專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)兩優(yōu)培九種子純度的引物及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明檢測(cè)兩優(yōu)培九種子純度的引物及其方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專(zhuān)用于兩優(yōu)培九種子純度的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物種子純度是種子定級(jí)的主要依據(jù)，是種子質(zhì)量控制過(guò)程中最棘手的問(wèn)題。多年來(lái)，許多種子工作者主要是通過(guò)田間檢驗(yàn)(如海南檢驗(yàn))等方法鑒定雜交稻種子純度，不但檢驗(yàn)所需周期長(zhǎng)，而且需要消耗大量的人力、物力、財(cái)力，無(wú)法滿足種子經(jīng)營(yíng)工作的需要。也有利用苗期形態(tài)、同工酶電泳等方法進(jìn)行鑒定的報(bào)道，由于重復(fù)性及可靠性不夠好，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性，而未能廣泛使用。因此，尋找一種穩(wěn)定可靠又快速簡(jiǎn)便的種子純度鑒定方法迫在眉睫。
水稻是單子葉分子生物學(xué)研究的模式植物，已完成了秈、粳兩個(gè)亞種的全基因測(cè)序，已鑒定并開(kāi)發(fā)出多種類(lèi)型的分子標(biāo)記，用于研究水稻起源、分化、有利性狀的基因標(biāo)記等研究。SSR標(biāo)記(也稱(chēng)微衛(wèi)星標(biāo)記)在水稻基因組中廣泛存在，由于具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、成本相對(duì)低而受到眾多研究者的青睞。
兩系雜交稻“兩優(yōu)培九”于2001年通過(guò)全國(guó)審定。該組合表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病，綜合性狀好，已成為長(zhǎng)江中下游稻區(qū)主栽品種，但母本培矮64 S是光溫敏核不育系，在育性敏感期如氣溫連續(xù)3 d低于23.5℃時(shí)，會(huì)部分自交結(jié)實(shí)，從而降低雜交種純度，會(huì)在生產(chǎn)上造成損失。如能在種子收購(gòu)前或收購(gòu)時(shí)，采用快速、準(zhǔn)確的純度鑒定方法，對(duì)擬收購(gòu)或已收購(gòu)的種子標(biāo)樣進(jìn)行純度檢測(cè)，對(duì)于種子經(jīng)營(yíng)和第二年的生產(chǎn)有重要意義。本試驗(yàn)采用水稻基因組中廣泛存在的SSR標(biāo)記，對(duì)兩優(yōu)培九及其雙親進(jìn)行分子水平的多態(tài)性分析，建立一套標(biāo)準(zhǔn)化快速鑒定體系，用于兩優(yōu)培九種子純度的室內(nèi)鑒定。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中兩優(yōu)培九種子純度的田間鑒定檢測(cè)方法所需時(shí)間長(zhǎng)，消耗大的問(wèn)題，提供兩優(yōu)培九種子純度的室內(nèi)檢測(cè)方法，對(duì)兩優(yōu)培九種子進(jìn)行SSR分子標(biāo)記檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確。
技術(shù)方案檢測(cè)兩優(yōu)培九種子純度的引物，包括引物RM7117上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCAC和引物RM180上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG上述引物用于檢測(cè)兩優(yōu)培九種子純度的方法，包括1)材料的準(zhǔn)備供試種子培苗至3-5cm高度；2)微量法提取植物DNA取上述種子幼苗0.1g于1.5mLEp管中，將幼苗搗碎后加100μL DNA提取緩沖液，65℃水浴15min，取出后在室溫放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所用DNA提取緩沖液為PH＝8.0的Tris-HCL為100m moL，NaCl為0.5mol/L，TritonX-100體積比為0.3％；3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系0.2ml薄壁PCR反應(yīng)管中，加1μL模板10ng/μL DNA，1μL 4pmol/μL SSR引物RM180，1μL 4pmol/μL SSR引物RM7117，0.2μL 2.5mM dNTP，0.25μL 2u/μL Tag酶，1.6ul PCR