專利名稱：一種β－葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種玉米β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病害給農(nóng)作物生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的影響，人類與植物病害的斗爭貫穿于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的始末。興起于20世紀(jì)初期的經(jīng)典遺傳學(xué)使人們能夠通過雜交育種成功地培育出新抗病作物品種，大幅度地提高糧食產(chǎn)量。近年來，分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，植物遺傳分析和遺傳工程技術(shù)的不斷革新，使人們不但能夠從分子水平上進(jìn)一步研究植物與病原菌的相互作用機(jī)制，而且還可以通過基因工程這一現(xiàn)代生物技術(shù)直接、快速和高效地培育新抗病作物品種。植物抗病基因工程指的是用基因工程(遺傳轉(zhuǎn)化)的手段提高植物的抗病能力，并獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法。自從1992年克隆到第一個(gè)抗病基因(Hm1)(JOHALGS，BRIGGS SP.Reductase activity encoded by the HM1 diseaseresistance gene in maize.Science，1992，258985-987)，人們已經(jīng)克隆得到了上百個(gè)抗病相關(guān)基因，這些抗病基因大多數(shù)由異源組成型啟動(dòng)子(如CaMV 35S)驅(qū)動(dòng)在植物中組成型表達(dá)，這樣的表達(dá)可以達(dá)到抗病的效果。但是由于在一些非必要組織中大量表達(dá)外源蛋白，不僅無謂消耗植物體內(nèi)的能源，增加植物生長負(fù)擔(dān)，影響植物本身的優(yōu)良性狀，而且過多的在作物食用組織中積累抗性蛋白(大多數(shù)抗性蛋白是毒性蛋白)增加了轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)，引起更大的轉(zhuǎn)基因生物安全爭論。因此，現(xiàn)今植物抗病基因工程迫切需要合適的啟動(dòng)子，使植物抗病基因能在植物特定的發(fā)育階段和部位表達(dá)。植物基因工程中常用的啟動(dòng)子按其作用方式及功能可分為三類組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子，可以使基因的表達(dá)僅限于某些特定的器官或組織部位，并降低對植物的負(fù)面影響。在有些時(shí)候，如果用組織特異性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)抗病基因在特定的時(shí)候或地方特異性的表達(dá)，不僅可以達(dá)到抗病的目的，還能減少對植物本身優(yōu)良性狀的沖擊并降低轉(zhuǎn)基因安全性風(fēng)險(xiǎn)。
近年來，玉米苗期病害越來越嚴(yán)重，已由過去的次要病害上升為主要病害。一般年份平均發(fā)病率約為10％，重病田塊往往缺苗30％～50％，形成矮化不育株甚至毀種而減產(chǎn)(晉齊鳴，駢躍斌，宋淑云，李紅，沙洪林，張偉.玉米苗期病害診斷與防治技術(shù)研究.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(4)355～359)。玉米苗期病害可初步分為侵染性和非侵染性病害。非侵染性病害主要包括缺素癥、環(huán)境脅迫和藥害等因素引起的病害。使用優(yōu)良品種，加強(qiáng)田間管理等農(nóng)業(yè)技術(shù)措施即可以控制非侵染性病害。侵染性病害主要是受病原菌(致病真菌、細(xì)菌、病毒)侵入引起，主要病原菌有禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)、串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)、玉米圓斑離蠕孢菌(Helminthosporiumcarbo2num)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、串珠鐮孢菌膠孢變種(Flmoniliforme varlsubglutinans)、絲軸團(tuán)散黑粉菌(Sporisoriumreilianum)和玉米假單胞桿菌(Pseudomonas zeae Hsia et Fang)等。對于侵染性病害，傳統(tǒng)上一般采用種衣劑處理來防治，這樣要消耗大量的人力物力。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)為人類提供了一個(gè)廉價(jià)的方法。玉米苗期的侵染性病害大多是從根部侵入。土壤中存在著大量的病原菌，肥料中也存在病原菌，有時(shí)種子自身亦帶有病原菌，這些病原菌在種子萌發(fā)后通過根系侵入植株，如腐霉菌、串珠鐮刀菌和絲核菌等。另外有些苗期蟲害也是根系蟲害，如地老虎。因此應(yīng)用基因工程技術(shù)提高玉米苗期抗病性的重點(diǎn)在于保護(hù)根系。
