專利名稱：工廠化昆蟲病原線蟲活體高倍繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種工廠化昆蟲病原線蟲活體高倍繁殖方法。
背景技術(shù)：
目前，地下害蟲防治和隱蔽性害蟲防治主要采用化學(xué)藥劑，但是該方法易造成人畜中毒，還會(huì)污染環(huán)境。并且多次防治成本高，害蟲還容易產(chǎn)生抗藥性。隨著人們對食品安全性要求的提高，以及對化學(xué)藥劑可能給生態(tài)環(huán)境帶來潛在危機(jī)的考慮，篩選可替代化學(xué)藥劑的生防治制劑成為迫切需要。
當(dāng)今已篩選出蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)、白僵菌(Beauveriabrongniatii)、綠僵菌(Metarhizium anisopliae)等作為生物防治制劑，但防治一些地下害蟲和隱蔽性害蟲效果不是很理想。而昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic Nematode)是昆蟲的?；纳蕴鞌?。以侵染期蟲態(tài)(即三齡線蟲IJ)隨寄主食物或從昆蟲的肛門、氣孔、節(jié)間膜進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，隨后釋放其攜帶的共生細(xì)菌，這些共生細(xì)菌迅速繁殖，使寄主昆蟲患敗血癥于48小時(shí)之內(nèi)死亡。昆蟲病原線蟲是一種很有潛能的生物防治因子。當(dāng)今世界上有許多國家，如美國、澳大利亞、新西蘭、德國、埃及等國家都投入大量的人力、物力研究利用這種線蟲，致力于將線蟲產(chǎn)品銷售到世界各地。1994年據(jù)Lisansky & Coombs統(tǒng)計(jì)，在發(fā)達(dá)國家的生物農(nóng)藥市場中，昆蟲病原線蟲這種新型殺蟲劑的市場銷售額僅次于工業(yè)蘇云金芽胞桿菌，已經(jīng)成功地應(yīng)用于防治盆栽作物、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜和牧草、草坪等地下害蟲和果樹、觀賞園林等林木上隱蔽性害蟲。所以昆蟲病原線蟲這種新型生物殺蟲劑具有廣闊的應(yīng)用前景，但所用線蟲數(shù)量極少，不能滿足市場需求。
因?yàn)槔ハx病原線蟲能夠大量培養(yǎng)繁殖，所以可以將其推廣應(yīng)用。雖然傳統(tǒng)的White trap法繁殖得到的線蟲侵染力較高，但其規(guī)模遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了當(dāng)今市場的需求，廣東昆蟲研究所韓日疇采用人工離體繁殖的方法，美國生產(chǎn)線蟲的發(fā)酵罐已從5升、20升到Biosys公司生產(chǎn)斯氏線蟲15000升，生產(chǎn)異小桿線蟲7500升的規(guī)模，雖然線蟲產(chǎn)量較高，但其致病力有所下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種工廠化昆蟲病原線蟲活體高倍繁殖方法，是工廠化大量高倍活體繁殖昆蟲病原線蟲，達(dá)到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中生物防治蟲害的良好效果。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是對已有的離體繁殖，改為活體繁殖，使線蟲對農(nóng)業(yè)害蟲的致病力明顯增強(qiáng)，并且產(chǎn)量與效率較高，成本低，質(zhì)量好，防治效果明顯提升。
本發(fā)明采用培養(yǎng)介質(zhì)接種侵染期線蟲后與寄主昆蟲混合裝入繁殖袋中，將繁殖袋置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，將得到大量的昆蟲病原線蟲。具體步驟如下(參見附圖)a.繁殖袋質(zhì)地篩選寄主昆蟲采用黃粉蟲，培養(yǎng)介質(zhì)用蛭石。從市場買回來的蛭石用自來水浸泡，洗干凈，然后在60℃烘箱中烘干至恒重。
侵染前期準(zhǔn)備把1Kg蛭石裝在布袋中浸泡在蒸餾水桶中，完全浸泡之后，取出布袋，掛起來，曬干直至布袋上不滴水，再稱布袋的重量，計(jì)算蛭石含水量，即蛭石完全浸透所需水量。
