專利名稱：谷氨酸棒桿菌突變株及在發(fā)酵法生產(chǎn)l－色氨酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化工程領(lǐng)域，涉及一種棒桿菌屬(Corynebacteriumglutamicum)菌種以及應(yīng)用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-色氨酸學(xué)名β-吲哚基丙氨酸，化學(xué)名L-2-氨基-3-吲哚基丙酸，別名L-胰化蛋白氨基酸、L-氨基吲哚丙酸，分子式C11H12O2N2，相對分子質(zhì)量204.21。L-色氨酸(L-Tryptophan)是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。L-色氨酸具有多種生理功能，廣泛用于醫(yī)藥，飼料及食品行業(yè)，尤其在醫(yī)學(xué)研究中的作用日益受到重視。L-色氨酸對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起著非常重要的作用，被稱為第二必需氨基酸。
L-色氨酸的生產(chǎn)最早主要依靠蛋白質(zhì)水解法和化學(xué)合成法，但是隨著對微生物法生產(chǎn)L-色氨酸研究的不斷深入，微生物法已經(jīng)走向?qū)嵱貌⑶姨幱谥鲗?dǎo)地位。微生物法大體上可以分為直接發(fā)酵法、微生物轉(zhuǎn)化法和酶法。近年來還出現(xiàn)了將直接發(fā)酵法與化學(xué)合成法、直接發(fā)酵法與轉(zhuǎn)化法相結(jié)合生產(chǎn)L-色氨酸的研究。另外，重組DNA技術(shù)在微生物育種和酶工業(yè)上的應(yīng)用極大地推動了直接發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)L-色氨酸的工業(yè)化進(jìn)程。
目前，利用谷氨酸棒桿菌直接發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的專利在國內(nèi)尚無申請。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一種棒桿菌屬的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，該菌具有提高L-色氨酸產(chǎn)率的能力。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是提供采用上述菌種發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的發(fā)酵工藝。
本發(fā)明提供的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株TQ2223，以棒桿菌屬的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032(保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏編號為CICC10226)為出發(fā)菌種，通過逐步選育具有苯丙氨酸和酪氨酸缺陷(Phe-+Tyr-)，5-甲基色氨酸抗性(5-MTr)，磺胺胍抗性(SGr)，5-氟色氨酸抗性(5-FTr)，肉桂酸抗性(CINr)遺傳標(biāo)記的突變株TQ2223，使其具有L-色氨酸的生物合成能力。
(注谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株TQ2223(Phe-+Tyr-+5-MTr+SGr+5-FTr+CINr)曾于2003年在《氨基酸和生物資源》第25期3卷發(fā)表，現(xiàn)保藏于天津科技大學(xué)代謝控制發(fā)酵研究室，公眾如有需要，可直接與該研究室聯(lián)系。)上述谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株TQ2223的選育方法，其具體過程為第一步、誘變將谷氨酸棒桿菌ATCC13032經(jīng)硫酸二乙酯DES常規(guī)誘變后的菌株，經(jīng)離心洗滌制成菌懸液直接涂布于藥物平板上，其構(gòu)成為100ml液體基本培養(yǎng)基中添加抗性藥物和L-苯丙氨酸、L-酪氨酸各5-50mg，瓊脂1.5-3.0g，pH7.0～7.2 0.75kg/cm215min；其中基本培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖20，硫酸銨10，KH2PO41，MgSO40.4，F(xiàn)eSO40.01，MnSO40.01，生物素100μg，VB1100μg，瓊脂粉20，pH7.0～7.2 0.75kg/cm230min；抗性藥物及濃度分別為5-MT為2g/L，5-FT為4g/L，CIN為1g/L，SG為2g/L；32℃培養(yǎng)4～6天，挑取生長良好的大菌落接種于完全斜面培養(yǎng)基中保藏，完全斜面培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl 2.5，瓊脂條20，pH7.0～7.20.75kg/cm220min；第二步篩選(1)產(chǎn)色氨酸菌株的初篩將上步所得突變株從活化斜面培養(yǎng)基取一環(huán)接種到裝有5ml初篩種子培養(yǎng)基的大試管中，置于往復(fù)式搖床上，32℃，96r/min培養(yǎng)16～18小時，其中活化斜面培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖0.5-2，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，酵母膏1-10，NaCl 0.5-5，瓊脂條15-30，pH7.0～7.2 0.75kg/cm220min；初篩種子培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖10-80，硫酸銨2-8 玉米漿5-50mL，酵母膏1-10，K2HPO40.2-2.0，KH2PO40.2-2.0 MgSO401-1.0，F(xiàn)eSO40.005-0.015，MnSO40.005-0.015，pH7.0～7.2 0.75kg/cm215min；然后吸取0.5ml種子液接種于裝有5ml初篩發(fā)酵培養(yǎng)基的大試管中，初篩發(fā)酵培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖50-180，硫酸銨5-50，K2HPO40.1-2.0，KH2PO40.1-2.0 玉米漿5-50mL，MgSO40.1-1.0，F(xiàn)eSO40.005-0.015，MnSO40.005-0.015，pH7.0～7.2 0.75kg/cm215min；在32℃、轉(zhuǎn)速為96r/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)3天；發(fā)酵液離心后取上清液以對二甲胺基苯甲醛顯色，以目測法選出呈藍(lán)色深者，作為產(chǎn)色氨酸菌株，留作復(fù)篩用；(2)產(chǎn)色氨酸菌株的復(fù)篩將初篩獲得的產(chǎn)色氨酸菌的斜面取一環(huán)接種到裝有20ml上述初篩種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置于往復(fù)式搖床上，32℃、96r/min培養(yǎng)16～18小時，然后吸取4ml種子液接種于裝有40ml上述初篩發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，每株菌做5瓶，在32℃、轉(zhuǎn)速為96r/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)3天；發(fā)酵液離心后取上清液用對二甲胺基苯甲醛顯色后，用751G分光光度計于600nm下測定吸光度并根據(jù)色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出色氨酸的含量；在一次誘變所得的菌中，產(chǎn)酸較高并穩(wěn)定者作為下一次誘變的出發(fā)菌株；多次反復(fù)經(jīng)過上述誘變及搖瓶復(fù)篩后，得到一株產(chǎn)酸量穩(wěn)定、且產(chǎn)酸量最高的菌株TQ2223，其產(chǎn)酸量達(dá)4.98g/L，經(jīng)驗證其遺傳標(biāo)記為Phe-+Tyr-+5-MTr+5-FTr+CINr。
谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株TQ2223在發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸中的應(yīng)用該方法將谷氨酸棒桿菌突變株TQ2223加入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖80，(NH4)2SO440，Phe 0.15，Tyr 0.15，豆餅水解液25ml，玉米漿22ml，KH2PO4·3H2O 10，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01，VB1100μg，VH50μg，CaCO30.2％分消，pH7.0～7.2，0.075MPa 15min；其中，碳源含量應(yīng)為1％～30％，氮碳比N∶C應(yīng)介于5∶100～50∶100之間，無機(jī)鹽含量應(yīng)為0.0001～10％，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH5.0～9.0，培養(yǎng)溫度20℃～40℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)1～4天，接種量為0.01％～10％(V/V)；發(fā)酵過程中，流加硫酸銨、氨水或氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.0～8.0。