至今分離和研究過的植物組織特異性啟動(dòng)子多達(dá)上百種，植物的許多組織中如根、葉、花粉、維管束和種子等都先后分離到了能組織特異性驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的啟動(dòng)子，但是特異在苗期強(qiáng)烈表達(dá)、特別是在根中強(qiáng)烈表達(dá)的啟動(dòng)子還未見報(bào)道。
ZmGLU1是一種能特異性水解細(xì)胞分裂素β-葡萄糖苷復(fù)合體并釋放活性細(xì)胞分裂素的酶。它特異性的分布在細(xì)胞分裂旺盛的組織中，特別是在細(xì)胞分裂旺盛的苗期含量非常高，因此，該基因的啟動(dòng)子可能在玉米苗期具有很高的活性。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明所提供的β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子，是玉米體內(nèi)細(xì)胞分裂素動(dòng)態(tài)平衡過程中活化糖苷細(xì)胞分裂素的β-葡萄糖苷酶ZmGLU1基因的啟動(dòng)子。具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列的啟動(dòng)子命名為ZmGLU1P，由1907個(gè)堿基組成。
本發(fā)明還包括含有β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子的載體、所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(包括動(dòng)植物細(xì)胞系和宿主菌)。
(三)有益效果本發(fā)明β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子，可啟動(dòng)報(bào)告基因gusA基因在除了成熟種子外的其它組織中高效表達(dá)。特別是在幼苗的根中活性最高，比CaMV 35S啟動(dòng)子還強(qiáng)，說明它能使目的基因在植物的大部分組織中特別是幼苗的根中高效表達(dá)，但在成熟種子中微量表達(dá)，既可達(dá)到轉(zhuǎn)基因提高植物抗性的目的，又可減少外源蛋白在種子中的積累，從而減少對轉(zhuǎn)基因植物種子品質(zhì)的影響。該啟動(dòng)子將在植物抗病和轉(zhuǎn)基因玉米種子改良中發(fā)揮重要作用。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增得到的用于篩庫的片段的電泳圖譜；圖2A為第一輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描圖；圖2B為第二輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描圖；圖2C為第三輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描圖；圖2D為驗(yàn)證第三輪篩選得到的單克隆雜交顯影的X光片掃描圖；圖3A為lambda DNA的酶切電泳圖譜；圖3B為lambda DNA酶切后的雜交圖譜；圖4A為ZmGLU1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS酶在轉(zhuǎn)基因煙草各個(gè)組織中的活性比較以及與CaMV 35S驅(qū)動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS酶活性比較圖；圖4B為ZmGLU1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS酶在轉(zhuǎn)基因煙草果實(shí)成熟和種子萌發(fā)過程中的活性變化圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不用來限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。
實(shí)施例中所涉及到的數(shù)量詞×溶液表示的是多少倍濃度的該溶液，例如“20×SSC”表示20倍濃度的SSC，在使用時(shí)需要將其稀釋，比如使用時(shí)是“2×SSC”表示的是將上述溶液稀釋了10倍使用；所述的單位M表示mol/L。
材料的準(zhǔn)備1、菌株與質(zhì)粒大腸桿菌(E.coli)DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404均購自博大公司、λ噬菌體的宿主菌LE392購自Clontech公司。
2、工具酶及生化試劑各種限制性內(nèi)切酶和pGEM-T Easy載體試劑盒購自Promega公司；普通Taq酶和Trizol RNA小量提取試劑盒購自天根公司；ExTaq酶購自Takara公司；dNTP混合物購自上海生工；T4 DNA連接酶購自Promega公司；萘乙酸(NAA)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、鏈霉素(Sm)和噻孢霉素(Cef)購自欣經(jīng)科公司；同位素α-32P dCTP購自北京亞輝生物公司；尼龍膜購自Amersham公司；4-甲基傘型酮(4-MU)和4-甲基傘型酮酰-β-葡萄糖醛酸酐酶(4-MUG)均購自上海生工。
