專利名稱：一種ω－3脂肪酸去飽和酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種ω-3脂肪酸去飽和酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酸是細胞的基本成分之一，在生物體中普遍存在并發(fā)揮著各種重要的生理作用。近年來，隨著對脂肪酸功能的深入理解，一些脂肪酸特別是一些長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFAs)已成為具有重要醫(yī)療價值和營養(yǎng)價值的物質(zhì)并受到研究者的高度重視。LC-PUFAs是指十六碳以上并含有兩個以上雙鍵的脂肪酸，n-3 PUFAs和n-6 PUFAs是其中最重要的兩種類型，前者的不飽和鍵起始于脂肪酸碳鏈甲基端的第三位碳，故稱為n-3型或ω-3型；后者的不飽和鍵起始于脂肪酸碳鏈甲基端的第六位碳，故稱為n-6型或ω-6型。這兩類脂肪酸尤其是前者已成為目前研究與開發(fā)的熱點與重點。
ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 PUFAs)如EPA、DHA等是一類具有重要功能的脂肪酸。它們是細胞膜磷脂中必不可少的組分，使細胞膜結(jié)構(gòu)保持適宜的柔性、流動性和選擇通透性，并作為類花生酸如前列腺素、白細胞三烯和血栓烷的前體分子和與特定的細胞蛋白的伴隨受體相結(jié)合，作為介導發(fā)熱、發(fā)炎、血管擴張、血壓及疼痛等細胞應(yīng)答的信號分子(James G.Wallis，Jennifer L.Watts，John Browse.Polyunsaturated fatty acid synthesiswhat will they think of next？.TRENDSin Biochemical Sciences，2002，27(9)467～473)。更多情況，人們知道它們能作為功能性食品使用以維持身體的正常發(fā)育及健康。例如DHA被稱為“腦黃金”而備受人們青睞，EPA則作為一種“血管清道夫”而受推崇(Kris-Etherton PM，Hecker KD，Binkoski AE.Polyunsaturated fatty acids and cardiovascularhealth.Nutr Rev.2004，62(11)414～426)。因此，ω-3多不飽和脂肪酸作為功能性食品或藥物的需求量也在不斷增大。哺乳動物及人類自身都不能合成大多數(shù)的ω-3 PUFAs、主要來源依靠食物獲取。在當前，深海魚油仍然是ω-3 PUFAs的主要來源。但事實上該來源正在不斷地下降，而且魚油中的DHA和EPA的構(gòu)成和含量隨著魚的種類、季節(jié)、地理位置等變化而變化。魚油制劑還帶有腥味，影響了產(chǎn)品的品質(zhì)。此外，從魚油中提取的DHA含膽固醇多，可能含有因環(huán)境污染所致的重金屬等物質(zhì)(D.R.Tocher，M.J.leaver，P.A.Hodgson.Recent advances in thebiochemistry and molecular biology of fatty acyl desaturase.Prog.lipidRes.1998，3773～117)。因此通過其他途徑來獲取更大量ω-3 PUFAs以滿足人們的需求已成研究的熱點。海洋真菌和微藻等低等生物則具有合成EPA、DHA的能力，它們是EPA和DHA的原始生產(chǎn)者，而海洋魚類等動物主要通過吞食藻類及浮游生物積累EPA、DHA等不飽和脂肪酸(Suzette L.Pereira，Yung-Sheng Huang，Emil G.Bobik，et al.A novel ω-3 fatty acid desaturase involved in the biosynthesisof eicosapentaenoic acid.Biochem.J.2004，378665～671)。因此，各國先后開展了從海洋微藻和真菌中提取EPA、DHA的研究。雖然這些途徑前景廣闊，但目前還存在不少問題，離真正廣泛的實際應(yīng)用還有一定的距離。隨著對脂肪酸代謝在基因水平的不斷深入的認識和研究，通過基因工程及轉(zhuǎn)基因技術(shù)使人類千百年來食用的作物或畜禽能自行產(chǎn)生EPA、DHA等不飽和脂肪酸已經(jīng)逐漸成為現(xiàn)實。
α-亞麻酸(α-linolenic acid，αLA)、廿碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、廿二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)、廿二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)均屬于n-3 PUFAs；而亞油酸(linoleic acid，LA)、γ-亞麻酸(γ-lenolenic acid，γ-LA)、花生四烯酸(arochidonic acid，AA)等屬于n-6 PUFAs。在哺乳動物中n-3和n-6 PUFAs在代謝上和功能上有著明顯的區(qū)分。n-6 PUFAs如花生四烯酸的過量會引起前凝血反應(yīng)(prothombotic)等生理效應(yīng)，并導致炎癥和心血管等疾病，相反n-3 PUFAs如EPA已經(jīng)被證實能夠預防和治療心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、癌癥等多種疾病(Huang YS，Pereira SL，Leonard AE.Enzymesfor transgenic biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids.Biochimie.2004，86(11)793～798；Kang JX.The importance of omega-6/omega-3fatty acid ratio in cell function．The gene transfer of omega-3 fatty aciddesaturase.World Rev Nutr Diet.2003，9223～36)。
體外的和動物的模型研究表明(n-3)PUFAs在深海魚中的高濃度存在抑制了癌細胞的分化和生長速度。但其機制有待深入研究。Aktas H等的研究發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFAs的作用是通過鈣信號實現(xiàn)的，既Ca2+損耗導致eIF2的α亞基的磷酸化，從而抑制了相關(guān)分子的轉(zhuǎn)譯起始。Denys A等在Jurkat T-細胞的實驗中研究了EPA和DHA的作用機制，認為它們是通過蛋白激酶C-α和C-ε以及NF-β等信號通路調(diào)節(jié)IL-2基因的表達，從而最終調(diào)節(jié)T-細胞的活化(Mozaffarian D，Ascherio A，Hu FB，et al.Interplay Between Different Polyunsaturated Fatty Acids and Risk of CoronaryHeart Disease in Men.Circulation.2005 Jan 18；111(2)157-64)。近年來的研究表明，n-6 PUFAs具有促進乳腺癌的發(fā)育，而長鏈的n-3 PUFAs則具有抑制效應(yīng)。n-6/n-3 PUFAs的比率是控制癌癥發(fā)生的一個重要因素。