碳源可以利用糖，葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖，甘露糖，淀粉和糖漿；或利用糖醇，甘油；或有機(jī)酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳為10％～20％。
氮源可以利用氨或銨鹽硫酸銨，醋酸銨，硝酸銨，磷酸銨，乙酸銨或氯化銨；也可以利用有機(jī)氮蛋白胨，牛肉膏，玉米漿，或豆餅水解液。
無機(jī)鹽，可以利用磷酸鉀鹽，硫酸鎂，碳酸鈣，硫酸亞鐵，或硫酸錳。
發(fā)酵培養(yǎng)基中可加入營養(yǎng)物，氨基酸及維生素。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明利用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)突變株發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸，可以大大提高L-色氨酸的產(chǎn)率。
TQ2223具有較高的5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸、肉桂酸和磺胺胍抗性(5-MTr+5-FTr+CINr+SGr)。選育苯丙氨酸和酪氨酸雙重缺陷突變株的目的，是為了解除苯丙氨酸、酪氨酸對合成途徑中DS的反饋調(diào)節(jié)，從而有利于色氨酸的積累。5-甲基色氨酸(5-MT)、5-氟色氨酸(5-FT)是色氨酸的結(jié)構(gòu)類似物。通過選育它們的抗性突變株就可以解除色氨酸對AS酶及該特異途徑中其它酶的反饋調(diào)節(jié)，從而使色氨酸得以積累?；前冯?SG)是β-氨基安息香酸的結(jié)構(gòu)類似物，選育SG抗性突變株，可增強前體物分支酸的合成，從而提高色氨酸的代謝流。肉桂酸(CIN)是苯丙氨酸和酪氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，選育CIN抗性突變株，可以使DAHP得以大量合成，進(jìn)而生成分支酸，并在此處優(yōu)先合成色氨酸。


圖1是谷氨酸棒桿菌ATCC13032經(jīng)DES常規(guī)誘變的工藝流程圖；圖2是突變株TQ2223Phe-+Tyr-營養(yǎng)缺陷標(biāo)記的驗證圖；圖3是(NH4)2SO4用量對補料分批發(fā)酵的影響圖；圖4是不同初銨濃度的補料分批發(fā)酵結(jié)果圖；圖5是TQ2223在10L罐分批發(fā)酵過程曲線圖。
具體實施方式實施例1色氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株的篩選根據(jù)色氨酸代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，對于谷氨酸棒桿菌來說，如果解除色氨酸特異途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制，即使有共同途徑上的反饋調(diào)節(jié)存在，也能過剩積累色氨酸。因此，可通過選育色氨酸的結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，解除其自身的反饋調(diào)節(jié)來達(dá)到積累色氨酸的目的。
以菌株Tx5-32(Phe-+Tyr-)(該菌株由谷氨酸棒桿菌ATCC13032誘變而來，它又作為下一步誘變的出發(fā)菌株)作為誘變的出發(fā)菌株。經(jīng)測定其5-MT的臨界致死濃度為1g/L。將Tx5-32經(jīng)DES誘變(見圖1)處理后，把菌懸液直接涂布于Phe+Tyr+5-MT藥物篩選平板上(100ml液體基本培養(yǎng)基中添加一定量的藥物和L-苯丙氨酸、L-酪氨酸各10mg，瓊脂2.0，pH7.0～7.2 0.75kg/cm215min)(5-MT做1.5，2，3g/L三個濃度梯度)。32℃恒溫培養(yǎng)5天后，發(fā)現(xiàn)在3g/L藥物平板上不能生長，從2g/L平板上挑取生長良好的菌落共189株，編號TQ1001～TQ1189。對這189株菌進(jìn)行搖管初篩，發(fā)現(xiàn)有9株菌產(chǎn)酸水平有較大提高，經(jīng)營養(yǎng)缺陷標(biāo)記驗證均為雙缺。進(jìn)一步作搖瓶發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)菌株TQ1141的L-色氨酸產(chǎn)量最高(2.14g/L)，且產(chǎn)酸穩(wěn)定。遺傳標(biāo)記驗證及產(chǎn)酸結(jié)果如表1所示。
表1 5-MTr突變株的遺傳標(biāo)記和發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果
實施例25-氟色氨酸抗性突變株的篩選以TQ1141(由實施例1中Tx5-32(Phe-+Tyr-)菌株誘變得到)為出發(fā)菌株，經(jīng)測定其5-FT的臨界致死濃度為800mg/L。將TQ1141經(jīng)DES誘變處理后，把菌懸液直接涂布于5-FT藥物篩選平板上(5-FT做1，1.5，2g/L三個濃度梯度)。32℃恒溫培養(yǎng)5天后，從2g/L平板上挑取生長良好的菌落共180株，接種于保藏斜面培養(yǎng)基中，編號TQ1201～TQ1380。對這180株菌進(jìn)行搖管初篩，發(fā)現(xiàn)有12株菌產(chǎn)酸水平有較大提高，經(jīng)營養(yǎng)缺陷標(biāo)記驗證均為雙缺。進(jìn)一步作搖瓶發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)菌株TQ1205的L-色氨酸產(chǎn)量最高(2.94g/L)，且產(chǎn)酸穩(wěn)定。