buffer，4.95μL無(wú)菌水，總體積10μL，混勻后于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)程序首先94℃預(yù)變性5min；然后40個(gè)循環(huán)94℃變性45s，55℃復(fù)性50s，72℃延伸1.5min；接著72℃延伸10min；最后4℃保存；4)聚丙烯酰胺凝膠電泳按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版》，科學(xué)出版社1993年327-330頁(yè)所述方法；5)銀染100mL10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL固定12min，0.2％AgNO3滲透12min，100mL超純水漂洗30s、10％Na2S2O320μL漂洗30s，1.5％NaOH，甲醛1mL顯色15min；6)確定純度觀察電泳結(jié)果，能擴(kuò)增得到6條分子量分別為130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp條帶的確定為兩優(yōu)培九種子，其余缺失或含有其他分子量的條帶均為混雜種子，通過(guò)計(jì)算即可獲得兩優(yōu)培九種子純度。
有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)提供特異的SSR引物RM7117和RM180來(lái)檢測(cè)兩優(yōu)培九種子的純度，RM7117上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC
下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCACRM180上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG(2)一步法提取兩優(yōu)培九種子植物的DNA，方便易行。
(3)速度快用SSR分子標(biāo)記檢測(cè)兩優(yōu)培九種子的純度有重要的應(yīng)用價(jià)值。兩優(yōu)培九種子純度不高，給生產(chǎn)帶來(lái)很大影響，如能在種子收購(gòu)前或收購(gòu)時(shí)，采用快速、準(zhǔn)確的純度鑒定方法，對(duì)擬收購(gòu)或已收購(gòu)的種子標(biāo)樣進(jìn)行純度檢測(cè)，對(duì)于種子經(jīng)營(yíng)和第二年的大田生產(chǎn)有重要意義。而正常的海南鑒定所需時(shí)間長(zhǎng)，投入的人力物力大，無(wú)法滿足生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)需要。此發(fā)明只需把種子發(fā)芽三到四天后提取DNA，用已經(jīng)篩選好的SSR引物進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，“兩優(yōu)培九”種子純度的分子鑒定體系，應(yīng)用該體系可在5-7天內(nèi)完成未知樣品的檢測(cè)，(4)準(zhǔn)確率高SSR標(biāo)記(也稱(chēng)微衛(wèi)星標(biāo)記)在水稻基因組中廣泛存在，由于SSR標(biāo)記位點(diǎn)具有高水平的等位基因多樣性，表現(xiàn)為共顯性的孟德?tīng)栠z傳，簡(jiǎn)單重復(fù)序列長(zhǎng)度多態(tài)性很容易通過(guò)PCR快速擴(kuò)增和高分辨率的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。本發(fā)明在篩選的294對(duì)SSR引物中，有26對(duì)在雙親中表現(xiàn)出多態(tài)，為分子水平檢測(cè)種子純度提供了便利。通過(guò)進(jìn)一步篩選，最后確定采用二重PCR技術(shù)在一次反應(yīng)完成兩對(duì)引物的擴(kuò)增，從而增加了鑒定的可靠性。
(5)在2005年10月至2006年3月檢測(cè)的100多個(gè)兩優(yōu)培九種子樣品與海南鑒定結(jié)果非常吻合。
(6)實(shí)用簡(jiǎn)單本方法鑒定雜交水稻種子純度的整個(gè)程序，只是幾次機(jī)械式的加樣過(guò)程，易于操作，具有更好的商業(yè)化應(yīng)用前景。
(四)說(shuō)明書(shū)附1部分二重PCR擴(kuò)增的結(jié)果A.引物66&219號(hào)B.引物155&143號(hào)C.引物143&66號(hào)D.引物66&175號(hào)圖2本發(fā)明選定的兩對(duì)引物PCR擴(kuò)增的結(jié)果最后從四個(gè)組合中選取66號(hào)與175號(hào)這個(gè)組合來(lái)進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該組合的六條PCR擴(kuò)增產(chǎn)物編號(hào)為L(zhǎng)1-L6、分子量分別為130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp左右。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例一1)植物材料與育苗不同純度的兩優(yōu)培九(雜種F1)樣品3個(gè)，(樣品A、樣品B和樣品C的純度分別為99.3％、95％、85％)，所有種子均由江蘇省明天種業(yè)有限公司提供。將供試種子表面消毒后，浸種兩天(30℃)，催芽一天(28℃)后，播種在置有消毒石英砂的育苗盤(pán)中，在光照培養(yǎng)箱中(26℃)生長(zhǎng)3-5天后取樣，抽提DNA備用。