在人體細胞中該比率通常是很高的，因為n-6 PUFAs不能轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs。Ge Y等通過腺病毒載體的方法把線蟲n-3去飽和酶基因fat-1轉(zhuǎn)入人的乳腺癌細胞，結(jié)果使細胞中n-3 PUFAs高水平表達，而n-6 PUFAs的含量大大下降(n-6/n-3 PUFAs的比率從12下降到0.8)，轉(zhuǎn)基因引起癌細胞的大批死亡，有效地抑制了癌細胞的分裂(NicolaGaibazzi，Vigilio Ziacchi.Reversibility of stress-echo induced ST-segmentdepression by long-term oral n-3 PUFAs supplementation in subjects withchest pain syndrome.normal wall motion at stress-echo and normal coronaryangiogram.BMC Cardiovasc Disord.2004 Mar 23；41.)。Guermouche B等將富含EPA和DHA等PUFAs的制品EOAX-7010用于飼喂患糖尿病的懷孕小鼠及其所生的肥胖幼崽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在母鼠及其幼崽中Concavalin-A刺激的T-細胞增殖均顯著下降，并觀察到Ca2+的升高，這表明此制品有助于該小鼠模型的T-細胞畸形后的重塑(Napier JA，Beaudoin F，Michaelson LV，et al.The production of long chainpolyunsaturated fatty acids in transgenic plants by reverse-engineering.Biochimie.2004，86(11)785～792)。
當然在適量的情況下，無論是n-3 PUFAs還是n-6 PUFAs都是哺乳動物和人體所必需的，例如，研究發(fā)現(xiàn)AA、DA以及DHA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的結(jié)構(gòu)性脂(structural lipids)中高濃度地存在，故而這些PUFAs被認為是大腦、視網(wǎng)膜和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育所必需的，在嬰幼兒營養(yǎng)中不可缺少(D.R.Tocher，M.J.leaver，P.A.Hodgson. Recent advances in the biochemistry and molecular biology offatty acyl desaturase.Prog.lipid Res.1998，3773～117)。
然而，n-3 PUFAs和n-6 PUFAs在哺乳動物中的含量差異極大，即n-6 PUFAs含量較多，而n-3 PUFAs含量極少，二者比例在西方人體中高達16∶1左右。根據(jù)相關(guān)的研究，n-6和n-3 PUFAs的比例應(yīng)該在1∶1為適宜，所以人體通常處于n-3 PUFAs供應(yīng)不足的狀態(tài)。因此，在西方國家的相關(guān)機構(gòu)及專家推薦n-3 PUFAs的每日平均攝入量應(yīng)該為0.2g。當然，近來的一些研究表明，此標準應(yīng)根據(jù)不同的人群和地區(qū)進行適當?shù)恼{(diào)整。實際上，即使在整個自然界，生物體內(nèi)所能合成的n-6和n-3 PUFAs的量的比例也同樣是極不均衡的，依然是后者稀缺，因此，n-3 PUFAs的重要性更為突出，對其相關(guān)研究和開發(fā)利用必將越來越受到重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種ω-3脂肪酸去飽和酶及其編碼基因與應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的ω-3脂肪酸去飽和酶，名稱為sFat-1，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的序列2；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有ω-3脂肪酸去飽和酶功能的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列2由399個氨基酸殘基組成。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述ω-3脂肪酸去飽和酶編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述ω-3脂肪酸去飽和酶編碼基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)編碼序列表中序列2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中序列1的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的序列1由1226個脫氧核苷酸組成，自5′端第16位至1215位脫氧核苷酸為編碼序列；自5′端第11位至20位脫氧核苷酸為有利于基因表達的Kozak序列。
含有本發(fā)明基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因動物和植物、工程細胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述轉(zhuǎn)基因動物和植物系具體可謂各種轉(zhuǎn)基因動物如魚類、禽類和哺乳類以及所有植物類；工程細胞系具體可為哺乳動物細胞系，如CHO細胞系；所述工程菌具體可為酵母。
本發(fā)明采用哺乳動物常用密碼對ω-3脂肪酸去飽和酶的天然基因的密碼子進行優(yōu)化處理，使其更適合于在哺乳動物細胞和體內(nèi)表達。轉(zhuǎn)染CHO細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠實驗表明，本發(fā)明的ω-3脂肪酸去飽和酶基因，具備轉(zhuǎn)錄成mRNA和翻譯成去飽和脂肪酸酶功能，并且能在轉(zhuǎn)染細胞和動物體內(nèi)合成ω-3 PUFAs，顯著提高細胞和動物體內(nèi)ω-3 PUFAs的水平。本發(fā)明的基因，比天然基因更適于哺乳動物細胞和體內(nèi)表達?？蓪⒈景l(fā)明的ω-3脂肪酸去飽和酶基因?qū)雱又参矬w內(nèi)或離體的細胞系，提高動植物體內(nèi)或細胞系中ω-3多不飽和脂肪酸的含量，或構(gòu)建生產(chǎn)ω-3多不飽和脂肪酸的動植物生物反應(yīng)器。


圖1為sFat-1基因人工合成示意圖。
圖2為sFat-1基因及其各小片段PCR拼接后電泳圖。
圖3為質(zhì)粒pcDNA3.1-sFat1的質(zhì)粒大小鑒定和酶切鑒定。
圖4為質(zhì)粒pcDNA3.1-sFat1-EGFP結(jié)構(gòu)示意圖和Sma I酶切鑒定電泳圖。
圖5為EGFP在轉(zhuǎn)染的CHO細胞中表達。
圖6為pcDNA3.1-sFat1-EGFP轉(zhuǎn)染細胞的GC-MS分析。
圖7為pEGFP-N1和pcDNA3.1-sFat1-EGFP轉(zhuǎn)染CHO細胞的脂肪酸的相對比例。
