專利名稱：利用核糖體操縱子間區(qū)探針檢測水生動物病原菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌檢驗技術(shù)，具體的講是運用核酸分子雜交反應(yīng)檢測致病細菌，特別是水生動物病原菌(包括殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、鮰魚愛德華氏菌、殺魚腸球菌、鏈球菌、嗜冷屈撓桿菌、柱狀屈撓桿菌、多殺巴斯德氏菌、殺魚巴斯德氏菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、丁香組假單胞菌、霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23種細菌)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前，水生動物病原微生物檢測方法基本上依靠生化鑒定和培養(yǎng)鑒定。這些鑒定費時費力，并且又是在種水平的鑒定上結(jié)果并不可靠。隨著分子生物學鑒定方法的發(fā)展，基于這些方法的細菌分類正逐漸被修正。這一狀況從側(cè)面說明了建立分子生物學鑒定方法的必要性。相關(guān)研究在國際上已廣泛開展，國內(nèi)這方面研究也在逐漸興起。
在水生動物病原微生物檢測方面，國內(nèi)基本上采用的是生化方法，鮮有芯片或微陣列應(yīng)用的文獻報道，國際上雖有水生動物致病微生物檢驗芯片的研究報道，但其檢測的范圍并不全面。從技術(shù)層面講，目前細菌分子檢測運用最多DNA靶點是16S rRNA基因。但在許多情況下，相近種之間在16S rRNA基因序列上的差異非常有限(同屬的細菌16S rRNA基因序列差別基本上小于4％相似度)，并且有時候這些差別位點分布比較均勻。所以用16S rRNA基因上的差別位點設(shè)計相近種鑒別探針難度較大，而且鑒別效果往往不理想。16S-23S rRNA可變區(qū)域多，分子量更大，與16S rRNA基因相比變異位點豐富而集中，但在種的水平上具有保守性。再加上一般細菌都有多個拷貝的rRNA操縱子，使得利用16S-23S設(shè)計種特異性探針非常便利，并且大大提高了探針的特異性。
DNA微陣列在水生動物疫病檢測方面有廣泛的應(yīng)用前景，能夠大大提高檢驗的效率，節(jié)省人力，時間。真正能夠做到一次檢驗給出可能感染的病原微生物的感染狀況的全面信息，并且結(jié)果準確，操作簡便快速。

發(fā)明內(nèi)容
目前我國尚沒有在水生動物疫病檢測方面運用寡核苷酸微陣列檢測病原菌的標準方法，依然沿用了增菌法、PCR方法、熒光PCR方法檢測水生動物疫病病原菌。增菌法需要經(jīng)過前增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等經(jīng)典的檢驗方法檢測目標菌。試驗時間長，處理樣品量小，而且靈敏度和特異性都相對較低。而PCR方法、熒光PCR方法檢測通量低，一次只能實現(xiàn)一種病原菌的檢驗。
針對上述情況，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供了一種運用寡核苷酸微陣列檢測病原菌技術(shù)檢測水生動物疫病病原菌的方法(包括殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、鮰魚愛德華氏菌、殺魚腸球菌、鏈球菌、嗜冷屈撓桿菌、柱狀屈撓桿菌、多殺巴斯德氏菌、殺魚巴斯德氏菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、丁香組假單胞菌、霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23種細菌)為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的首先用生物信息學方法設(shè)計特異性探針序列如下序列一星狀諾卡氏菌探針Nser2 CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA序列二星狀諾卡氏菌探針Nser1 GGCAAACCATCAGAGCATG序列三巴斯德氏菌屬通用探針PFirc1 TGTTCTTTAAAAAA(T/A)T(G/A)GAAACAAGCTG
序列四多殺巴斯德氏菌探針2 Pmulii3 AAGCGAAAGCAAAAGAGTGAAGCGA序列五殺魚巴斯德氏菌探針1 Pmulii2 CAATGAAGAGACAAAAAACCGAAATCC序列六鮰魚愛德華氏菌探針 Eict1 ACCCCGTGTCCCCTTCGTCTAGAGG序列七鮰魚愛德華氏菌探針2 Eict2 TTACAGCACGAAGTGAAACACCTTCG序列八遲緩愛德華氏菌探針1 Etar1 GGTAATAAGGTATTGCAGTAAAGTC序列九遲緩愛德華氏菌探針2 Etar2 ATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA序列十耶爾森氏菌屬通用探針YerFip1 TACAGCTGAAATTTACCCCGCC序列十一魯氏耶爾森氏菌探針1 YerFip2 AGATGTACTGTCAGCAATGA(C/T)AAGACA序列十二氣單胞菌屬通用探針1 AF&Valgip1GCTGATTTAAAAAGTAGTTCTCAAACATTTGT序列十三殺鮭氣單胞菌探針1 AF&Valgip3 AGCTACCCGGTTACCTGCGCGC序列十四殺鮭氣單胞菌探針2 AsalValipr GCTCGCGCGCAGGTAACCGGGT序列十五豚鼠氣單胞菌探針1 AcavG1ip1 GCCGCTAGCCTCGCAGGCTCGG序列十六豚鼠氣單胞菌探針2 AcavG1ip2 GCCTTTACGAAAATCATTGCGAA序列十七溫和氣單胞菌探針1 Asobculip1 TAATGGCGCTCGGCCTCGCAG序列十八溫和氣單胞菌探針2 