實驗發(fā)現(xiàn)，菌株TQ 1205(Phe-+Tyr-+5-MTr+5-FTr)的生長對3g/L的5-FT仍然敏感。用紫外線繼續(xù)對TQ1205進(jìn)行誘變，將藥物篩選平板的5-FT濃度提高到6g/L(做4，5，6三個梯度)。32℃恒溫培養(yǎng)7天后，只有4g/L平板上出現(xiàn)少量菌落，從4g/L平板上挑取生長良好的菌落共84株，接種于保藏斜面培養(yǎng)基中，編號TQ1401～TQ1484。對這84株菌進(jìn)行搖管初篩，發(fā)現(xiàn)有5株菌產(chǎn)酸水平有較大提高，經(jīng)營養(yǎng)缺陷標(biāo)記驗證均為雙缺。進(jìn)一步作搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，L-色氨酸產(chǎn)量見表2所示。發(fā)現(xiàn)菌株TQ1463穩(wěn)定，平均產(chǎn)酸4.14g/L。
表2 5-FTr菌株復(fù)篩發(fā)酵結(jié)果
實施例3肉桂酸抗性突變株的篩選雖然菌株TQ1463中的L-色氨酸特異合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)得到一定程度的解除，而且合成L-Phe和L-Tyr的兩條代謝支路也被切斷，因此能夠積累一定量的L-色氨酸，但是，整個芳香族氨基酸的合成代謝流并沒有得到增強。在發(fā)酵過程中由于必需限量添加L-Phe和L-Tyr，因而會或多或少的存在著對DAHP合成酶的協(xié)同反饋抑制作用，為了從遺傳上解除這種反饋抑制作用，增強整個芳香族氨基酸的合成代謝流，可以篩選L-Phe或L-Tyr的結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，實驗中采用的藥物是L-Phe結(jié)構(gòu)類似物肉桂酸。
以TQ1463為出發(fā)菌株，經(jīng)測定其肉桂酸的臨界致死濃度為600mg/L。將TQ1463經(jīng)DES誘變處理后，把菌懸液直接涂布于肉桂酸藥物篩選平板上(肉桂酸做1，2，3g/L三個濃度梯度)。32℃恒溫培養(yǎng)5天后，從1g/L平板上挑取生長良好的菌落。將所得的肉桂酸抗性突變株進(jìn)行發(fā)酵初篩，其中有6株菌的色氨酸積累量在4～5g/L之間，經(jīng)驗證它們的遺傳標(biāo)記均為Phe-+Tyr-+5-MTr+5-FTr+CINr，經(jīng)搖瓶復(fù)篩后，得到一株菌株TQ2223產(chǎn)酸量穩(wěn)定，平均產(chǎn)酸量最高，達(dá)4.98g/L。
實施例4L-色氨酸菌種的標(biāo)記驗證本發(fā)明中提供的，用于生產(chǎn)L-色氨酸的是一種屬于棒桿菌屬的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)TQ2223(以下簡稱TQ2223)，該菌種原始菌種為ATCC13032(保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。選用TQ2223為供試菌株，該菌株具有Phe-和Tyr-營養(yǎng)缺陷標(biāo)記，5-MT、SG、5-FT和CIN抗性標(biāo)記。該菌無運動能力，不形成芽孢，革蘭氏染色顯陽性，在顯微鏡下觀察，呈短棒狀，兩端稍鈍圓，微彎，大部分呈八字形有規(guī)律排列。在完全培養(yǎng)基平板上形成的菌落為圓形，淡黃色，菌落中央隆起，表面光滑、濕潤，邊緣整齊，不產(chǎn)生水溶性色素，易被牙簽挑起。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)該菌最適生長溫度為30～32℃，在pH5～9時生長良好。
1、營養(yǎng)缺陷標(biāo)記的驗證(實驗中培養(yǎng)基成分以g/L計)取新鮮活化斜面(葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl 2.5，瓊脂20，pH7.0～7.2 0.1MPa 20min)菌種一滿環(huán)于無菌離心管(10ml)中，用9ml無菌水離心洗滌(3000r/min)兩次，然后懸于9ml無菌水中。取0.1ml菌懸液于固體基本培養(yǎng)基平板上(葡萄糖20，(NH4)2SO410，KH2PO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O0.4，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，生物素100μg，VB1100μg，瓊脂粉20，pH7.0～7.2，0.075MPa20min)，涂布均勻。將平板劃為四個相同的區(qū)域，按十字交叉交替貼上沾有苯丙氨酸和酪氨酸的濾紙片四塊，倒置于恒溫培養(yǎng)箱32℃培養(yǎng)24～48h，如果菌體只在苯丙氨酸和酪氨酸濾紙片之間的區(qū)域生長，則證明具有苯丙氨酸和酪氨酸雙重缺陷標(biāo)記。