圖8為表達載體pBC1-sFat1的構(gòu)建過程示意圖。
圖9為sFat-1基因在不同組織器官的轉(zhuǎn)錄表達情況。
圖10為非轉(zhuǎn)基因小鼠、pBC1-sFat1轉(zhuǎn)基因2號、pcDNA3.1-sFat1-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠4、5、6、16號的肌肉脂肪酸GC-MS分析。
圖11為pcDNA3.1-sFat1-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠16號的脂肪、心、肝、脾、腦、肺、腎等組織脂肪酸GC-MS分析。
圖12為轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁脂肪酸GC-MS分析。
具體實施例方式
下述實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、sFat-1及其編碼基因的獲得在文獻檢索的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)線蟲C.Briggsae的一段DNA具有類似fat-1基因的基因組序列，盡管內(nèi)含子很短，其氨基酸編碼較C.elegans的fat-1基因少兩個氨基酸，但二者的核苷酸序列同源性為71.5％，氨基酸同源性為86.1％，沒有對該序列編碼蛋白功能研究的報道。該編碼序列極可能具有fat-1基因功能，對該基因的密碼子進行優(yōu)化處理后，合成了24段核苷酸序列，共計1226bp。在該序列中有三個酶切位點AGATCT(BglII)；CATATG(NdeI)；CGATCG(PvuI)，可將其切割為四大段即FS1(231bp)；FS2(339bp)；FS3(368bp)；FS4(306bp)；各大段再設(shè)計為60～68bpD的小段進行人工合成。合成序列如下(帶下劃線處均為重疊區(qū))FS1(231bp)FS1-1 CACCATGGTC GCTCATTCCT CTGACGGTCT GTCTGCCACC GCTCCTGTGACTGGCGG TGATGTG(64bp)FS1-2GTACGAGGACCCTTCTCTTC AATAGAAACA CGAGCATCGA CCAGCACATCACCGCCA GTCAC(62bp)FS1-3GAGAAGGGTCCTCGTACTTT GGAATCTACT CAAAACTCTA CTGAGGAAGATCGCGTG CAATTGC(64bp)FS1-4 GGTCAGATCA CGTTCGAAAC AATGAGGTGG AATGGCACGG CGGAAAGCAT CCACAGT A GGCAATTGCACGCGATCTTCC(79bp)FS2(339bp)FS2-1 CTGAGATATC TTGTGCAAGA CTTTGCCGCT CTGGCTTTTC TCTACTTTGCTCTGCCTGTGTTCG(64bp)FS2-2CATAAGCACGTTCCAAGCCA GATAACCCAC CAGACCAAAG TATTCGAACACAGGCAG AGCAAAG(64bp)FS2-3GGCTTGGAACGTGCTTATGG GTGTCTTCGG ATTTGCTTTG TTCGTGGTCGGTCACGAT TGTCTG(64bp)FS2-4GACCAATAATATCGTTCAAGTTTTGGTTAT CTGAAAAAGA TCCATGCAGACAATCGTGACCGACC(65bp)FS2-5CTTGAACGATATTATTGGTCATATCGCTTT CTCTCCTCTG TTCTCTCCCTATTTTCCTTGGCAC(64bp)FS2-6GTCAATATGGTTGGTGAAAGCGTGATGCAG TTTGTGACTC TTCTGCCAAGGAAAATA GGGAG(62bp)FS2-7CTTTCACCAACCATATTGACAAAGATCATG GTCACGTGTG GATTCAAGAC AAAGATTATG AA(62bp)FS3(368bp)FS3-1 CCTACTTGGA AGAAGCTGTT CAACCCTATG CCCTTTTCTG GTTGGCTGAAATGGTTCCCCGTGTAC(66bp)FS3-2GATGAGTAAGGCCAGAAATGAGAACCATCG CAGAAACCAA ACAGAGTGTACACGGGGA ACCATTTC(66bp)FS3-3CATTTCTGGCCTTACTCATCTCTGTTCGTG CGTGATTCTG AACGTGTCCAATGCGTGATTTCTGCTAC(68bp)
FS3-4GTAAGAACCGGCAATAGCCA GTGCCACATA AGCACAGGCC ACACAGCAAG TAGCAGA AATCACGCATTG(69bp)FS3-5GGCTATTGCCGGTTCTTACT CAAACTGGTT CTGGTACTAT TGGGTGCCTCTGTCTTTCTTTGGTTG(66bp)FS3-6CCTCAGCCACTTCATCAGCA TGTTGCAGAT AAGTGACAAT CACCAGCATACAACCAA AGAAAGACAGAG(69bp)FS3-7GCTGATGAAGTGGCTGAGGT GTACGAAGCT GATGAGTGGA GTTTTGTGCG TGGTCAA ACCCAGACTAT(68bp)FS4(306bp)FS4-1 TTTCTATGGT TTTGGATTGG ATGAGACCAT GCACCATATT ACTGACGGTCACGTGGCTCATCAC(64bp)FS4-2CTTCAGTAGCTTCGATCAGATGGTAATGAGGAATCTTATTGAAAAAGTGATGAGCCACGT GACCG(65bp)FS4-3CTGATCGAAGCTACTGAAGG TGTGAAGAAA GTGTTGGAGC CTCTGTTCGA GACTCAGTATGG(62bp)FS4-4CCACAGGAAACGCACAAAGA AATCGTAGTT CACTTGATAC TTGTAACCAT ACTGAGTCTCGAAC(64bp)FS4-5CTTTGTGCGTTTCCTGTGGT TTAACCTGAA GCTGGATTAT CTGGTGCATA AGACTAAAGGTATC(64bp)FS4-6 TTACTTGGCT TTAGCCTTCT CTTCCAGAGT TGTACGAAAT TGCAGGATACCTTTAGTCTTATGC(64bp)此外，在起始密碼子ATG的前面加入了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表達的Kozak序列。sFat-1基因人工合成和PCR拼接過程如圖1所示。第一輪PCR擴增時，共用4個反應(yīng)體系完成，第一個體系以上述FS1-1至FS1-4四個片段混合后作為模板，以PFS1F GTTGCGGCCG CCACCATGGTCGCTCATTCCTCTG和PFS1R AACAGATCTGGTCAGATCACGTTCGAAACAATG為引物，進行擴增；第二個體系以上述FS2-1至FS2-7片段混合后作為模板，以PFS2F TTGAGATCTCTGAGATATCTTGTGCAAGAC和PFS2R CCACATATGTTCATAATCTTTGTCTTGAATC為引物，進行擴增；第三個體系以上述FS3-1至FS3-7片段混合后作為模板，以PFS3F GGTCATATGCCTACTTGGAAGAAGCTGTTC和PFS3R TTACGATCGATAGTCTGGGTTTGACC ACGCAC為引物，進行擴增；第四個體系以上述FS4-1至FS4-6片段混合后作為模板，以PFS4FAATCGATCGTTTCTATGGTTTTGGATTGGATG和PFS4R CAAGGTACCTTACTTGGCTTTAGCCTTCTCTTC為引物，進行擴增；四個PCR的循環(huán)程序為94℃，30sec，72℃，45sec，30循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳，結(jié)果如圖2中(a)所示，擴增產(chǎn)物為FS1片段(231bp，泳道1)、FS2片段(339bp，泳道2)、FS3片段(368bp，泳道3)和FS4片段(306bp，泳道4)。