侵染將線蟲懸液，配成一定濃度的線蟲懸浮液。將一定濃度的線蟲懸浮液噴在蛭石上，使蛭石完全濕透，沒有水溢出為宜。
布袋是17×26cm大小，布料質(zhì)地有尼龍、純棉，設(shè)侵染每頭末齡黃粉蟲的異小桿線蟲劑量為50條IJ、斯氏線蟲100條IJ。結(jié)果繁殖袋采用純棉布制作的線蟲產(chǎn)量是尼龍袋的5倍。
b.培養(yǎng)介質(zhì)篩選選用當(dāng)?shù)厝菀撰@得且價(jià)格便宜的資源——蛭石和珍珠巖，寄主昆蟲、培養(yǎng)介質(zhì)處理和侵染劑量同a步，結(jié)果以蛭石為培養(yǎng)介質(zhì)的線蟲產(chǎn)量是珍珠巖的3倍。
c.培養(yǎng)介質(zhì)是否滅菌寄主昆蟲、培養(yǎng)介質(zhì)處理和侵染劑量同a步，結(jié)果培養(yǎng)介質(zhì)不滅菌的線蟲產(chǎn)量高于滅菌的1.25倍，所以考慮到繁殖效率培養(yǎng)介質(zhì)不必滅菌。
d.繁殖袋翻動(dòng)與否寄主昆蟲、培養(yǎng)介質(zhì)處理和侵染劑量同a步，結(jié)果繁殖袋翻動(dòng)與不翻動(dòng)的線蟲產(chǎn)量相當(dāng)，所以繁殖袋也不必翻動(dòng)。
e.侵染劑量篩選寄主昆蟲與培養(yǎng)介質(zhì)混合比例、收獲時(shí)間、繁殖袋大小進(jìn)行正交組合試驗(yàn)，寄主昆蟲和培養(yǎng)介質(zhì)處理同a步，結(jié)果寄主昆蟲(黃粉蟲)與培養(yǎng)介質(zhì)(蛭石)混合比例是三比二；異小桿線蟲侵染劑量是800條侵染期線蟲/克黃粉蟲(斯氏線蟲侵染劑量是1600條侵染期線蟲/克黃粉蟲)；繁殖袋大小選用17×26cm；異小桿線蟲的收獲時(shí)間是培養(yǎng)12天時(shí)開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養(yǎng)15天時(shí)再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次(斯氏線蟲的收獲時(shí)間是培養(yǎng)10天時(shí)開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養(yǎng)13天時(shí)再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次)；f.收獲方法優(yōu)化收獲后將線蟲懸浮液沉淀，移去上清液后再用放在瓷盤上的面巾紙過濾除去雜質(zhì)，可保持線蟲原有的致病力，并且壽命比不過濾儲(chǔ)存的線蟲延長6倍。
g.工廠化生產(chǎn)選擇以上篩選出的最佳培養(yǎng)參數(shù)，將繁殖袋懸掛在25℃裝有空調(diào)的房間里，每天觀察懸在繁殖袋上的彈簧秤的讀數(shù)，以監(jiān)控繁殖袋的失水量，當(dāng)失水達(dá)到50％時(shí)，應(yīng)用蒸餾水噴濕布袋。最終獲取繁殖倍數(shù)高、質(zhì)量好的線蟲。
所用儀器設(shè)備DHP-9162A恒溫培養(yǎng)相(天津泰斯特)、30405359相差顯微鏡(麥克奧迪)、S633069冷光源解剖鏡(麥克奧迪)、Z18400微量移液器(上海)。


圖1為昆蟲病原線蟲活體繁殖流程圖具體實(shí)施方式
本發(fā)明是中國科學(xué)院學(xué)科前沿領(lǐng)域項(xiàng)目“利用病原線蟲防治大豆地下害蟲及大豆孢囊線蟲rDNA-ITS-RFLP研究”(編號20020101)中的主要內(nèi)容。我們于2002年1月至2005年12月在中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所按以上步驟進(jìn)行了工廠化試驗(yàn)性生產(chǎn)，獲取了昆蟲病原線蟲活體最佳高倍繁殖方法的成功，可解決線蟲數(shù)量少不能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的難題，經(jīng)過試驗(yàn)防治地下害蟲效果達(dá)到80％以上，既獲得了經(jīng)濟(jì)效益，又獲得了生態(tài)效益。
本發(fā)明的使用材料分布廣，價(jià)格便宜，可降低成本。廣泛應(yīng)用于盆栽作物、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、牧草、草坪等地下害蟲防治和果樹、觀賞園林等林木上隱蔽性害蟲防治，本發(fā)明將進(jìn)一步提高昆蟲病原線蟲的產(chǎn)量和質(zhì)量，促進(jìn)我國生物防治的發(fā)展。