3、培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基(1升)10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，pH7.0LB固體培養(yǎng)基(1升)1升液體LB培養(yǎng)基加15g瓊脂YEB液體培養(yǎng)基(1升)1g酵母提取物，10g蛋白胨，0.5gMgSO4·7H2O，5g蔗糖，pH 7.5YEB固體培養(yǎng)基(1升)1升YEB液體培養(yǎng)基加15g瓊脂MS基本培養(yǎng)基(1升)MS大量元素，MS微量元素，MS有機(jī)物，各組份的基本成分參照Murashige，T&Skoog，F(xiàn).在1962年發(fā)表的MS培養(yǎng)基成分(Murashige，T&Skoog，F(xiàn). A revised medium for rapidgrowth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol.Plant.1962，15473-497)MS鹽溶液只含有MS大量元素和微量元素MS固體培養(yǎng)基1升MS基本培養(yǎng)基中加30g蔗糖，8g瓊脂，pH5.6-5.8煙草分化固體培養(yǎng)基1升MS基本培養(yǎng)基中加30g蔗糖，8g瓊脂，3mg 6-BA，0.2mg NAA，pH 5.6-5.8煙草誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基1升MS基本培養(yǎng)基加30g蔗糖，8g瓊脂，pH5.6-5.84.篩選基因組文庫所需溶液1)20×SSC175.3gNaCl(3.0M)88.2g 檸檬酸三鈉(0.3M)用NaOH調(diào)pH至7.0，定容至1升，室溫保存?zhèn)溆谩?br> 2)20×SSPE175.3gNaCl(3.0M)27.6g 磷酸二氫鈉(0.2M)40ml 0.5M EDTA(終濃度0.02M)用NaOH調(diào)pH至7.4，定容至1升，室溫保存?zhèn)溆谩?br> 3)50×Denhardt液5.0g聚蔗糖(Ficoll)5.0g聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)5.0gBSA(組分V)加水定容至500ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)20％SDS
5)10×lambda稀釋緩沖液58.3g NaCl(0.1M)24.65gMgSO4·7H2O(0.1M)350ml 1.0M Tris-HCl(pH7.5)(終濃度0.35M)加水定容至1000ml。
5.PCR引物Probe-F5′-ACCTAGTAGGACCCAACAATGAGAG-3′Probe-R5′-CTCTTATCTAGGAAGCCGCCGTAC-3′P1735-F5′-CCGTCTAGAGGTGGAAATATCTTCTCAAGC-3′P1735-R5′-TCCATGGCCCCCCCTTTGCT-3′GUS-F5′CAGGAAGTGATGGAGCATCAG3′GUS-R5′TCGTGCACCATCAGCACGTTA3′以上引物均由上海生工合成。
實(shí)施例1玉米β-葡萄糖苷酶基因ZmGLU1基因5’側(cè)翼序列的克隆一、探針的制備根據(jù)GenBank中ZmGLU1基因的cDNA序列(Accession No.X74217)設(shè)計(jì)一對引物(Probe-F和Probe-R)。用Trizol RNA提取試劑盒提取萌發(fā)4天的玉米幼苗總RNA，提取步驟按試劑盒說明書提供的方法操作。以提取的玉米幼苗總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
取1μL Oligo(dT)18加到10μL濃度為200ng/μL的總RNA溶液中，70℃，5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘，然后加入以下成分試劑 體積5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液(試劑盒中提供) 5μLdNTP混合物(每種10mM) 2.5μLRNasin核糖核酸酶抑制劑(濃度為50U/μL) 1μL
AMV反轉(zhuǎn)錄(30U/μL)3μLDEPC處理水定容至25μL參照Promega公司AMV Reverse Transcriptase使用說明書設(shè)定如下的反應(yīng)條件25℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min，冰浴2min。然后以合成的cDNA第一鏈為模板，以Probe-F和Probe-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體系為試劑 體積10×緩沖液 (試劑盒中提供) 5μLdNTP混合物 (每種10mM) 1μL引物Probe-F(濃度為10μM) 1μL引物Probe-R(濃度為10μM) 1μLEx-Taq (5U/μL)1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (濃度為10ng/μL)5μL滅菌水 定容至50μL反應(yīng)條件94℃ 5min；94℃ 1min，53℃ 30s，72℃ 1min(7個(gè)循環(huán))；94℃ 1min，59℃ 30s，72℃ 1min(30個(gè)循環(huán))；72℃ 7min；4℃ 保存。