第二輪PCR用2個反應(yīng)體系完成，即分別將上述PCR得到的FS1片段和FS2片段用Bgl II酶切后連接，將上述PCR得到的FS3片段和FS4片段用Pvu I酶切后連接，以FS1片段和FS2片段的連接產(chǎn)物為模板，以FS1-1和FS2-7為引物，進行PCR擴增，擴增得到570bp的片段，其中PCR的循環(huán)程序為94℃，30sec，72℃，60sec，30循環(huán)。以FS3片段和FS4片段的連接產(chǎn)物為模板，以FS3-1和FS4-6為引物，進行PCR擴增，擴增得到674bp的片段，其中，PCR的循環(huán)程序為94℃，30sec，72℃，60sec，30循環(huán)。然后將第二輪PCR擴增得到的兩個片段分別用Nde I酶切，并將它們連接，以該連接產(chǎn)物為模板，以FS1-1和FS4-6為引物，PCR的循環(huán)程序為94℃，30sec，72℃，120sec，30循環(huán)，進行第三輪PCR反應(yīng)，即獲得1200bp的全長基因。第二輪和第三輪PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳如圖2中(b)所示，其中泳道1、泳道2分別為第二輪PCR擴增得到的大小為570bp和674bp兩個片段，泳道3為第三輪PCR擴增得到的1200bp的全長基因，合成的序列經(jīng)序列分析，與設(shè)計的序列完全一致，將其命名為sFat-1。sFat-1具有序列表中序列1的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中序列1具有1226個核苷酸，自5′端第16-1215位核苷酸序列為編碼序列。
實施例2、sFat-1的表達1、哺乳動物細胞系表達載體的構(gòu)建將基因sFat-1用Not1和Kpn1雙酶切，克隆到表達載體pcDNA3.1(-)(Invitrogen Inc.)的Not1和Kpn1酶識別位點之間。連接產(chǎn)物經(jīng)過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、涂LB平板、挑選克隆、搖菌、提取質(zhì)粒和酶切初步鑒定后再測序鑒定而獲得正確插入了目的基因的克隆，結(jié)果如圖3所示，圖3中(a)為質(zhì)粒大小鑒定，所有質(zhì)粒大小均為6627bp，隨機選擇其中4個用Xho I和HindIII進行雙酶切，即從載體兩端再切下來的1200bp的sFat-1基因，證明它們確實連入了目的片段(見圖3中(b))。最后測序檢測，將測序表明含有sFat-1基因pcDNA3.1(-)重組載體命名為pcDNA3.1-sFat1。其中，圖3中(a)中泳道1-6為pcDNA3.1-sFat1載體的電泳圖，圖3中(b)泳道1-4為XhoI和HindIII進行雙酶切的pcDNA3.1-sFat1，泳道M為分子量標準。
為了使驗證實驗更為方便，在測序獲得的正確克隆既質(zhì)粒pcDNA3.1-sFat1上加上EGFP標簽，得到用于哺乳動物細胞系表達質(zhì)粒pcDNA3.1-sFat1-EGFP。具體步驟為用AseI和AflII從載體pEGFP-N1(Clontech Com)酶切下來EGFP片段，該片段還包括其前端的CMV啟動子和后端的SV40 PolyA，將其補平，插入到pcDNA3.1-sFat1的Bst11071I酶切后補平的位點處，這樣，該表達質(zhì)粒中目的基因sFat-1和標記基因EGFP各自帶有一套完整的啟動子和PolyA，形成兩個各自獨立的表達單元。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后最終獲得克隆。提取質(zhì)粒電泳鑒定表明，一部分為EGFP目的片段連入載體，一部分則為pcDNA3.1-sFat1載體本身自連接，一部分則為兩個pcDNA3.1-sFat1載體之間的相連接。將屬于第一種情況的克隆用Sma I酶切鑒定，結(jié)果見圖4中b，其中一些為正連接(如圖4中b的泳道3和泳道4)，切下來的6403bp和1810bp大小的兩個片段，一些為反連接(如圖4中b的泳道1)，較小片段大于1810bp，還有連入了2個EGFP片段的情況(如圖4中b的泳道2)，將經(jīng)過酶切和測序鑒定表明含有一個正連接的EGFP的pcDNA3.1-sFat1載體命名為pcDNA3.1-sFat1-EGFP。pcDNA3.1-sFat1-EGFP的結(jié)構(gòu)簡圖如圖4中a所示。
2、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染CHO細胞系將CHO細胞用添加有10％胎牛血清、20mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和和100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)，培養(yǎng)于37℃、5％CO2及飽和濕度下。待瓶中細胞單層長滿后進行消化傳代。
采用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO細胞。轉(zhuǎn)染前用Sca I酶切表達載體pcDNA3.1-sFat1-EGFP，瓊脂糖電泳，回收待用。哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1-sFat1-EGFP線形化后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細胞系，同時用空載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的CHO細胞作為對照，一部分未轉(zhuǎn)染的CHO細胞作空白對照。轉(zhuǎn)染操作按轉(zhuǎn)染試劑提供的方法進行，簡述如下(1)在轉(zhuǎn)染的前一天，將上述培養(yǎng)的CHO細胞分散至三個6孔板中，待其生長至70％～90％匯合時使用；(2)向1.5ml Eppendorf管中分別加入500μl DMEM培養(yǎng)基，再加入6μl脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000，混合均勻，記做A液；(3)向1.5ml Eppendorf管中加入500μl DMEM，再加入1～2μg上述線性化的pcDNA3.1-sFat1-EGFP或用ApaI線性化的空載體pEGFP-N1(對照)，或者加入等體積的水(空白對照)，混合均勻，記做B液；(4)A液與3個B液在室溫下放置5min，分別集中到一個Eppendorf管中，記做C液，室溫靜置20min；(5)吸棄CHO細胞的培養(yǎng)基，用新鮮的DMEM洗滌兩遍，加入新鮮的DMEM500μl，將C液分散加到上述裝有CHO細胞的6孔板的每個孔中，輕輕混勻；(6)置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，3h后，每半小時觀察一次細胞，待細胞形狀由梭形變?yōu)樯詧A形時，吸棄孔中的液體，換上含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)6～8h，然后用0.25％胰蛋白酶消化每個孔的細胞，分別轉(zhuǎn)至90mm培養(yǎng)皿中，用含800g/ml Geneticin(G-418)的DMEM生長培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，篩選抗性細胞。待抗性細胞長滿后進行傳代和凍存。
