專利名稱：鵝精液冷凍稀釋液試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
精液冷凍保存是人工授精技術(shù)的一項重大革新。它解決了精液長期保存的問題，使精液不受時間、地域和種畜生命的限制，可充分利用良種最佳階段的遺傳性能，極大限度的發(fā)揮和提高優(yōu)良種公鵝的利用率，大大提高遺傳進(jìn)展，加速品種的育成和改良步伐。同時，對優(yōu)良種公鵝在短期進(jìn)行后裔測定，保留和恢復(fù)某一品種或個體公鵝的優(yōu)秀特性，以及在進(jìn)行血統(tǒng)更新、引種、減低生產(chǎn)成本和品種資源保護(hù)等方面都具有重要意義和應(yīng)用價值。
近50多年來，國內(nèi)外學(xué)者及動物繁殖技術(shù)研究者對家畜、家禽的精液冷凍保存和人工授精技術(shù)進(jìn)行了大量的研究。尤其，自1949年英國Polge等發(fā)現(xiàn)甘油(丙三醇)對牛精子具有抗凍保護(hù)作用后，該技術(shù)研究與應(yīng)用取得了飛速的發(fā)展，尤其在乳牛上的應(yīng)用效果已同鮮精無明顯差異。因此國內(nèi)外畜牧工作者已相繼在牛、羊、馬、豬、雞、鵝、鴨、火雞等種畜禽上開展了精液冷凍保存的研究，均取得了重大進(jìn)展和顯著效果。在家禽(鵝、雞、鴨、火雞等)主要從如下幾方面進(jìn)行了大量研究一、精液冷凍保護(hù)劑的篩選目前雞精液冷凍保護(hù)劑主要有甘油、DMSO(二甲亞砜)、DMA(N，N-二甲基乙酰胺)以及EG(乙二醇)等。1951年P(guān)olge及同事在偶然的試驗中發(fā)現(xiàn)了甘油對雞精子的冷凍保護(hù)作用，這在雞精液冷凍上具有劃時代的意義。在此之前有關(guān)雞精液冷凍的所有試驗都未能成功，此主要是由于，一方面在稀釋液中加入的甘油(雞精液冷凍時的甘油濃度多為6-8％)可提高精子抗凍能力，Watanabe等(1980)報道甘油濃度7％的雞冷凍精液在5℃和37℃解凍的能凍性為65.8％~81.7％；但另一方面其對精子也有一定的毒害作用(即抗受精作用)。Hammerestedt和Graham(1992)指出，雞精液冷凍中甘油的作用是主要有①影響精子細(xì)胞漿的物理狀況(如胞漿的組成成分和黏度)；②改變精子細(xì)胞膜的滲透性及穩(wěn)定性；③與精子表面的膜蛋白以非共價鍵的形式結(jié)合。在精液的冷凍過程中，甘油通過上述三種方式影響精子的代謝和生物能的平衡。
對于EG的研究，Hubner等(1988)用乙二醇(Ethylene Glyc01)和DMA作低溫保護(hù)劑冷凍雞精液，獲得55％-64％受精率。王紅軍等(1998)也報道，以一定比例的DMA和EG混合作為冷凍保護(hù)劑取得了較好的精液效果，其中以1∶1的比例混合，最終濃度以8％作為冷凍保護(hù)劑，解凍后畸形精子比例最少。而DMSO做冷凍保護(hù)劑，在冷凍過程中對精子形態(tài)的損害比較小，但對冷凍保護(hù)效果的報道結(jié)論不一。Sexton等(1978)比較了4％DMSo和8％甘油的冷凍保護(hù)效果，結(jié)果表明，4％DMSO的冷凍保護(hù)效果明顯優(yōu)于8％的甘油；而據(jù)Mitchell(1976)的研究結(jié)果，DMSO幾乎沒有冷凍保護(hù)作用。
DMA作為冷凍保護(hù)劑在雞精液冷凍中應(yīng)用在20世紀(jì)80年代末和90年代初就有成功的報道。Lake(1988)報道，稀釋液中加入1.0M的DMA后冷凍而成的雞精液，解凍后輸精，受精率為76％；Schramm(1991)報道，以DMA做雞精液冷凍保護(hù)劑，解凍后給53~57周齡的來航雞輸精，受精率可達(dá)90％。李世英等(1995)的研究結(jié)果表明，對于防凍保護(hù)劑的選擇，甘油、DMSO都有保護(hù)作用，但以DMA防凍效果較好。可在-80℃~-100℃低溫下冷凍或液氮中直接滴凍都能獲得滿意結(jié)果；但本發(fā)明的申請人徐日福等(1997)的試驗表明，甘油、DMSO、DMA、EG對精子的存活都會產(chǎn)生較顯著的毒害作用(P＜0.05)，其中以DMA的毒性最小，乙二醇和DMSO次之。可見，篩選出高效、無毒的、優(yōu)良冷凍保護(hù)劑是種公鵝精液冷凍的重要環(huán)節(jié)之一。