將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，表明擴(kuò)增得到一條500bp左右的片段，將此片段作為篩選玉米基因組文庫的探針。圖1中，左邊泳道為1kb ladder marker；中間泳道為目的片段；右邊泳道為負(fù)對照。
二、篩選玉米基因組文庫得到ZmGLU1基因5’側(cè)翼序列1、玉米基因組文庫玉米基因組文庫購自Clontech公司，目錄號為FL1032D。
2、文庫滴度的測定1)挑取一個(gè)宿主菌(LE392)的單斑于10ml LB液體培養(yǎng)基(含10mM MgSO4、0.2％麥芽糖)中，在200rpm、37℃條件下振蕩過夜，使OD600達(dá)2.0左右。
2)文庫噬菌體的稀釋a.從購買的玉米基因組文庫中取2μLλ噬菌體原種加到1ml 1×lambda稀釋緩沖液中(稀釋比為1∶500)。
b.從上述稀釋緩沖液中取出20μL加到980μL 1×lambda稀釋緩沖液中(稀釋比為1∶50)。
c.在六支試管加入100μL 1×lambda稀釋緩沖液，200μL宿主菌，然后分別加入稀釋噬菌體緩沖液(步驟b所得)0μL、5μL、10μL、50μL、100μL和250μL。
3)、將上述六管在37℃水浴20分鐘左右。
4)、然后加4ml溶解的0.7％LB頂層培養(yǎng)基(50℃左右)，充分混勻后鋪到15％LB固體平板上，快速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平板。
5)、室溫靜置10分鐘，待頂層培養(yǎng)基凝固后，在37℃倒置培養(yǎng)6-7hr.。
6)、統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板上長出的噬菌斑個(gè)數(shù)，根據(jù)下面的公式計(jì)算文庫的滴度(pfu/ml)
將六個(gè)平板測得的滴度求平均值為8.22×108pfu/ml。文庫的滴度大于108pfu/ml，所以該文庫可以用于篩選。
3、用DNA探針篩選文庫1)鋪板宿主菌的準(zhǔn)備；接種λ噬菌體的宿主菌LE392單菌落于LB液體培養(yǎng)基(MgSO410mM，麥芽糖0.2％)，37℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0，取出備用。
2)λ噬菌體侵染宿主菌及鋪板取15ml溶化的頂層培養(yǎng)基加到侵染后的噬菌體和宿主菌的混合物中，充分混勻，迅速均勻地鋪在預(yù)先準(zhǔn)備好的1.5％LB固體平板上。室溫靜置10分鐘，待頂層培養(yǎng)基凝固后，在37℃倒置培養(yǎng)5-8hr.。當(dāng)噬菌體長到不同噬斑間邊緣剛彼此接觸時(shí)，取出平板放于4℃，以備后面的轉(zhuǎn)膜。
3)噬菌斑原位吸附固定至尼龍膜a.剪取適當(dāng)大小(比培養(yǎng)皿略小)的尼龍膜。在每張膜上剪三個(gè)不對稱的缺口，并用鉛筆在膜上標(biāo)號。
b.將與平板編號相同的膜輕輕放到平板培養(yǎng)基上，盡量不產(chǎn)生氣泡。
c.用滅菌牙簽插在預(yù)先在膜上剪好的三個(gè)不對稱缺口處，作為膜回位標(biāo)記。2分鐘后用無菌鑷子小心地揭起尼龍膜，吸附有噬菌體的一面朝上，放于干凈濾紙上，室溫晾干。
d.將晾干的膜分別在變性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl pH8.0)中分別放5min。然后轉(zhuǎn)到2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸三鈉)中漂洗一下，把膜放到干凈濾紙上，室溫晾干。
e.80℃，烘膜2hr.，用保鮮膜包好后放于4℃?zhèn)溆谩?br> 4)預(yù)雜交按以下成分配制預(yù)雜交液

預(yù)雜交液配制好后，將保存于4℃的膜取出放入預(yù)雜交液中，42℃，40rpm，預(yù)雜交4hr.以上。
5)標(biāo)記探針取4μL濃度為20ng/μL的DNA探針加入26μL水中，在沸水中變性5min，接著冰浴5min，然后依次加入以下成分5×標(biāo)記緩沖液(試劑盒中提供)10μLdATP、dGTP、dTTP(每種1.5mM)2μLBSA(10mg/ml) 2μLKlenow片段(5U/μL) 1μLα-32P-dCTP(10μCi/μL)5μL加入上述成分后，在37℃標(biāo)記4hr.左右。其中，5×標(biāo)記緩沖液的成分如下250mM Tris-HCL(pH8.0)、25mM MgCl2、10mM DTT、1M HEPES(pH6.6)和6堿基隨機(jī)脫氧核苷酸引物。
6)雜交將標(biāo)記好的探針在沸水中變性10min，在冰上迅速冷卻后加入預(yù)雜交液中。在42℃，40rpm條件下雜交16-20小時(shí)。
7)洗膜和壓X光片以及陽性克隆的挑選雜交結(jié)束后，加入洗膜緩沖液1(2×SSC，0.5％SDS)，42℃，40rpm洗1hr.。然后再分別用緩沖液2(1×SSC，0.1％SDS)和緩沖液3(0.2×SSC)，65℃，40rpm各洗1hr.。洗膜結(jié)束后，用干凈濾紙吸去膜上的大部分液體，然后用保鮮膜將膜包裹后壓在X光片之下。根據(jù)X光片上影像在膜上標(biāo)出陽性斑的位置。然后再將膜放入對應(yīng)編號的培養(yǎng)平板上，缺口和平板上的牙簽對齊。根據(jù)膜上的標(biāo)號挑出含陽性斑的培養(yǎng)基放入1.5ml離心管中，加入1ml滅菌1×lambda稀釋液，室溫放置1-2hr.，使噬菌體從培養(yǎng)基上擴(kuò)散出來，然后12000rpm離心10分鐘，收集上清液，用于下一輪篩選。經(jīng)過3輪篩選和驗(yàn)證，共得到7個(gè)陽性單克隆(圖2A-圖2D)。