經(jīng)過3周的抗性Genectin篩選后獲得轉(zhuǎn)染細胞系，載體pcDNA3.1-sFat1-EGFP在CHO細胞中表達了綠色熒光蛋白(如圖5所示)，熒光的強度在篩選的各個時期都低于空載體pEGFP-N1。未轉(zhuǎn)染的CHO細胞不表達綠色熒光蛋白。顯然是因為目的基因sFat-1也在同時表達的緣故。試驗過程中也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染sFat-1基因的CHO細胞系經(jīng)過6～7次的傳代后，GFP基因的表達并沒有明顯的減弱。
3、sFat-1基因的表達及其對CHO細胞的脂肪酸組成影響提取上述pcDNA3.1-sFat1-EGFP轉(zhuǎn)染細胞的總RNA，進行了RT-PCR，其結(jié)果也證實了在轉(zhuǎn)染細胞中sFat-1基因的mRNA存在。顯然，CHO細胞系中的轉(zhuǎn)染sFat-1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄了mRNA。
為了確切證實sFat-1在CHO細胞的表達產(chǎn)物是否具有ω-3脂肪酸去飽和酶的正常功能，實驗測定了細胞中脂肪酸的變化情況，結(jié)果如圖6所示。GC-MS測定的脂肪酸百分含量如表1所示。GC-MS實驗在對照組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體)、實驗組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-sFat-1-EGFP)中均檢測出來16種脂肪酸，包括3種飽和脂肪酸、3種單不飽和脂肪酸和10種多不飽和脂肪酸。在2個組別間，不飽和脂肪酸總含量以及多不飽和脂肪酸總含量差異均不顯著，但是二者間ω-6多不飽和脂肪酸和ω-3多不飽和脂肪酸總含量存在顯著的差異，即ω-6多不飽和脂肪酸在對照組最高(48.97)、在實驗組最低(35.29)，而ω-3多不飽和脂肪酸則剛好相反，在轉(zhuǎn)染對照載體pEGFP-N1的對照組最低(7.86)、在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-sFat1-EGFP實驗組最高(24.02)。具體到每一種脂肪酸，其含量在2個組別間的情況與此也基本一致。此外，ω-6多不飽和脂肪酸和ω-3多不飽和脂肪酸的比值在2個組別間也明顯存在差異，在對照組中高達6.23，而在實驗組里已降低至1.47。ω-6與ω-3多不飽和脂肪酸之間此消彼長的這種關(guān)系正是因為sFat-1基因的ω-3去飽和酶的作用，它是合成ω-3系列多不飽和脂肪酸時最后一個步驟的關(guān)鍵酶，在ω-3位置上發(fā)生去飽和作用而增加一個不飽和鍵(雙鍵)，而該酶的底物主要就是ω-6系列多不飽和脂肪酸。這樣使得ω-6系列多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的ω-3系列多不飽和脂肪酸，既182n-6→183n-3，202n-6→203n-3，203n-6→204n-3，204n-6→205n-3(EPA)，224n-6→225n-3(DHA)(見圖6，7和表1)，其中，圖7中1～16分別表示14，16，18，161n-5，181n-9，182n-6，183n-3，183n-6，201n-9，202n-7，203n-7，204n-6，205n-3，224n-6，225n-3，226n-3脂肪酸；serials 1表示pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的CHO細胞，serials 2表示pcDNA3.1-sFat-1-EGFP轉(zhuǎn)染CHO細胞。
表1.不同脂肪酸的百分含量

不同的小寫字母上標表示差異顯著實施例3、用于動物生物反應(yīng)器的表達研究
1、轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達載體使用轉(zhuǎn)染細胞用的pcDNA3.1-sFat1-EGFP載體。同時構(gòu)建了乳腺表達載體質(zhì)粒pBC1-sFat1，其構(gòu)建流程示意圖如圖8所示，具體步驟為將乳腺表達載體pBC1(Invitrogen Inc.)用內(nèi)切酶Xho I切開，并用Klenow補平，再以CIAP去磷酸化；用Xho I、HindIII雙酶切pcDNA3.1-sFat1，回收1200bp片段，補平。兩者進行連接過夜。獲得轉(zhuǎn)化克隆后用PCR方法和酶切方法鑒定正確連接的克隆，測序結(jié)果含有DNA序列的pBC1重組載體即為乳腺表達載體為pBC1-sFat1。
注射用pcDNA3.1-sFat1-EGFP載體片段和pBC1-sFat1載體片段的制備凝膠電泳回收后的pcDNA3.1-sFat1-EGFP載體片段和pBC1-sFat1載體片段經(jīng)紫外分光光度計定量后用注射用TE(pH 7.4的10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA)稀釋到1～3μg/mL。分裝為10μL/管。-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠按轉(zhuǎn)基因小鼠制備的常規(guī)方法制備供體母鼠和受體母鼠。使用顯微注射法將上述制備的注射用的pcDNA3.1-sFat1-EGFP載體和pBC1-sFat1注射到受精卵的雄性原核內(nèi)，所有卵注射完畢后，全部轉(zhuǎn)移至M16培養(yǎng)液中并置二氧化碳孵箱中短暫培養(yǎng)后，再移植到受體鼠即假孕母鼠的輸卵管。pcDNA3.1-sFat1-EGFP的注射卵共移植了189枚，出生小鼠33只；pBC1-sFat1的注射卵共移植了167枚，出生小鼠24只。