Asobculip2 CGGCACTCGCCATTACCCAAAA序列十九鮭魚腎桿菌探針1 Rsalip1 AGATTCGATGGTTTGGGAGGTTC序列二十鮭魚腎桿菌探針2 Rsalip2 GATAACAGGCG(C/A)TCTGCTGATTC序列二十一產(chǎn)氣莢膜梭菌探針1 Cperfip1 AATGAATTCTGGATAATATCTCTGTTTAATTT序列二十二產(chǎn)氣莢膜梭菌探針2 Cperfip2AAGGAATACATCTTAGGAC(A/T)ACTAAGATGA序列二十三肉毒梭菌探針1 CbotripTAAATAAGAACTATTCATTAATTGTTAAAATTA(G/A)ATT序列二十四肉毒梭菌探針2 Cbotiip CTTCGAAAAAGAAGGTTTA(A/G)TTTAATGTAG序列二十五海分支桿菌探針2Mm2 ATTGGATGCGCTGCCTTTTGGTGGC序列二十六霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1 VcmIIp1 GAAAGATAAACACCAACAAC(A/C)CATT序列二十七霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2 VcmI3 p2AATTAAACGCGAGACAACTTAGGTTG序列二十八霍亂弧菌探針1 VchoI2p1 TCCACCATCTTTAAGCGTTTTCG序列二十九霍亂弧菌探針2 VchoI2p2 TCGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT序列三十創(chuàng)傷弧菌探針1 VvulI1p1 ACGACCCACCATTACTTCAAGAGTT
序列三十一創(chuàng)傷弧菌探針2 VvulI1p2 GCTCCACCATTCTTGAA(C/T)GCAAT序列三十二副溶血弧菌探針1 Vpar1 TATAAAGTAAAGAGAAGAAGAGTTCCCAAA序列三十三副溶血弧菌探針2 Vpar2 TCCATTAGGAATTAAAACTCAAAATATGGG序列三十四鰻弧菌探針1 TTTGA(A/C)ACAATGGGCGATTAGCT其中D代表堿基A或G或T中的任意一個；W代表堿基A或T中的任意一個。
然后PCR擴增待測樣品中全部原核微生物的16S-23S rRNA基因內(nèi)的部分DNA片斷運用寡核苷酸微陣列檢測多種水生動物病原菌的方法包括以下步驟1.設(shè)計特異性寡核苷酸探針，用于分子雜交-酶聯(lián)免疫顯色檢測；2.PCR擴增待測樣品中全部原核微生物的16S-23S rRNA基因的部分DNA片斷，同時進行地高辛標記；3.將設(shè)計的特異性寡核苷酸基因探針點在帶有正電荷的尼龍膜(Amersham公司，美國)上，組成探針微陣列，微陣列的點制按圖1中的順序和位置，在長波紫外燈下進行交聯(lián)5-10分鐘；本專利申請書的所有附圖中的點所對應(yīng)的探針均和圖1中所示一樣為1.陽性對照2.陰性對照3.星狀諾卡氏菌探針Nser2 CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA4.星狀諾卡氏菌探針NSER1 GGCAAACCATCAGAGCATG5.巴斯德菌屬通用探針PFirc1 TGTTCTTTAAAAAA(T/A)T(G/A)GAAACAAGCTG6.多殺巴斯德氏菌探針2 Pmulii3 AAGCGAAAGCAAAAGAGTGAAGCGA7.殺魚巴斯德氏菌探針1 Pmulii2 CAATGAAGAGACAAAAAACCGAAATCC8.鮰魚愛德華氏菌探針Eict1 ACCCCGTGTCCCCTTCGTCTAGAGG9.鮰魚愛德華氏菌探針2 Eict2 TTACAGCACGAAGTGAAACACCTTCG10.遲緩愛德華氏菌探針1 Etar1 GGTAATAAGGTATTGCAGTAAAGTC11.遲緩愛德華氏菌探針2 Etar2 ATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA12.耶爾森氏菌屬通用探針YerFip1 TACAGCTGAAATTTACCCCGCC13.魯氏耶爾森氏菌探針1 YerFip2 AGATGTACTGTCAGCAATGA(C/T)AAGACA14.氣單胞菌屬通用探針1 AF&Valgip1 GCTGATTTAAAAAGTAGTTCTCAAACATTTGT15.殺鮭氣單胞菌探針1 AF&Valgip3 AGCTACCCGGTTACCTGCGCGC16.殺鮭氣單胞菌探針2AsalValipr GCTCGCGCGCAGGTAACCGGGT17.豚鼠氣單胞菌探針1AcavG1ip1 GCCGCTAGCCTCGCAGGCTCGG18.豚鼠氣單胞菌探針2AcavG1ip2 GCCTTTACGAAAATCATTGCGAA
19.溫和氣單胞菌探針1 Asobculip1 TAATGGCGCTCGGCCTCGCAG20.溫和氣單胞菌探針2 Asobculip2 CGGCACTCGCCATTACCCAAAA21.鮭魚腎桿菌探針1 Rsalip1 AGATTCGATGGTTTGGGAGGTTC22.鮭魚腎桿菌探針2 Rsalip2 GATAACAGGCG(C/A)TCTGCTGATTC23.產(chǎn)氣莢膜梭菌探針1 Cperfip1 AATGAATTCTGGATAATATCTCTGTTFAATTT24.產(chǎn)氣莢膜梭菌探針2 Cperfip2 AAGGAATACATCTTAGGAC(A/T)ACTAAGATGA25.肉毒梭菌探針1 Cbotrip TAAATAAGAACTATTCATTAATTGTTAAAATTA(G/A)ATT26.肉毒梭菌探針2 Cbotiip CTTCGAAAAAGAAGGTTTA(A/G)TTTAATGTAG27.海分支桿菌探針2Mm2 ATTGGATGCG CTGCCTTTTG GTGGC28.霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1 VcmIIp1 CGAAAGATAAACACCAACAAC(A/C)CATT29.霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2 VcmI3p2 AATTAAACGCGAGACAACTTAGGTTG30.霍亂弧菌探針1 VchoI2p1 TCCACCATCTTTAAGCGTTTTCG31.霍亂弧菌探針2 VchoI2p2 TCGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT32.創(chuàng)傷弧菌探針1 VvulI1p1 ACGACCCACCATTACTTCAAGAGTT33.創(chuàng)傷弧菌探針2 VvulI1p2 GCTCCACCATTCTTGAA(C/T)GCAAT34.副溶血弧菌探針1 Vpar1 TATAAAGTAAAGAGAAGAAGAGTTCCCAAA35.副溶血弧菌探針2 Vpar2 TCCATTAGGAATTAAAACTCAAAATATGGG36.鰻弧菌探針1 TTTGA(A/C)ACAATGGGCGATTAGCT4.雜交和雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物1 10μmol/L 2μL引物2 10μmol/L 2μLdNTPs 每種 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水33.1μL總體積50μLPCR方法中擴增程序為
1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重復(fù)5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重復(fù)25次9)72℃2min將濃度為1mmol/L的寡核苷酸探針溶液0.1μL點在帶有正電荷的尼龍膜上，在長波紫外燈下進行交聯(lián)5-10分鐘。
其地高辛標記PCR產(chǎn)物與寡核苷酸探針雜交方法如下*預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把點入寡核苷酸探針的尼龍膜放入塑料袋，加入預(yù)雜交液，封好口。預(yù)雜交30min，50℃。
*擴增PCR產(chǎn)物熱變性DIG標記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛標記靶DNA分子與尼龍膜雜交把預(yù)雜交好的芯片裝入塑料袋，加入變性的DIG標記的PCR產(chǎn)物10uL，再加入1mL雜交液，封好口。50℃，雜交1hr，溫和攪動。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是該方法具有檢測準確、特異性強的特點，可以快速、準確的鑒定特異的目標細菌。首先，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時間；而且DNA-DNA的雜交鑒定方法較生理生化的鑒定方法更為準確，不受培養(yǎng)條件和細菌生理狀態(tài)的影響，這將填補使用DNA分子雜交的鑒定方法進行水生動物疫病病原菌檢測的空白。


圖1微陣列的探針位置示意圖。
圖2某批次活魚的微陣列檢測檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌的結(jié)果。
圖3某批次活魚的微陣列檢測檢出遲緩愛德華的結(jié)果。
圖4某批次活魚的微陣列檢測檢出創(chuàng)傷弧菌的結(jié)果。
圖5某批次活魚的微陣列檢測檢出多殺巴斯德的結(jié)果。
圖6某批次活魚的微陣列檢測檢出副溶血弧菌的結(jié)果。
圖7某批次活魚的微陣列檢測檢出鮭魚腎桿菌的結(jié)果。
圖8某批次活魚的微陣列檢測檢出海分枝桿菌的結(jié)果。
圖9某批次活魚的微陣列檢測檢出鮰魚愛德華氏菌的結(jié)果。
圖10某批次活魚的微陣列檢測檢出霍亂弧菌的結(jié)果。
圖11某批次活魚的微陣列檢測檢出魯氏耶爾森的結(jié)果。
圖12某批次活魚的微陣列檢測檢出鰻弧菌的結(jié)果。
圖13某批次活魚的微陣列檢測檢出擬態(tài)弧菌的結(jié)果。
圖14某批次活魚的微陣列檢測檢出肉毒梭菌的結(jié)果。
圖15某批次活魚的微陣列檢測檢出殺鮭氣單胞的結(jié)果。
圖16某批次活魚的微陣列檢測檢出殺魚巴斯德的結(jié)果。
圖17某批次活魚的微陣列檢測檢出豚鼠氣單胞的結(jié)果。
圖18某批次活魚的微陣列檢測檢出溫和氣單胞菌的結(jié)果。
圖19某批次活魚的微陣列檢測檢出星狀諾卡氏菌的結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出產(chǎn)氣莢膜梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提取樣品魚鱗片下表皮、腎組織、肝組織、心臟各一克，勻漿后混合振蕩，取勻漿液1mL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，加100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，補加TE緩沖液500μl，振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚pH值8.0，強烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，吸取上清液，重復(fù)酚抽提。吸取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。棄去上清，加70％冰乙醇振蕩洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清。加入50μLTE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段成分 濃度 加樣量PCR緩沖液10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶5u/μL 0.3μL引物110μmol/L2μL引物210μmol/L2μLdNTPs 每種 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水33.1μL總體積50LPCR方法中擴增程序為1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重復(fù)5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重復(fù)25次9)72℃ 2min