4、λ噬菌體DNA提取1)將7個(gè)陽性單克隆分別鋪板，每個(gè)陽性克隆鋪兩個(gè)200mm平板。當(dāng)每個(gè)平板的表面幾乎完全被噬菌斑覆蓋時(shí)，取出平板并直接加入15ml的lambda稀釋緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO4)，室溫放置1-2hr.，使噬菌體從上層培養(yǎng)基中擴(kuò)散出來。
2)將lambda稀釋緩沖液從培養(yǎng)皿中移入50ml離心管中，4℃，8000rpm離心20min，除去細(xì)菌碎片。
3)將上清移入一新的離心管中，加入RNaseA(終濃度為2μg/ml)，DNase(終濃度為1μg/ml)，37℃消化30min。
4)加PEG8000(終濃度為10％)，NaCl(終濃度為1M)于lambda稀釋緩沖液中，充分混勻，冰浴1hr.以上。
5)4℃，11000rpm，離心10min。棄上清，收集管壁上噬菌體顆粒。
6)加1ml 1×lambda稀釋緩沖液重懸噬菌體，并將重懸后噬菌體分裝到1.5ml離心管中(500μL/管)。向每管中加RNaseA至終濃度1μg/ml，DNaseI至終濃度5μg/ml，37℃消化20min。
7)加EDTA至終濃度20mM，終止酶反應(yīng)；然后加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，破壞噬菌體外殼蛋白，同時(shí)將RNase A和DNase消化掉，加SDS至終濃度0.5％，65℃水浴1小時(shí)。
8)等體積苯酚、氯仿抽提兩次，氯仿抽提一次。
9)上清加入等體積的異丙醇，沉淀lambda DNA。
10)70％乙醇洗滌沉淀，抽干后溶于適量TE緩沖液，取少量電泳檢測，其余-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 5、Lambda噬菌體DNA酶切分析與亞克隆片段測序取7個(gè)陽性克隆中的1個(gè)λ噬菌體DNA用多種酶進(jìn)行單酶切和雙酶切分析，它們的組合如下1.Sal I/XbaI，2.Sal I/Kpn I，3.Sal I/HindIII，4.Sal I/BamH I，5.Sal I/EcoRV，6.EcoR I，7.BamH I，8.Sal I，9.HindIII，10.Sal I/Sma I。
單酶切體系10×緩沖液(試劑盒中提供) 5μLLambda DNA30μL限制性內(nèi)切酶 6μL滅菌水定容至50μL。
雙酶切體系10×緩沖液(試劑盒中提供)5μL
Lambda DNA30μL限制性內(nèi)切酶I 5μL限制性內(nèi)切酶II5μL滅菌水定容至50μL。
將酶切產(chǎn)物電泳、轉(zhuǎn)膜后用篩選文庫的探針進(jìn)行雜交，具體步驟如下1、電泳及轉(zhuǎn)膜1)將酶解完全的DNA每管加入5μl 10×loading buffer(70％甘油，0.5×TBE，0.2％SDS，20mM EDTA，0.2％溴酚藍(lán))，混勻。樣品于1×TAE(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA)電泳緩沖液，0.8％瓊脂糖凝膠，在40cm電泳槽中100v電壓下使得所有樣品從點(diǎn)樣孔進(jìn)入凝膠，然后在30v恒壓下，電泳16hr.。
2)將電泳后的凝膠切去多余膠邊，并切一小角以表明方向，置于0.25M HCl中輕搖15min。
3)將一磁盤加入0.4M NaOH溶液，架上一塊玻璃板，上放4層寬于凝膠的吸水紙，兩頭浸于液體中，濾紙間不能有氣泡。
4)膠用蒸餾水沖洗后，點(diǎn)樣孔向下置于濾紙之上，排盡其間氣泡，膠塊四周放好隔水條。
5)剪長寬比膠塊大1mm的尼龍膜(Hybond-N+，Amersham)，置于0.4M NaOH中均勻浸透后鋪于膠上，再鋪上四張與膜相同大小的濾紙，其間均不能有氣泡。
6)加數(shù)層紙巾，其上壓一塊玻璃板及750g重物，吸印20～24小時(shí)。
7)吸印完畢后，用鉛筆做標(biāo)記，2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸，pH7.0)浸泡10分鐘。
8)將膜移至濾紙上，超凈臺(tái)吹干。
9)將膜夾于濾紙和兩塊玻璃之間，于80℃烘箱中烘1～2小時(shí)，用保鮮膜包裹，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、雜交轉(zhuǎn)膜完畢之后的雜交方法與篩選玉米基因組文庫時(shí)所用的雜交方法完全相同，雜交所用的探針也是篩選文庫時(shí)所用的探針。酶切結(jié)果如圖3A所示，酶切結(jié)果表明所用的幾種限制性內(nèi)切酶對λ噬菌體DNA的酶切都比較完全，不同大小的條帶基本都已分開。酶切片段的雜交結(jié)果如圖3B所示，根據(jù)已知的ZmGLU1基因cDNA序列可知在距起始密碼子2.1kb處有一SalI切點(diǎn)，要得到5’側(cè)翼序列至少大于2kb，并且盡可能長些，但太長了又不容易做亞克隆，故選取1.Sal I/Xba I雙酶切的約4kb陽性條帶(箭頭所示)回收并亞克隆到pGEM-3Zf(-)的SalI和XbaI酶切位點(diǎn)之中，由聯(lián)合基因公司完成此4kb序列中的5’端的約2kb的測序，測序結(jié)果表明該2kb片段全長為1907bp，其中有1735bp是ZmGLU1基因起始密碼ATG上游的5’側(cè)翼序列，另外的172bp序列為ZmGLU1基因序列。將1907bp的序列提交GenBank中進(jìn)行比對，其中3’端172bp序列與ZmGLU1 cDNA序列同源性為100％，5’端序列未發(fā)現(xiàn)任何同源序列。說明所得到的1735bp序列確為ZmGLU1基因的5’側(cè)翼序列，并且是新發(fā)現(xiàn)的序列。