3、轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定剪下出生后10～14d小鼠尾尖約0.5cm，提取DNA。以DTF1 5′TGTGCGTGGTCAA ACCCAGACTATC 3′和DTR1 5′GTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAG 3′為引物，提取的pcDNA3.1-sFat1-EGFP注射小鼠的DNA為模板，PCR程序為先94℃預變性4min；再94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 20s，35個循環(huán)；最后72℃ 10min；4℃保存。結(jié)果表明pcDNA3.1-sFat1-EGFP的注射卵共移植后出生的33只小鼠中有5只PCR陽性(3號，4號，5號，6號，16號)，再用Soutrernblot鑒定，獲得4只為陽性轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠(4號，5號，6號，16號)。以555′-GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC-3和565′-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3′為引物，以提取的pBC1-sFat1注射小鼠的DNA為模板，PCR條件同轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠PCR鑒定，結(jié)果表明，pBC1-sFat1的注射卵共移植后出生的24只小鼠中有5只PCR陽性(2號，3號，9號，10號，11號)，再用Soutrern blot鑒定，仍有5只為陽性(具體結(jié)果見表2)表明獲得5只轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠(2號，3號，9號，10號，11號)。
表2顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果

4、首建者轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代將上述PCR鑒定正確的轉(zhuǎn)pBC1-sFat1首建者小鼠(2號，3號，9號，10號，11號)和轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP首建者小鼠(3號，4號，5號，6號，16號)分別在4周齡左右與非轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得F1代小鼠，結(jié)果如表3所示。對出生的后代小鼠進行PCR(方法同步驟3中轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠或轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠的PCR鑒定)檢測，根據(jù)陽性轉(zhuǎn)基因小鼠的數(shù)量計算遺傳率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠中3號不能將導入的外源基因遺傳給后代，其余的4，5，6，16號F0小鼠都能遺傳給后代，其中4號遺傳概率較高。轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠中，10號不能將導入的外源基因遺傳給后代，其余的轉(zhuǎn)pBC1-sFat1F0小鼠都能遺傳給后代。但除3號遺傳概率較高外，其余的遺傳概率較低。
表3轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代

5、RT-PCR檢測sFat-1在轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織器官的表達情況分別將上述傳代保種后的轉(zhuǎn)pBC1-sFat1首建者小鼠或轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP首建者小鼠引頸法處死后取肌肉、心臟、大腦、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、脂肪等組織，實驗提取總RNA，按照TaKaLa公司的RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0的說明書進行RT-PCR，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠中，上述各組織都轉(zhuǎn)錄表達了目的基因，而轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠中則沒有轉(zhuǎn)錄表達，部分結(jié)果如圖9所示，圖9種所示為轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠(16號鼠)和轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠(2號鼠)的轉(zhuǎn)錄表達情況。在轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠中，RT-PCR產(chǎn)物的濃度反應(yīng)了在肝臟、心臟、肌肉、大腦和腎臟中轉(zhuǎn)錄表達的mRNA較豐富，而脂肪、肺臟和脾臟中則很稀少。
5、轉(zhuǎn)基因小鼠中sfat-1基因表達即脂肪酸組成變化的鑒定首先用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)測定分析了4只轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP首建者小鼠(4號、5號、6號和16號，因為3號小鼠未能將導入基因遺傳給后代，故不作分析)的肌肉組織的脂肪酸組成(包括每只首建者小鼠的一只轉(zhuǎn)基因后代)，轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠肌肉組織中的脂肪酸組成，以非轉(zhuǎn)基因小鼠作為對照。結(jié)果如圖10所示，圖10為色譜圖，縱坐標為百分含量，橫坐標為各種脂肪酸出現(xiàn)的保留時間(Retention time)，結(jié)果表明，每一種脂肪酸出現(xiàn)的保留時間在同樣的實驗條件下幾乎是恒定的，不同的脂肪酸出現(xiàn)的時間不一樣，由此可以將各種脂肪酸在色譜圖中區(qū)分開，在通過質(zhì)譜分析和搜庫對比就可以準確判定各個色譜峰所代表的不同脂肪酸的具體種類。各個色譜峰的高低則表明此脂肪酸的含量，按照其峰面積計算出它含量。這樣GC-MS分析后所有脂肪酸種類和百分含量得以確定，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，這4只小鼠肌肉組織的脂肪酸中ω-3多不飽和脂肪酸都顯著提高。表明該基因在4只小鼠體內(nèi)發(fā)揮了其酶活性，將ω-6多不飽和脂肪酸催化生成了ω-3多不飽和脂肪酸。與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比較，其中ω-6多不飽和脂肪酸總含量從對照組35％左右降到試驗組(轉(zhuǎn)基因組)的27％左右，而ω-3多不飽和脂肪酸總含量則從6％左右升高到23％左右。轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠肌肉組織中的脂肪酸組成，分析結(jié)果表明，這種小鼠在脂肪酸組成上并沒有發(fā)現(xiàn)ω-3多不飽和脂肪酸的增加(圖10，表4)，這說明外源基因在轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠的肌肉等組織中很可能都沒有表達。因此，不再分析轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠其他組織的脂肪酸組成。圖10中(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)分別表示非轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠2號、轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠4、5、6、16號的肌肉脂肪酸GC-MS分析。