2)DNA提取取植物組織0.1g于1.5mLEp管中，先將組織搗碎，然后加100μL DNA提取緩沖液，65℃水浴15min，取出后在室溫放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板進(jìn)行PCR。
所用DNA提取緩沖液為C(Tris-HCL)＝100m moL(PH＝8.0)，C(NaCL)＝0.5mol/L，φ(TritonX-100)＝0.3％3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系0.2ml薄壁PCR反應(yīng)管中(三和耀華公司)，加1μL模板DNA(10ng/μL)，1μLSSR引物RM180(4pmol/μL)，1μLSSR引物RM7117(4pmol/μL)，0.2μLdNTP(2.5mM)，0.25μL Tag酶(上海鼎國(guó)公司)(2u/μL)，1.6ul PCR buffer，4.95μL無(wú)菌水，總體積10μL，混勻后于PCR擴(kuò)增儀(杭州博日)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；共40個(gè)循環(huán)94℃變性45s，55℃復(fù)性50s，72℃延伸1.5min；72℃延伸10min；4℃保存。
4)聚丙烯酰胺凝膠電泳按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)》(科學(xué)出版社1993年327-330頁(yè))方法，先用1％瓊脂糖封邊后，將8％的工作液灌入玻璃板空隙中(8％的凝膠工作液每100mL中10×TBE10mL，40％丙烯酰胺(19∶1)20mL，超純水70mL，TEMED 100μL，10％AP 1000μL)，插上梳子，等凝膠凝固后(約40分鐘)，往槽中倒入足以覆蓋住樣品孔的0.5×TBE緩沖液，拔出梳子，10μLPCR擴(kuò)增樣品中加入2μL染色劑，加樣2.5μL，170V電壓下電泳2小時(shí)。
銀染(100mL)固定(10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL)12min，滲透(0.2％AgNO3)12min，漂洗(100mL超純水)30s、(10％Na2S2O320μL)30s，顯色(1.5％NaOH，甲醛1mL)15min。
在膠片觀察燈下觀察結(jié)果在兩優(yōu)培九(F1)中擴(kuò)增得到6條分子量分別60bp和115bp、130bp、110bp、80bp、65bp不同的條帶(圖2)，母本培矮64S擴(kuò)增得到2條分子量分別60bp和115bp的條帶，父本9311擴(kuò)增得到4條分子量分別130bp、110bp、80bp、65bp的條帶，說(shuō)明兩優(yōu)培九(F1)中擴(kuò)增得到的6條條帶中2條分子量為60bp和115bp的條帶來(lái)自母本培矮64S，另外4條分子量為130bp、110bp、80bp、65bp的條帶來(lái)自父本9311，可以很清楚地區(qū)分“兩優(yōu)培九”雜種種子中混入的母本自交種子。通過(guò)計(jì)算，三批樣品A、B、C所測(cè)純度分別為99.3％、95％、85％，與田間結(jié)果一致。
實(shí)施例22005年10月份至2006年3月一共為本公司檢測(cè)種子樣品100個(gè)，每個(gè)樣品代表數(shù)量10000kg。具體操作方法供試種子表面消毒后，浸種兩天，催芽一天后，播種在置有消毒石英砂的育苗盤(pán)中，在光照培養(yǎng)箱中濕潤(rùn)生長(zhǎng)3-5天后取樣，用微量法快速提取植物DNA。微量法取植物組織0.1g于1.5mLEp管中，先將組織搗碎，然后加100μL DNA提取緩沖液，65℃水浴15min，取出后在室溫放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板進(jìn)行PCR。
所用DNA提取緩沖液為C(Tris-HCL)＝100m moL(PH＝8.0)，C(NaCL)＝0.5mol/L，φ(TritonX-100)＝0.3％PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系0.2ml薄壁PCR反應(yīng)管中(三和耀華)，加1μL模板DNA(10ng/μL)，1μLSSR引物RM180(4pmol/μL)，1μLSSR引物RM7117(4pmol/μL)，0.2μLdNTP(2.5mM)，0.25μL Tag酶(上海鼎國(guó))(2u/μL)，1.6ul PCR buffer，4.95μL無(wú)菌水，總體積10μL，混勻后于PCR擴(kuò)增儀(杭州博日)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃復(fù)性50s，72℃延伸1.5min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，；4℃保存；每個(gè)DNA模板每對(duì)引物，進(jìn)行兩次PCR重復(fù)。