實(shí)施例2、ZmGLU1啟動(dòng)子的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草一、ZmGLU1啟動(dòng)子的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建1、從ZmGLU1基因5’側(cè)翼序列中擴(kuò)增ZmGLU1啟動(dòng)子根據(jù)測序得到的ZmGLU1基因的5’側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了2條引物P1735-F和P1735-R。以連接在測序載體上的4kb序列為模板，通過PCR擴(kuò)增方法從ZmGLU1基因5’側(cè)翼序列中擴(kuò)增出一條1735bp左右的片段。
擴(kuò)增體系10×緩沖液(試劑盒中提供) 5μLdNTP混合物(每種10mM) 1μLP1735-F(10μM)1μLP1735-R(10μM)1μLTaq酶(5U/μL) 0.5μL模板(濃度為10ng/μL) 0.5μL滅菌水定容至50μL擴(kuò)增條件為94℃ 5min94℃ 1min，55 ℃ 30s，72℃ 2min(30個(gè)循環(huán))72℃ 10min4℃保存。
將用引物P1735-F與P1735-R擴(kuò)增得到的片段命名為ZmGLU1P(序列1，1735bp)。
將擴(kuò)增出的ZmGLU1P片段連接到pGEM-T Easy測序載體上。測序結(jié)果與所得的1907bpZmGLU1基因的5’側(cè)翼序列比較，一致性為100％，表明擴(kuò)增沒有出現(xiàn)錯(cuò)配。
2、真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)引物P1735-F和P1735-R兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用XbaI和NcoI將ZmGLU1P片段從pGEM-T Easy載體切下，把酶切后回收的ZmGLU1P片段與經(jīng)XbaI和NcoI酶切的pCAMBIA3301載體片段相連。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a菌株中，提取質(zhì)粒DNA，用XbaI和NcoI酶切鑒定。將構(gòu)建好的載體命名為p3301-ZmGLU1P。
二、轉(zhuǎn)化煙草大量提取構(gòu)建的表達(dá)載體(p3301-ZmGLU1P)的質(zhì)粒DNA，取20μL(約1μg)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在28℃、YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素Kan 100μg/ml，鏈霉素Sm 125μg/ml)上培養(yǎng)兩天。各挑選兩個(gè)克隆做菌液PCR鑒定，均擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
將含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種于YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素100μg/ml，鏈霉素125μg/ml)，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，室溫離心10分鐘(4000rpm)。沉淀用MS鹽溶液(pH7.0)懸浮，并稀釋至原體積的30倍。取煙草無菌苗葉片，切去葉片邊緣和主脈，將葉片切成約0.4×0.6cm2左右大小，放入制備好的菌液中浸泡5-10min，用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入表面鋪有一層濾紙的MS固體培養(yǎng)基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，pH 5.8)中，28℃暗培養(yǎng)。三天后，轉(zhuǎn)入MS篩選培養(yǎng)基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，含卡那霉素100μg/ml，噻孢霉素250μg/ml，pH 5.8)中，28℃光照培養(yǎng)，每日光照12-16小時(shí)。每2周繼代一次，每次將變黃的葉片或愈傷組織丟掉，大的愈傷組織切割成小塊，經(jīng)2-3次繼代后，培養(yǎng)的愈傷組織陸續(xù)分化出幼苗。將幼苗轉(zhuǎn)移入罐頭瓶裝的MS固體培養(yǎng)基(含卡那霉素100μg/ml，鏈霉素125μg/ml，pH 5.8)中，28℃光照培養(yǎng)，待其根系發(fā)育完全后，移栽到溫室中。