按上述方法結(jié)果如圖2所示，該菌只在苯丙氨酸和酪氨酸都能擴(kuò)散到的交叉區(qū)域生長，說明其具有苯丙氨酸和酪氨酸雙重缺陷標(biāo)記(Phe-+Tyr-)。
2、抗性標(biāo)記的驗證按濃度梯度制備一系列的藥物平板(100ml液體基本培養(yǎng)基中添加抗性藥物(抗性藥物及濃度分別為5-MT為2g/L，5-FT為4g/L，CIN為1g/L，SG為2g/L)和L-苯丙氨酸、L-酪氨酸各10mg，瓊脂粉2.0g，pH7.0～7.2，0.075MPa 15min)，將菌懸液直接涂布于藥物平板上，32℃培養(yǎng)4～6天，以確定藥物抑制菌體生長的臨界濃度。對谷氨酸棒桿菌TQ2223進(jìn)行了5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸、肉桂酸和磺胺胍遺傳標(biāo)記(5-MTr、5-FTr、CINr、SGr)的驗證，其結(jié)果分別如表3、表4、表5、表6所示(+表示生長，-表示不生長)。
表3 谷氨酸棒桿菌TQ2223在不同5-甲基色氨酸濃度下的生長情況
表4 谷氨酸棒桿菌TQ2223在不同5-氟色氨酸濃度下的生長情況
表5 谷氨酸棒桿菌TQ2223在不同肉桂酸濃度下的生長情況
表6 谷氨酸棒桿菌TQ2223在不同磺胺胍濃度下的生長情況
從表3至表6可以看出，TQ2223具有較高的5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸、肉桂酸和磺胺胍抗性(5-MTr+5-FTr+CINr+SGr)。
實施例5利用菌TQ2223生產(chǎn)L-色氨酸通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上述所獲得的谷氨酸棒桿菌和在培養(yǎng)基中積累L-色氨酸，可以有效的生產(chǎn)L-色氨酸。
為了利用TQ2223生產(chǎn)L-色氨酸，可以利用含有碳源，氮源以及無機(jī)鹽和微量的其它營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸和維生素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
(NH4)2SO4對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響從新鮮斜面挑取一環(huán)TQ2223菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)及種子與發(fā)酵培養(yǎng)條件均同實施例4，種子培養(yǎng)基成分包括葡萄糖30，(NH4)2SO45，玉米漿40ml，豆餅水解液20，KH2PO4·3H2O 1.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，VB1300μg，VH 200μg，pH7.0～7.2，0.075MPa 15min。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括葡萄糖150，(NH4)2SO440，Phe 0.15，Tyr 0.15，豆餅水解液25ml，玉米漿22ml，KH2PO4·3H2O 10，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，VB1100μg，VH 50μg，CaCO30.2％(分消)，pH7.0～7.2，0.075MPa 15min。
1、(NH4)2SO4用量的確定由于(NH4)2SO4在底物不斷消耗的過程中會過早耗盡，成為產(chǎn)酸進(jìn)一步積累的限制條件，所以只要繼續(xù)供給足夠的氮源，微生物仍有能力再生成色氨酸。當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?.5％時流加葡萄糖液，保持(NH4)2SO4初始濃度40g/L不變，于發(fā)酵48h時分別進(jìn)行如下操作方式A不補加；方式B補加(NH4)2SO41g/瓶；方式C補加(NH4)2SO41.6g/瓶；方式D補加(NH4)2SO42.2g/瓶，結(jié)果見圖2。
從圖3中可以看出，方式B補加(NH4)2SO41g/瓶效果最好，此時，(NH4)2SO4總用量為60g/L，目的產(chǎn)物色氨酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到10.8g/L。
2、初始(NH4)2SO4濃度對發(fā)酵的影響碳氮比對氨基酸發(fā)酵的影響很大，由于補料分批發(fā)酵與分批發(fā)酵相比，初糖濃度降低，所以應(yīng)研究不同初銨濃度對發(fā)酵的影響。保持(NH4)2SO4總濃度60g/L不變，考查了不同初銨濃度(在發(fā)酵第24h和第48h分兩次補加剩余硫酸銨)對產(chǎn)酸的影響，實驗結(jié)果見圖4。
