yīng)罐參數(shù)(溫度34℃，攪拌速度60-90rpm，溶氧50-80％，pH7.4-7.8)，24小時后按葡萄糖含量在0.8-1.8g/L連續(xù)灌流進行流感病毒的培養(yǎng)及收獲。
將收獲的病毒液加1/4000的甲醛，20-22℃滅活96小時，然后用10萬分子量超濾膜濃縮30-50倍，用蔗糖密度梯度離心方法純化，用5％Triton×100進行裂解。
根據(jù)純化的單價原液的血凝素含量，按最終30μg/劑.亞型配制成流感疫苗半成品。
實施例2生物反應(yīng)器采用懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器，載體是葡聚糖聚合物，操作步驟基本與實施例1相同。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法，其特征在于將流感當年流行毒株在Vero細胞上進行適應(yīng)傳代，經(jīng)傳代適應(yīng)的病毒毒種保存于-70℃以下待用；在生物反應(yīng)器中加入微載體，接種Vero細胞，待Vero細胞生長至一定密度時接種上述流感毒種，使病毒在合適的條件下大量增殖，將收獲的病毒液經(jīng)滅活、濃縮、純化及裂解，根據(jù)純化的單價原液的血凝素含量，配制成三價流感疫苗半成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法，其特征在于上述流感流行毒株在Vero細胞上的適應(yīng)傳代采取如下措施將細胞Vero置于培養(yǎng)器皿中用EDTA或胰蛋白酶消化傳代，細胞長成單層后，倒掉生長液，用Hank’s液或PBS將細胞表面清洗1～2遍，接種流感毒種，加入維持液(含一定濃度的胰蛋白酶)后培養(yǎng)，收獲前將細胞凍融1～2次，按上述同樣方法繼續(xù)傳代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法，其特征在于生物反應(yīng)器為固定床籃式攪拌反應(yīng)器，載體是片狀載體，其成分是聚酯纖維。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法，其特征在于生物反應(yīng)器為懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器，微載體是葡聚糖聚合物。
全文摘要
一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法，本發(fā)明采用將流感毒種在非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)上進行傳代適應(yīng)，在適當濃度的裂解劑的作用下，流感病毒對Vero細胞感染能力增強，并很快適應(yīng)Vero細胞，然后將流感毒種接種到在生物反應(yīng)器已增殖到10
文檔編號C12M3/02GK101062411SQ20061001177
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日
發(fā)明者張玉慧 申請人:江蘇延申生物科技股份有限公司