表4 pBC1-sFat1和pcDNA3.1-sFat1-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉中不同脂肪酸含量(％)


不同的小寫字母上標表示差異顯著對在肌肉中表達最高的轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP首建者小鼠16號(ω-3多不飽和脂肪酸總含量高達25.41％)的其他體組織即脂肪、心、肝、脾、腦、肺、腎等進行GC-MS分析結(jié)果表明，外源基因sFat-1在這些組織均有表達，但表達程度(由ω-3多不飽和脂肪酸積累的總量表示)有很大的差異，結(jié)果如圖11和表5所示。除了肌肉組織外，心、肝、腦和腎的ω-3多不飽和脂肪酸增加幅度都較大，而脂肪、脾和肺則增幅較小。這些數(shù)據(jù)說明，外源基因sFat-1在pcDNA3.1-sFat1-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得了非常高的和組織廣泛的表達，其中，圖11中為(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)和(g)分別表示轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠16號的脂肪、心、肝、脾、腦、肺、腎等組織脂肪酸GC-MS分析。
表5 pcDNA3.1-sFat1-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠16號的多種組織不同脂肪酸含量(％)


對轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠重點分析了乳汁中的脂肪酸組成成分，同時也分析了轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁脂肪酸，結(jié)果見圖12和表6。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠和轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠的ω-3多不飽和脂肪酸總量比非轉(zhuǎn)基因小鼠都有所增加，然而增幅并不大。轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠乳汁ω-3多不飽和脂肪酸總量僅比正常非轉(zhuǎn)基因小鼠提高一倍。而轉(zhuǎn)pcDNA3.1-sFat1-EGFP小鼠增加更少(近0.5倍)。圖12中(a)，(b)和(c)分別為非轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠，和轉(zhuǎn)pBC1-sFat1小鼠乳汁脂肪酸GC-MS分析。
上述所有的ω-3多不飽和脂肪酸增加幾乎都有一個共同特點，即更長鏈的22碳ω-3多不飽和脂肪酸(包括226n-3和225n-3)增加的幅度非常大(主要是同此前發(fā)表的結(jié)果相比較)，而其他較短鏈的ω-3多不飽和脂肪酸(183n-3和205n-3)則增加較少。
表6 轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中不同脂肪酸含量(％)


不同的小寫字母上標表示差異顯著序列表<160>2<210>1<211>1226<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gttgcggccg ccaccatggt cgctcattcc tctgacggtc tgtctgccac cgctcctgtg 60actggcggtg atgtgctggt cgatgctcgt gtttctattg aagagaaggg tcctcgtact120ttggaatcta ctcaaaactc tactgaggaa gatcgcgtgc aattgcctac tgtggatgct180ttccgccgtg ccattccacc tcattgtttc gaacgtgatc tgaccagatc tctgagatat240cttgtgcaag actttgccgc tctggctttt ctctactttg ctctgcctgt gttcgaatac300tttggtctgg tgggttatct ggcttggaac gtgcttatgg gtgtcttcgg atttgctttg360ttcgtggtcg gtcacgattg tctgcatgga tctttttcag ataaccaaaa cttgaacgat420attattggtc atatcgcttt ctctcctctg ttctctccct attttccttg gcagaagagt480cacaaactgc atcacgcttt caccaaccat attgacaaag atcatggtca cgtgtggatt540caagacaaag attatgaaca tatgcctact tggaagaagc tgttcaaccc tatgcccttt600tctggttggc tgaaatggtt ccccgtgtac actctgtttg gtttctgcga tggttctcat660ttctggcctt actcatctct gttcgtgcgt gattctgaac gtgtccaatg cgtgatttct720gctacttgct gtgtggcctg tgcttatgtg gcactggcta ttgccggttc ttactcaaac780tggttctggt actattgggt gcctctgtct ttctttggtt gtatgctggt gattgtcact840tatctgcaac atgctgatga agtggctgag gtgtacgaag ctgatgagtg gagttttgtg900cgtggtcaaa cccagactat cgatcgtttc tatggttttg gattggatga gaccatgcac960catattactg acggtcacgt ggctcatcac tttttcaata agattcctca ttaccatctg 1020atcgaagcta ctgaaggtgt gaagaaagtg ttggagcctc tgttcgagac tcagtatggt 1080tacaagtatc aagtgaacta cgatttcttt gtgcgtttcc tgtggtttaa cctgaagctg 1140gattatctgg tgcataagac taaaggtatc ctgcaatttc gtacaactct ggaagagaag 1200