聚丙烯酰胺凝膠電泳按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)》(科學(xué)出版社1993年327-330頁(yè))方法，先用1％瓊脂糖封邊后，將8％的工作液灌入玻璃板空隙中(8％的凝膠工作液每100mL中10×TBE10mL，40％丙烯酰胺(19∶1)20mL，超純水70mL，TEMED 100μL，10％AP 1000μL)，插上梳子，等凝膠凝固后(約40分鐘)，往槽中倒入足以覆蓋住樣品孔的0.5×TBE緩沖液，拔出梳子，10μLPCR擴(kuò)增樣品中加入2μL染色劑，加樣2.5μL，170V電壓下電泳2小時(shí)。
銀染(100 mL)固定(10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL)12min，滲透(0.2％AgNO3)12min，漂洗(100mL超純水)30s、(10％Na2S2O320μL)30s，顯色(1.5％NaOH，甲醛1mL)15min。
在膠片觀察燈下觀察結(jié)果在F1中擴(kuò)增得到6條電泳遷移率明顯不同的條帶(其中兩條來(lái)自母本，四條來(lái)自父本)，可以很清楚地區(qū)分“兩優(yōu)培九”雜種種子中混入的母本自交種子。其中2條分子量為60bp和115bp的條帶來(lái)自母本培矮64S，另外4條分子量為130bp、110bp、80bp、65bp的條帶來(lái)自父本9311，可以很清楚地區(qū)分“兩優(yōu)培九”雜種種子中混入的母本自交種子。最終確定兩優(yōu)培九種子的純度。
所得結(jié)果與海南鑒定結(jié)果比較統(tǒng)計(jì)為與海南結(jié)果差距在0.5％以下的有45個(gè)樣品；與海南結(jié)果差距在0.5％-1％的有51個(gè)樣品；與海南結(jié)果差距在1％-2％的有4個(gè)樣品。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)兩優(yōu)培九種子純度的引物，包括引物RM7117上游引物AGTTGGCTGGTTGCTACCAC下游引物AGGGTTCCCTGGCTACTCAC和引物RM180上游引物CTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG下游引物ACTTGCTCTACTTGTGGTGAGGGACTG
2.權(quán)利要求1所述引物用于檢測(cè)兩優(yōu)培九種子純度的方法，包括1)材料的準(zhǔn)備供試種子培苗至3-5cm高度；2)微量法提取植物DNA取上述種子幼苗0.1g于1.5mLEp管中，將幼苗搗碎后加100μL DNA提取緩沖液，65℃水浴15min，取出后在室溫放置片刻，取上清液1μL直接用做PCR模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所用DNA提取緩沖液為PH＝8.0的Tris-HCL為100m moL，NaCl為0.5mol/L，TritonX-100體積比為0.3％；3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系0.2ml薄壁PCR反應(yīng)管中，加1μL模板10ng/μL DNA，1μL 4pmol/μL SSR引物RM180，1μL 4pmol/μL SSR引物RM7117，0.2μL 2.5mMdNTP，0.25μL 2u/μL Tag酶，1.6ul PCR buffer，4.95μL無(wú)菌水，總體積10μL，混勻后于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)程序首先94℃預(yù)變性5min；然后40個(gè)循環(huán)94℃變性45s，55℃復(fù)性50s，72℃延伸1.5min；接著72℃延伸10min；最后4℃保存；4)聚丙烯酰胺凝膠電泳按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版》，科學(xué)出版社1993年327-330頁(yè)所述方法；5)銀染100mL10％乙醇10mL，0.5％冰乙酸0.5mL固定12min，0.2％AgNO3滲透12min，100mL超純水漂洗30s、10％Na2S2O320μL漂洗30s，1.5％NaOH，甲醛1mL顯色15min；6)確定純度觀察電泳結(jié)果，能擴(kuò)增得到6條分子量分別為130bp、115bp、110bp、80bp、65bp、60bp條帶的確定為兩優(yōu)培九種子，其余缺失或含有其他分子量的條帶均為混雜種子，通過(guò)計(jì)算即可獲得兩優(yōu)培九種子純度。
全文摘要
本發(fā)明檢測(cè)兩優(yōu)培九種子純度的引物及其方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專(zhuān)用于兩優(yōu)培九種子純度的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。以兩系雜交稻“兩優(yōu)培九”及其雙親的DNA為摸板，選擇兩對(duì)SSR引物組合后，在F
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1884577SQ20061001195
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者陳忠明, 胡興雨, 王建飛, 王偉明, 王州飛, 張紅生 申請(qǐng)人:江蘇明天種業(yè)科技有限公司, 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)