由圖4可以看出，初銨濃度以硫酸銨20g/L為好，L-色氨酸產(chǎn)量為11.5g/L。這是因為初始(NH4)2SO4濃度為10g/L時，初銨濃度偏低，發(fā)酵第24h銨離子可能已經(jīng)消耗完，因而產(chǎn)酸量不但未提高而且有所下降；初銨濃度較高，于發(fā)酵24h的銨鹽濃度仍較大，補銨后菌體仍處于較高濃度銨鹽環(huán)境下發(fā)酵，因而產(chǎn)酸量亦相對較低。
實施例6從新鮮斜面挑取一環(huán)TQ2223菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)及種子培養(yǎng)條件均同實施例4，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基成分同實施例2，以10％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。32℃振蕩培養(yǎng)72小時，轉(zhuǎn)速為220r/min，發(fā)酵過程中流加NaOH調(diào)節(jié)PH70-7.2。發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)L-組氨酸為8.6g/L。
實施例7從新鮮斜面挑取一環(huán)TQ2223菌株的菌苔于種子培養(yǎng)基中，斜面種子培養(yǎng)同實施例4，種子與發(fā)酵培養(yǎng)基均同實施例2，按10％接種量將種子液600mL接入10L發(fā)酵罐中，初始裝液量6.0L，初始溶氧為100％(以飽和亞硫酸鈉溶液中的溶氧為0，以空氣中的溶氧為100％)，培養(yǎng)溫度32℃，通過自動流加25％氨水溶液控制pH7.0±0.05。發(fā)酵期間，每隔2h取樣測殘?zhí)?，?dāng)殘?zhí)墙抵?5g/L以下時開始補料。根據(jù)耗糖速率確定補料量，維持葡萄糖濃度15-25g/L。TQ2223菌株在發(fā)酵15h時，可產(chǎn)酸1.5g/L以上，在大約65h達(dá)到產(chǎn)酸高峰期，其產(chǎn)酸量達(dá)18.0g/L以上。發(fā)酵過程見圖5。
權(quán)利要求
1.一種谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株TQ2223，以棒桿菌屬的谷氨酸棒桿菌ATCC13032(保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC10226)為出發(fā)菌種，通過逐步選育具有苯丙氨酸和酪氨酸缺陷(Phe-+Tyr-)，5-甲基色氨酸抗性(5-MTr)，磺胺胍抗性(SGr)，5-氟色氨酸抗性(5-FTr)，肉桂酸抗性(CINr)遺傳標(biāo)記的突變株TQ2223，使其具有L-色氨酸的生物合成能力。
2.一種權(quán)利要求1所述的氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株TQ2223的選育方法，其具體過程為第一步、誘變將谷氨酸棒桿菌ATCC13032經(jīng)硫酸二乙酯DES常規(guī)誘變后的菌株，經(jīng)離心洗滌制成菌懸液直接涂布于藥物平板上，其構(gòu)成為100ml液體基本培養(yǎng)基中添加抗性藥物和L-苯丙氨酸、L-酪氨酸各5-50mg，瓊脂1.5-3.0g，pH7.0～7.2 0.75kg/cm215min；其中基本培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖20，硫酸銨10，KH2PO41，MgSO40.4，F(xiàn)eSO40.01，MnSO40.01，生物素100μg，VB1100μg，瓊脂粉20，pH7.0～7.2 0.75kg/cm230min；抗性藥物及濃度分別為5-MT為2g/L，5-FT為4g/L，CIN為1g/L，SG為2g/L；32℃培養(yǎng)4～6天，挑取生長良好的大菌落接種于完全斜面培養(yǎng)基中保藏，完全斜面培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl 2.5，瓊脂條20，pH7.0～7.2 0.75kg/cm220min；第二步篩選(1)產(chǎn)色氨酸菌株的初篩將上步所得突變株從活化斜面培養(yǎng)基取一環(huán)接種到裝有5ml初篩種子培養(yǎng)基的大試管中，置于往復(fù)式搖床上，32℃，96r/min培養(yǎng)16～18小時，其中活化斜面培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖0.5-2，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，酵母膏1-10，NaCl 0.5-5，瓊脂條15-30，pH7.0～7.2 0.75kg/cm220min；初篩種子培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖10-80，硫酸銨2-8玉米漿5-50mL，酵母膏1-10，K2HPO40.2-2.0，KH2PO40.2-2.0 MgSO401-1.0，F(xiàn)eSO40.005-0.015，MnSO40.005-0.015，pH7.0～7.2 