實(shí)施例3、煙草轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測及ZmGLU1P啟動(dòng)子活性的檢測一、煙草轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測1、煙草總DNA小量提取取煙草幼嫩葉片150mg左右于1.5ml離心管中，研成粉末。加800μL 65℃預(yù)熱的SDS裂解緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，0.5M NaCl，1％SDS)，振蕩混勻。65℃水浴20分鐘，加入250μL 5MKAc，冰浴5分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘。取上清于另一1.5ml離心管中，4℃、12000rpm再離心5分鐘。將上清轉(zhuǎn)入另一干凈離心管，加 600μL異丙醇，充分混勻，4℃ 12000rpm離心15分鐘。最后用70％乙醇清洗沉淀2次，真空干燥后，加80μL滅菌重蒸水溶解DNA。
2、PCR檢測根據(jù)gusA基因的序列設(shè)計(jì)一對引物GUS-F和GUS-R，用這對引物檢測用SDS法提取的轉(zhuǎn)基因煙草DNA。其中，PCR反應(yīng)體系組成如下10×緩沖液 2.5μLdNTP混合物(每種10mM) 0.5μLP45F(濃度為10μM)0.5μLP46R(濃度為10μM)0.5μLTaq酶(濃度為5U/μL) 0.5μL轉(zhuǎn)基因煙草總DNA(濃度為20ng/μL) 1μL滅菌水 定容至25μL。
PCR檢測結(jié)果表明陽性煙草植株與待檢測煙草植株的株數(shù)比為74％。
二、β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子活性的檢測將PCR檢測結(jié)果為陽性的煙草植株，提取其6-8片葉小苗的根、莖、莖基和葉，花的萼片、花瓣、花柄、雌蕊和雄蕊，完全伸張開的成熟葉片，開花后20天的未成熟種子和成熟種子的總蛋白，定量檢測gusA基因編碼蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，分析ZmGLU1P的組織特異性驅(qū)動(dòng)活性。取開花后0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50天的果實(shí)和萌發(fā)后0，1，2，3，4，5，6，7，9，11，13，15天的種子(幼苗)的總蛋白，定量檢測gusA基因編碼蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，分析ZmGLU1P在果實(shí)發(fā)育和種子萌發(fā)過程中的驅(qū)動(dòng)活性變化。具體步驟如下1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用反應(yīng)終止液(0.2mol/L Na2CO3)將4-MU(4-甲基傘形酮)配制成0.00、6.25、12.50、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00pmol的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，通過測定它們的熒光強(qiáng)度，作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、總蛋白提取與蛋白濃度的測定1)取0.1g材料于1.5ml離心管中，加入液氮，研成粉末。
2)加600μL酶提取液(0.05M pH7.0磷酸緩沖液，0.1％SDS，0.01MpH8.0 EDTA，20％甲醇，0.1％Triton X-100，0.1％巰基乙醇)，在13000rpm 4℃離心10min，取上清于一新的離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3)取上清，用考馬斯亮藍(lán)G250法測定蛋白的含量。
3、β-葡萄糖苷酸酶的酶促反應(yīng)及其熒光定量1)取50μL含GUS的上清，加入到450μL 37℃預(yù)熱的檢測液(2mmol/L 4-MUG溶液)中，迅速充分混勻。
2)立刻取出50μL加入到950μL反應(yīng)終止液(0.2mol/L Na2CO3)，將該管作為酶促反應(yīng)的0點(diǎn)。
3)分別在10min、20min、30min、45min和60min從反應(yīng)液中取出50μL，轉(zhuǎn)入950μL的反應(yīng)終止液中。
4)酶促反應(yīng)結(jié)束后，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長365nm、發(fā)射波長455nm下，測定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值。
5)根據(jù)測定的熒光值以及參與反應(yīng)的總蛋白，求出GUS活性，GUS活性＝單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)生成的MU/蛋白量(單位nmol4-MU.min-1.mg-1蛋白)。