權(quán)利要求
1.一種工廠化生產(chǎn)昆蟲病原線蟲活體高倍繁殖方法，其特征在于該目前的離體繁殖為活體繁殖，其步驟如下a.繁殖袋質(zhì)地篩選寄主昆蟲采用黃粉蟲，培養(yǎng)介質(zhì)用蛭石。從市場買回來的蛭石用自來水浸泡，洗干凈，然后在60℃烘箱中烘干至恒重；侵染前期準(zhǔn)備把1Kg蛭石裝在布袋中浸泡在蒸餾水桶中，完全浸泡之后，取出布袋，掛起來，曬干直至布袋上不滴水，再稱布袋的重量，計(jì)算蛭石含水量，即蛭石完全浸透所需水量；侵染將線蟲懸液，配成一定濃度的線蟲懸浮液，將一定濃度的線蟲懸浮液噴在蛭石上，使蛭石完全濕透，沒有水溢出為宜；布袋是17×26cm大小，布料質(zhì)地有尼龍、純棉，設(shè)侵染每頭末齡黃粉蟲的異小桿線蟲劑量為50條IJ、斯氏線蟲100條IJ；b.培養(yǎng)介質(zhì)篩選選用當(dāng)?shù)厝菀撰@得且價(jià)格便宜的資源——蛭石和珍珠巖，寄主昆蟲、培養(yǎng)介質(zhì)處理和侵染劑量同a步；c.培養(yǎng)介質(zhì)是否滅菌寄主昆蟲、培養(yǎng)介質(zhì)處理和侵染劑量同a步，考慮到繁殖效率，培養(yǎng)介質(zhì)不必滅菌；d.繁殖袋翻動(dòng)與否寄主昆蟲、培養(yǎng)介質(zhì)處理和侵染劑量同a步，為提高繁殖效率，繁殖袋不必翻動(dòng)；e.侵染劑量篩選寄主昆蟲與培養(yǎng)介質(zhì)混合比例、收獲時(shí)間、繁殖袋大小進(jìn)行正交組合試驗(yàn)，寄主昆蟲和培養(yǎng)介質(zhì)處理同a步，效果較好的是寄主昆蟲(黃粉蟲)與培養(yǎng)介質(zhì)(蛭石)混合比例是三比二；異小桿線蟲侵染劑量是800條侵染期線蟲/克黃粉蟲(斯氏線蟲侵染劑量是1600條侵染期線蟲/克黃粉蟲)；繁殖袋大小選用17×26cm；異小桿線蟲的收獲時(shí)間是培養(yǎng)12天時(shí)開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養(yǎng)15天時(shí)再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次(斯氏線蟲的收獲時(shí)間是培養(yǎng)10天時(shí)開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養(yǎng)13天時(shí)再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次)；f.收獲方法優(yōu)化收獲后將線蟲懸浮液沉淀，移去上清液后再用放在瓷盤上的面巾紙過濾除去雜質(zhì)，可保持線蟲原有的致病力；g.工廠化生產(chǎn)選擇以上篩選出的最佳培養(yǎng)參數(shù)，將繁殖袋懸掛在25℃裝有空調(diào)的房間里，每天觀察懸在繁殖袋上的彈簧秤的讀數(shù)，以監(jiān)控繁殖袋的失水量，當(dāng)失水達(dá)到50％時(shí)，應(yīng)用蒸餾水噴濕布袋。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種工廠化昆蟲病原線蟲活體高倍繁殖方法。改目前的離體繁殖為活體繁殖，明顯提高了對農(nóng)業(yè)害蟲的致病能力，并且產(chǎn)量與效率較高，成本低，質(zhì)量好，防治效果明顯提升。本發(fā)明的使用材料分布廣，價(jià)格便宜，可降低成本。廣泛應(yīng)用于盆栽作物、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、牧草、草坪等地下害蟲防治和果樹、觀賞園林等林木上隱蔽性害蟲防治，本發(fā)明將進(jìn)一步提高昆蟲病原線蟲產(chǎn)量和質(zhì)量，促進(jìn)我國生物防治的發(fā)展。
文檔編號C12N1/10GK1928065SQ20061001656
公開日2007年3月14日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月24日
發(fā)明者李春杰, 許艷麗, 王 義 申請人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所