0.75kg/cm215min；然后吸取0.5ml種子液接種于裝有5ml初篩發(fā)酵培養(yǎng)基的大試管中，初篩發(fā)酵培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖50-180，硫酸銨5-50，K2HPO40.1-2.0，KH2PO40.1-2.0玉米漿5-50mL，MgSO40.1-1.0，F(xiàn)eSO40.005-0.015，MnSO40.005-0.015，pH7.0～7.2 0.75kg/cm215min；在32℃、轉(zhuǎn)速為96r/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)3天；發(fā)酵液離心后取上清液以對二甲胺基苯甲醛顯色，以目測法選出呈藍(lán)色深者，作為產(chǎn)色氨酸菌株，留作復(fù)篩用；(2)產(chǎn)色氨酸菌株的復(fù)篩將初篩獲得的產(chǎn)色氨酸菌的斜面取一環(huán)接種到裝有20ml上述初篩種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置于往復(fù)式搖床上，32℃、96r/min培養(yǎng)16～18小時，然后吸取4ml種子液接種于裝有40ml上述初篩發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，每株菌做5瓶，在32℃、轉(zhuǎn)速為96r/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)3天；發(fā)酵液離心后取上清液用對二甲胺基苯甲醛顯色后，用751G分光光度計于600nm下測定吸光度并根據(jù)色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出色氨酸的含量；在一次誘變所得的菌中，產(chǎn)酸較高并穩(wěn)定者作為下一次誘變的出發(fā)菌株；反復(fù)經(jīng)過上述誘變及搖瓶復(fù)篩后，得到一株產(chǎn)酸量穩(wěn)定、且產(chǎn)酸量最高的菌株TQ2223，經(jīng)驗證其遺傳標(biāo)記為Phe-+Tyr-+5-MTr+5-FTr+CINr。
3.一種谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變株TQ2223在發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸中的應(yīng)用，其特征在于將谷氨酸棒桿菌突變株TQ2223加入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為g/L葡萄糖80，(NH4)2SO440，Phe 0.15，Tyr 0.15，豆餅水解液25ml，玉米漿22ml，KH2PO4·3H2O 10，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，VB1100μg，VH50μg，CaCO30.2％分消，pH7.0～7.2，0.075MPa 15min；其中，碳源含量應(yīng)為1％～30％，氮碳比N∶C應(yīng)介于5∶100～50∶100之間，無機(jī)鹽含量應(yīng)為0.0001～10％，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH5.0～9.0，培養(yǎng)溫度20℃～40℃，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)1～4天，接種量為0.01％～10％(V/V)；發(fā)酵過程中，流加硫酸銨、氨水或氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.0～8.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為糖，葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖，甘露糖，淀粉或糖漿；或糖醇，甘油；或有機(jī)酸，醋酸；或低分子醇，乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為氨，或銨鹽∶硫酸銨，醋酸銨，硝酸銨，磷酸銨，乙酸銨或氯化銨；或有機(jī)氮∶蛋白胨，牛肉膏，玉米漿，或豆餅水解液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于無機(jī)鹽，為磷酸鉀鹽，硫酸鎂，碳酸鈣，硫酸亞鐵，或硫酸錳。
全文摘要
谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)TQ2223，該菌株具有苯丙氨酸和酪氨酸缺陷(Phe－+Tyr－)，5－甲基色氨酸抗性(5－MT
文檔編號C12R1/15GK1844357SQ20061001353
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日
發(fā)明者陳寧, 劉淑云, 徐慶陽 申請人:天津科技大學(xué)