3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交*預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把點入寡核苷酸探針的尼龍膜放入塑料袋，加入預(yù)雜交液，封好口。預(yù)雜交30min，50℃。
*擴增PCR產(chǎn)物熱變性DIG標記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛標記靶DNA分子與尼龍膜雜交把預(yù)雜交好的芯片裝入塑料袋，加入變性的DIG標記的PCR產(chǎn)物10uL，再加入1mL雜交液，封好口。50℃，雜交1hr，溫和攪動。
4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十三(產(chǎn)氣莢膜梭菌探針1 Cperfip1)、探針位點二十四(產(chǎn)氣莢膜梭菌探針2 Cperfip2)、均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有產(chǎn)氣莢膜梭菌，見圖2。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有產(chǎn)氣莢膜梭菌。這說明產(chǎn)氣莢膜梭菌寡核苷酸探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例2樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出遲緩愛德華疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十(遲緩愛德華氏菌探針1 Etar1)、探針位點十一(遲緩愛德華氏菌探針2 Etar2)均為深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有遲緩愛德華氏菌，見圖3。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有遲緩愛德華氏菌。這說明遲緩愛德華氏菌探針陽性結(jié)果是有效的。
實施例3樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出創(chuàng)傷弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三十二(創(chuàng)傷弧菌探針1 VvulI1p1)、探針位點三十三(創(chuàng)傷弧菌探針2 VvulI1p2)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有創(chuàng)傷弧菌，見圖4。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有創(chuàng)傷弧菌。這說明創(chuàng)傷弧菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例4樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出多殺巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點五(巴斯德菌屬通用探針PFirc1)、探針位點六(多殺巴斯德氏菌探針2 Pmulii3)、均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有多殺巴斯德氏菌，見圖5。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有多殺巴斯德氏菌。這說明多殺巴斯德氏菌寡核苷酸探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例5樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出副溶血弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三十四(副溶血弧菌探針1Vpar1)、探針位點三十五(副溶血弧菌探針2Vpar2)均為深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有副溶血弧菌，見圖6。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有副溶血弧菌。這說明副溶血弧菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例6樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出鮭魚腎桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十一(鮭魚腎桿菌探針1 Rsalip1)、探針位點二十二(鮭魚腎桿菌探針2 Rsalip2)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有鮭魚腎桿菌，見圖7。