β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)活性測定及與CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的β-葡萄糖苷酸酶活性比較結(jié)果如圖4所示，表明(1)ZmGLU1基因起始密碼子ATG上游1907bp的序列(ZmGLU1P)足以啟動(dòng)報(bào)告基因gusA表達(dá)。(2)ZmGLU1P驅(qū)動(dòng)的gusA基因在小苗的根中表達(dá)活性最強(qiáng)，比35S啟動(dòng)子在相同組織中的驅(qū)動(dòng)活性強(qiáng)大約3倍，在葉、葉柄、莖、雄蕊、花柄、萼片中的活性比35S稍低，但在成熟種子中的表達(dá)量卻只有35S啟動(dòng)子在成熟種子中的1/30，是它本身在未成熟種子中的1/50，萌發(fā)的幼苗的1/300(圖4A)。(3)開花后10天內(nèi)啟動(dòng)子在果實(shí)中活性變化不明顯，隨后隨著果實(shí)的發(fā)育，啟動(dòng)子活性急劇下降，到35天的時(shí)候下降到非常低的水平，大概是開花期的五十分之一。而隨著種子的萌發(fā)，啟動(dòng)子活性又很快升高，萌發(fā)11天后的幼苗中活性達(dá)到最高，是成熟種子的300倍(圖4B)。以上結(jié)果充分說明ZmGLU1P啟動(dòng)子是一個(gè)在小苗根中和幼苗中表達(dá)活性很強(qiáng)，但在成熟種子特異性微量表達(dá)的啟動(dòng)子。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用<130>
<160>1<170>Patent In version 3.3<210>1<211>1907<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>1atgtatgcct ctgcaatgga agcctcaatt ttgcatttat ttctacattt ctttcgaata 60gtatttagac atctctcgat tggatagcac caacgtccct gcactggccc cccattcgtg120cctcataggg gagatgaaga atcaaatgct gcattggatt gaagaagcca ggtggaaata180tcttctcaag ctcacggcca tgtttagtga tcattttcaa atttcgagta catatgatat240catgacatgt ggataagtgg acaagtttca tgattttcaa attttatcac agctttctcg300aaacattttc aaaattttta ttacagcctg tacatatgat atcatgacac gtggacaagt360ttcatgattt tctgactttg tttgtatttt atataatttt taaacatgta gatggcaagt420tcacggccat gtttagtgag catgttgctc gaagtttctg gtccgctcct gaaatcggtc480gtaacttatg ctaagtaaca tgaatatcat ttttgcatga acggtttttc aagtttcgag540tgacctgcag ttcaaatctg gattttccgg agaaattcaa ataaacgaat taaatctact600aacgattgaa aactctgtta taattgtcca caaatgatac atgtaggttt acatagtgca660ggaatatacc acaaaaagtt tgggagacaa aatctaaaaa ataaaaatat gctttgccga720gtgtccaagg aagacactcg gcaaagagtt ctttgccgag tgccaaccat cggccctcgg780
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1.一種玉米β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子，具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1所示的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子的載體。
3.由權(quán)利要求2所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子在植物基因工程中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子在玉米基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β－葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的β－葡萄糖苷酶基因啟動(dòng)子可啟動(dòng)報(bào)告基因gusA在植物的幼苗和小苗根系中特異性高效表達(dá)，表達(dá)水平高于雙子葉植物基因工程中常用的CaMV35S啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可用于植物基因工程，特別是用于在植物幼苗和小苗根系中表達(dá)特定的目的基因。
文檔編號C12N15/82GK101082047SQ20061001206
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者王國英, 頋日良, 趙麗, 張穎 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)