gctaaagcca agtaagcggc cgcttg1226<210>2<211>399<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Val Ala His Ser Ser Asp Gly Leu Ser Ala Thr Ala Pro Val Thr1 5 10 15Gly Gly Asp Val Leu Val Asp Ala Arg Val Ser Ile Glu Glu Lys Gly20 25 30Pro Arg Thr Leu Glu Ser Thr Gln Asn Ser Thr Glu Glu Asp Arg Val35 40 45Gln Leu Pro Thr Val Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ile Pro Pro His Cys50 55 60Phe Glu Arg Asp Leu Thr Arg Ser Leu Arg Tyr Leu Val Gln Asp Phe65 70 75 80Ala Ala Leu Ala Phe Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Val Phe Glu Tyr Phe85 90 95Gly Leu Val Gly Tyr Leu Ala Trp Asn Val Leu Met Gly Val Phe Gly100 105 110Phe Ala Leu Phe Val Val Gly His Asp Cys Leu His Gly Ser Phe Ser115 120 125Asp Asn Gln Asn Leu Asn Asp Ile Ile Gly His Ile Ala Phe Ser Pro130 135 140Leu Phe Ser Pro Tyr Phe Pro Trp Gln Lys Ser His Lys Leu His His145 150 155 160Ala Phe Thr Asn His Ile Asp Lys Asp His Gly His Val Trp Ile Gln165 170 175
Asp Lys Asp Tyr Glu His Met Pro Thr Trp Lys Lys Leu Phe Asn Pro180 185 190Met Pro Phe Ser Gly Trp Leu Lys Trp Phe Pro Val Tyr Thr Leu Phe195 200 205Gly Phe Cys Asp Gly Ser His Phe Trp Pro Tyr Ser Ser Leu Phe Val210 215220Arg Asp Ser Glu Arg Val Gln Cys ValIle Ser Ala Thr Cys Cys Val225 230235 240Ala Cys Ala Tyr Val Ala Leu AlaIle Ala Gly Ser Tyr Ser Asn Trp245 250 255Phe Trp Tyr Tyr Trp Val Pro Leu Ser Phe Phe Gly Cys Met Leu Val260 265 270Ile Val Thr Tyr Leu Gln His Ala Asp Glu Val Ala Glu Val Tyr Glu275 280 285Ala Asp Glu Trp Ser Phe Val Arg Gly Gln Thr Gln Thr Ile Asp Arg290 295 300Phe Tyr Gly Phe Gly Leu Asp Glu Thr Met His His Ile Thr Asp Gly305 310 315 320His Val Ala His His Phe Phe Asn Lys Ile Pro His Tyr His Leu Ile325 330 335Glu Ala Thr Glu Gly Val Lys Lys Val Leu Glu Pro Leu Phe Glu Thr340 345 350Gln Tyr Gly Tyr Lys Tyr Gln Val Asn Tyr Asp Phe Phe Val Arg Phe355 360 365Leu Trp Phe Asn Leu Lys Leu Asp Tyr Leu Val His Lys Thr Lys Gly370 375 380Ile Leu Gln Phe Arg Thr Thr Leu Glu Glu Lys Ala Lys Ala Lys385 390 39權(quán)利要求
1.一種ω-3脂肪酸去飽和酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的序列2；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有ω-3脂肪酸去飽和酶功能的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述ω-3脂肪酸去飽和酶的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述ω-3脂肪酸去飽和酶的編碼基因的編碼序列為自序列1的5′端第16位至1215位脫氧核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的編碼基因，其特征在于所述ω-3脂肪酸去飽和酶的編碼基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的核苷酸序列；2)編碼序列表中序列2蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中序列1的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求2-4中任一所述的基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或工程菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或工程菌，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因細胞系為哺乳動物細胞系；所述工程菌為酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或工程菌，其特征在于所述哺乳動物細胞系為CHO細胞系。
8.權(quán)利要求2-4中任一所述的基因在提高動植物體內(nèi)或細胞系中ω-3多不飽和脂肪酸含量中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求5或6或7所述的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或工程菌在生產(chǎn)ω-3多不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2-4中任一所述的基因在制備生產(chǎn)ω-3多不飽和脂肪酸的動植物生物反應(yīng)器中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ω－3脂肪酸去飽和酶及其編碼基因與應(yīng)用。ω－3脂肪酸去飽和酶是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有ω－3脂肪酸去飽和酶功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的ω－3脂肪酸去飽和酶基因，具備轉(zhuǎn)錄成mRNA和翻譯成去飽和脂肪酸酶功能，并且能在轉(zhuǎn)染細胞和動物體內(nèi)合成ω－3 PUFAs，顯著提高細胞和動物體內(nèi)ω－3 PUFAs的水平。
文檔編號C12P7/64GK1884500SQ200610012280
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日
發(fā)明者鄧繼先, 朱貴明, 陳紅星, 周艷榮, 盧建申, 吳曉潔 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所