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有鮭魚腎桿菌。這說明鮭魚腎桿菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例7樣本；某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出海分枝桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十七(海分支桿菌探針2 Mm2)深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有海分枝桿菌，見圖8。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有海分枝桿菌。這說明海分枝桿菌寡核苷酸探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例8樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出鮰魚愛德華氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點八(鮰魚愛德華氏菌探針1 Eict1)、探針位點九(鮰魚愛德華氏菌探針2 Eict2)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有魯氏耶爾森，見圖9。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有鮰魚愛德華氏菌。這說明鮰魚愛德華氏菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例9樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出霍亂弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十八(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1)、探針位點二十九(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2)探針位點三十(霍亂弧菌探針1 VchoI2p1)探針位點三十一(霍亂弧菌探針2 VchoI2p2)均為深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有霍亂弧菌，見圖10。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有霍亂弧菌。這說明霍亂弧菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例10樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出魯氏耶爾森氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十二(耶爾森氏菌屬通用探針YerFip1)、探針位點十三(魯氏耶爾森氏菌探針1 YerFip2)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有魯氏耶爾森氏菌，見圖11。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有魯氏耶爾森氏菌。這說明魯氏耶爾森氏菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例11樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出鰻弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三十六(鰻弧菌探針1)見圖12。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有鰻弧菌。這說明鰻弧菌寡核苷酸探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例12樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出擬態(tài)弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十八(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1 VcmIIp1)、探針位點二十九(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2 VcmI3p2)均為深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有擬態(tài)弧菌，見圖13。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有擬態(tài)弧菌。這說明擬態(tài)弧菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例13
樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出肉毒梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十五(肉毒梭菌探針1 Cbotrip)、探針位點二十六(肉毒梭菌探針2 Cbotrip)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有肉毒梭菌，見圖14。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有肉毒梭菌。這說明肉毒梭菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例14樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出殺鮭氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十四(氣單胞菌屬通用探針1 AF&Valgip1)、探針位點十五(殺鮭氣單胞菌探針1 AF&Valgip3)、探針位點十六(殺鮭氣單胞菌探針2 AsalValipr)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有殺鮭氣單胞菌，見圖15。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有殺鮭氣單胞菌。這說明殺鮭氣單胞菌探針探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例15樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出殺魚巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點五(巴斯德菌屬通用探針PFirc1)、探針位點七(殺魚巴斯德氏菌探針1 Pmulii2)均為深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有殺魚巴斯德氏菌，見圖16。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有殺魚巴斯德氏菌氏菌。這說明殺魚巴斯德氏菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例16樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出豚鼠氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十四(氣單胞菌屬通用探針1 AF&Valgip1)、探針位點十七(豚鼠氣單胞菌探針1 AcavG1ip1)探針位點十八(豚鼠氣單胞菌探針2 AcavG1ip2)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有豚鼠氣單胞菌，見圖17。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有豚鼠氣單胞菌。這說明豚鼠氣單胞菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例17樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出溫和氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十四(氣單胞菌屬通用探針1 AF&Valgip1)、探針位點十九(溫和氣單胞菌探針1 Asobculip1)探針位點二十(溫和氣單胞菌探針2 Asobculip2)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有溫和氣單胞菌，見圖18。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有溫和氣單胞菌。這說明溫和氣單胞菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例18樣本某批次進口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出星狀諾卡氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提2.PCR擴增16S-23S rRNA基因片段3.靶基因擴增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒說明進行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三(星狀諾卡氏菌探針Nser2)、探針位點四(星狀諾卡氏菌探針NSER1)均深藍色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有星狀諾卡氏菌，見圖19。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有星狀諾卡氏菌。這說明星狀諾卡氏菌探針的陽性結(jié)果是有效的。
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<110>南開大學<120>利用核糖體操縱子間區(qū)探針檢測水生動物病原菌的方法<130>20060710<160>34<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>星狀諾卡氏菌<220>
