專利名稱：一種消化卵母細(xì)胞透明帶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種消化卵母細(xì)胞透明帶的方法。
背景技術(shù)：
透明帶是一均質(zhì)而明顯的半透膜，是由卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞形成的細(xì)胞間質(zhì)，可以被蛋白分解酶如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶所溶解。在哺乳動物卵裂球分離或胚胎細(xì)胞做供體核進(jìn)行克隆時(shí)均需要消化透明帶以獲得卵裂球。
目前取得卵裂球的方法主要有三種一種是用蛋白酶消化透明帶，然后用微管把胚胎分散成單個(gè)卵裂球；另一種方法是用尖銳的吸管穿過透明帶吸出胚胎中的卵裂球；第三種是用酸化法消化透明帶。酸化法(Tyrode’s，pH2.5)作用時(shí)間快，但要求操作迅速，時(shí)間過長所獲得的卵裂球容易裂解死亡，時(shí)間不夠時(shí)透明帶不能完全溶解；酶化法對卵裂球的體外發(fā)育沒有不利影響，但一定要掌握好處理?xiàng)l件和時(shí)間，而且利用酶消化透明帶的費(fèi)用較高，每克胰蛋白酶182.7美元。因此，上述方法均有不足之處。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明目的在于針對上述不足提供一種新的消化卵母細(xì)胞透明帶的方法。
(二)技術(shù)方案谷胱甘肽是一種小分子水溶性巰基，作為一種還原劑，可以反映細(xì)胞的抗氧化活性而成為細(xì)胞內(nèi)氧化還原的指示劑。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽溶于生理鹽水后，還原型谷胱甘肽被空氣中的氧所氧化生成氧化型谷胱甘肽，釋放出H+，多余的H+可降解透明帶糖蛋白基質(zhì)而達(dá)到消化透明帶的目的。
將卵母細(xì)胞置于谷胱甘肽制溶液中，適當(dāng)消化，即可去掉透明帶。谷胱甘肽溶液優(yōu)選為其生理鹽水溶液，這樣不易損傷細(xì)胞，其濃度為0.1～0.3g/mL。根據(jù)谷胱甘肽的濃度，其消化時(shí)間宜為0.5～7分鐘。優(yōu)選地，谷胱甘肽的濃度為0.2g/mL，消化時(shí)間為1分鐘。
(三)有益效果本發(fā)明應(yīng)用谷胱甘肽來消化卵母細(xì)胞透明帶，操作簡單，消化時(shí)間短，不易損傷細(xì)胞，并且成本低廉。


圖1為透明帶消化前卵母細(xì)胞示意圖；圖2為透明帶消化后卵母細(xì)胞示意圖；圖3為臺盼藍(lán)染色后卵母細(xì)胞示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不用來限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1 應(yīng)用谷胱甘肽消化卵母細(xì)胞透明帶谷胱甘肽的配制稱取1.00克還原型谷胱甘肽溶于5ml滅菌的生理鹽水中，分裝成小管后儲存于-20℃冰箱中備用。
操作將冷凍的谷胱甘肽溶液解凍，然后將卵母細(xì)胞置于谷胱甘肽溶液中，消化一分鐘后取出。
實(shí)施例2 應(yīng)用谷胱甘肽消化卵母細(xì)胞透明帶將卵母細(xì)胞置于新鮮制備的0.1g/mL谷胱甘肽溶液中，消化7分鐘后取出。
實(shí)施例3 應(yīng)用谷胱甘肽消化卵母細(xì)胞透明帶將卵母細(xì)胞置于新鮮制備的0.3g/mL谷胱甘肽溶液中，消化0.5分鐘后取出。
實(shí)施例4 去除透明帶的卵母細(xì)胞死活鑒定臺盼藍(lán)常用于鑒定細(xì)胞的死活，細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，喪失原有功能及增殖能力，可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色；如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞。
將去除透明帶的卵母細(xì)胞置于臺盼藍(lán)染色液中染色一分鐘，后用PBS pH 7.4洗滌2～3次，在顯微鏡下觀察膜的完整性。結(jié)果表明卵母細(xì)胞未被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色，說明卵母細(xì)胞膜仍保持完整性，即使用谷胱甘肽溶液消化透明帶后并沒有對膜造成損傷(圖1、圖2及圖3)。
臺盼藍(lán)染液配制稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。使用時(shí)，用PBS(pH 7.4)稀釋母液至0.4％(v/v)即可。
權(quán)利要求
1.一種消化卵母細(xì)胞透明帶的方法，其特征在于，將卵母細(xì)胞置于谷胱甘肽溶液中進(jìn)行消化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，谷胱甘肽溶液為0.1～0.3g/mL的生理鹽水溶液，消化時(shí)間為0.5～7分鐘。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，谷胱甘肽溶液為0.2g/mL的生理鹽水溶液，消化時(shí)間為1分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種消化卵母細(xì)胞透明帶的方法。所述的方法是將卵母細(xì)胞置于谷胱甘肽溶液中進(jìn)行消化。本發(fā)明利用谷胱甘肽來消化透明帶，操作簡單，消化時(shí)間短，不易損傷細(xì)胞，并且成本低廉。
文檔編號C12N5/08GK101082040SQ200610012029
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月29日
發(fā)明者田見暉, 成文敏, 安磊 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)