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1.一種利用核糖體操縱子間區(qū)探針檢測水生動物病原菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)設(shè)計特異性寡核苷酸探針，用于寡核苷酸微陣列檢測檢測，所設(shè)計的特異性寡核苷酸探針序列如下序列一星狀諾卡氏菌探針Nser2 CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA序列二星狀諾卡氏菌探針NSER1 GGCAAACCATCAGAGCATG序列三巴斯德菌屬通用探針PFirc1 TGTTCTTTAAAAAA(T/A)T(G/A)GAAACAAGCTG序列四多殺巴斯德氏菌探針2 Pmulii 3 AAGCGAAAGCAAAAGAGTGAAGCGA序列五殺魚巴斯德氏菌探針1 Pmulii 2 CAATGAAGAGACAAAAAACCGAAATCC序列六鲴魚愛德華氏菌探針Eict1 ACCCCGTGTCCCCTTCGTCTAGAGG序列七鲴魚愛德華氏菌探針2 Eict2 TTACAGCACGAAGTGAAACACCTTCG序列八遲緩愛德華氏菌探針1 Etar1 GGTAATAAGGTATTGCAGTAAAGTC序列九遲緩愛德華氏菌探針2 Etar2 ATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA序列十耶爾森氏菌屬通用探針YerFip1 TACAGCTGAAATTTACCCCGCC序列十一魯氏耶爾森氏菌探針1 YerFip2 AGATGTACTGTCAGCAATGA(C/T)AAGACA序列十二氣單胞菌屬通用探針1 AF&Valgip1GCTGATTTAAAAAGTAGTTCTCAAACATTTGT序列十三殺鮭氣單胞菌探針1 AF&Valgip3 AGCTACCCGGTTACCTGCGCGC序列十四殺鮭氣單胞菌探針2 AsalValipr GCTCGCGCGCAGGTAACCGGGT序列十五豚鼠氣單胞菌探針1 AcavGlip1 GCCGCTAGCCTCGCAGGCTCGG序列十六豚鼠氣單胞菌探針2 AcavGlip2 GCCTTTACGAAAATCATTGCGAA序列十七溫和氣單胞菌探針1 Asobculip1 TAATGGCGCTCGGCCTCGCAG序列十八溫和氣單胞菌探針2 Asobculip2 CGGCACTCGCCATTACCCAAAA序列十九鮭魚腎桿菌探針1 Rsalip1 AGATTCGATGGTTTGGGAGGTTC序列二十鮭魚腎桿菌探針2 Rsalip2 GATAACAGGCG(C/A)TCTGCTGATTC序列二十一產(chǎn)氣莢膜梭菌探針1 Cperfip1 AATGAATTCTGGATAATATCTCTGTTTAATTT序列二十二產(chǎn)氣莢膜梭菌探針2 Cperfip2AAGGAATACATCTTAGGAC(A/T)ACTAAGATGA序列二十三肉毒梭菌探針1 CbotripTAAATAAGAACTATTCATTAATTGTTAAAATTA(G/A)ATT序列二十四肉毒梭菌探針2 Cbotiip CTTCGAAAAAGAAGGTTTA(A/G)TTTAATGTAG序列二十五海分支桿菌探針2 Mm2 ATTGGATGCG CTGCCTTTTG GTGGC序列二十六霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1 VcmIIp1 GAAAGATAAACACCAACAAC(A/C)CATT序列二十七霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2 VcmI3p2 AATTAAACGCGAGACAACTTAGGTTG序列二十八霍亂弧菌探針1 VchoI2p1 TCCACCATCTTTAAGCGTTTTCG序列二十九霍亂弧菌探針2 VchoI2p2 TCGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT序列三十創(chuàng)傷弧菌探針1 VvulI1p1 ACGACCCACCATTACTTCAAGAGTT序列三十一創(chuàng)傷弧菌探針2 VvulI1p2 GCTCCACCATTCTTGAA(C/T)GCAAT序列三十二副溶血弧菌探針1Vpar1 TATAAAGTAAAGAGAAGAAGAGTTCCCAAA序列三十三副溶血弧菌探針2Vpar2 TCCATTAGGAATTAAAACTCAAAATATGGG序列三十四鰻弧菌探針1 TTTGA(A/C)ACAATGGGCGATTAGCT(2)PCR擴增待測樣品中全部原核微生物的23s rRNA基因內(nèi)的DNA片，同時進行地高辛標記；(3)將寡核苷酸微陣列和地高辛標記的PCR產(chǎn)物進行分子雜交；(4)雜交結(jié)果通過酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)顯色；(5)顯色結(jié)果用肉眼觀察，可發(fā)現(xiàn)進行雜交的特異性探針位點顯色。
2.運用核糖體操縱子間區(qū)探針檢測多種水生動物病原菌的方法在檢測方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用核糖體操縱子間區(qū)探針組成寡核苷酸微陣列檢驗多種能夠?qū)е滤鷦游飩魅静〔≡姆椒?，其技術(shù)原理為分子雜交——酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)，屬于細菌檢測技術(shù)，其技術(shù)方案是用生物信息學方法設(shè)計特異性探針，包括設(shè)計篩選的34條用作探針的寡核苷酸序列以及與之配套的PCR和雜交反應(yīng)條件。通過PCR擴增并用地高辛標記細菌16s－23srRNA基因間區(qū)序列，并用該PCR產(chǎn)物和一組特異性的寡核苷酸探針雜交，經(jīng)酶聯(lián)免疫顯色顯色后，可以從待測樣品中，精確檢測出是否存在水生動物傳染病病原菌。該方法的優(yōu)點是，省去了重復(fù)的細菌培養(yǎng)篩選環(huán)節(jié)，節(jié)約時間；分子雜交鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準確。
文檔編號C12Q1/04GK1877327SQ20061001476
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者黃熙泰, 侯艷梅, 劉寅, 張立懷, 鄭澤軍, 高旗利, 周浩, 董志珍, 李永君, 王玉玲, 魏曉娜, 霍蕾 申請人:南開大學, 中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局