二、冷凍保存技術(shù)工藝精液冷凍前的平衡過程和冷凍速率是影響冷凍精液受精率的關(guān)鍵因素。Brown等(1963)、Sexton(1978)分別采用甘油、DMSO做冷凍保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn)不同的平衡時間對保護(hù)效果不同；由此可見，精液冷凍前適當(dāng)?shù)钠胶鈺r間有利于精液的保存效果。關(guān)于雞精液冷凍速率的研究發(fā)現(xiàn)，慢速冷凍取得較滿意的結(jié)果，Sexton(1980)試驗發(fā)現(xiàn)，以1℃/分鐘速率將雞精液從5℃降溫到-20℃(第一步)，然后放在液氮蒸汽中(第二步)，以3℃/分鐘降溫到-80℃時，投入液氮中，可獲得較高的受精率；Lake(1978)主張精液以1℃/分的速率冷卻到-35℃，用靈敏的程控冷凍器在-35℃保持5分鐘后放進(jìn)液氮罐里貯存，Bacon等(1986)將精液以3℃/分的速率冷卻到-35℃浸入液氮，兩者都獲得較理想的冷凍效果。Nobom等(1991)介紹了一種簡易快速的雞精液冷凍方法將新鮮精液用冷的glutamate-raffinose HEPES 9R.H液進(jìn)行1∶2稀釋；稀釋后即分裝到0.25mL的牛冷凍細(xì)管中，每管裝0.15mL，經(jīng)封口后，在液氮上方1~2cm處的蒸汽中停1分鐘。然后放進(jìn)液氮保存。經(jīng)輸精效果測定，5％DMSO組凍精的受精率可達(dá)58％。
目前雞精液的冷凍技術(shù)主要采用Bellagamba(1993)的方法用于冰(-79℃)和液氮(-196℃)，以1~10℃/分鐘速率降溫，以50-70℃/分鐘速率解凍。精液凍結(jié)期間的關(guān)鍵時刻是從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)(-5℃~-15℃)的時候。以較低速(1-18℃/分鐘)通過這一過渡期，并加快-15℃以下的降速，效果較好。
三、冷凍精液解凍方法家禽冷凍精液的解凍方法主要有兩種即低溫(0-5℃)慢速解凍和高溫(高于50℃)快速解凍，一般高溫快速解凍的效果優(yōu)于低溫慢速解凍。關(guān)于解凍溫度，李世英等(1995)報道，雞凍精的解凍溫度以50~60℃最為適宜，50℃以下解凍時間長，不利于快速通過危險溫度區(qū)；60℃)./上溫度太高，不易掌握。劉振發(fā)(2003)等報道粒狀精液的解凍步驟是將0.4mL的速保精溶液裝入玻璃小瓶，置于60℃恒溫水槽中1~2分鐘后取出，再將冷凍小瓶內(nèi)的粒狀精液迅速倒入玻璃小瓶混合，隨即將解凍后的精液置于冰塊間供人工授精之用。
四、冷凍保存效果與評價關(guān)于精液冷凍保存的研究，在家禽中以雞最早，Shaffner等人于1941年雞精子冷凍首次獲得成功，此后許多研究者開展了雞精液冷凍方面的試驗，試驗通過雞精液稀釋液，冷凍保護(hù)劑，冷凍速率，解凍及輸精方法等的研究逐步使這項技術(shù)趨于完善。Ohara等(1990)、Schramm(1991)先后報道，用冷凍精液輸精的受精率都不同程度地高于雞自然交配的受精率(85％)。但根據(jù)許多采用雞冷凍精液輸精效果的報道(Watanabe et al，1985；Sexton，1981；Wishart，1985；Wishart，1985；Lake，1986)，冷凍精液的受精率均低于新鮮精液。盡管Tselutin等(1995)分別對鵝、鴨及火雞進(jìn)行了精液冷凍保存的試驗。火雞精液的冷凍將火雞精液進(jìn)行3倍稀釋，稀釋后的精液以0.6~0.8℃/分鐘速率降到-2~-3℃；每份精液再添加0.16mLDMA，混勻后放在液氮蒸汽上再降到-2~-3℃，這些降了溫的精液用移液管滴入液氮(每滴0.05~0.07mL)，每隔一周輸精1次，輸精量為0.15~0.07mL/只，受精率達(dá)80~90％。但該方法通常在實驗室進(jìn)行，不適宜農(nóng)場中的大量推廣。
對鴨精液冷凍方法將裝有已稀釋的鴨精液(比例為0.25mL精液1mL稀釋液)的青霉素瓶放在冰箱里(2~4℃)30~40分鐘，加入5％的DMA，放進(jìn)-75℃~-80℃程序冷凍器(cryostat)里4分鐘，最后投進(jìn)液氮。解凍是在65℃的水中進(jìn)行；7天中輸精兩次，輸精量為0.15-0.20mL/只，受精率達(dá)69％-90％。韓雪峰等(2003)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10％DMSO做鴨精液的冷凍保護(hù)劑凍后活力最高(達(dá)0.7以上)，經(jīng)小群輸精、孵化測定，受精率達(dá)65％；平衡時間10min、解凍溫度40℃時，鴨精子凍后活力最好(平均為0.69和0.71)。
鵝精液冷凍將精液1∶3稀釋，稀釋液的溫度為18-20℃，取稀釋后的精液2-4mL在2-4℃的冰箱內(nèi)放置40分鐘，再添加4％DMA。進(jìn)行顆粒冷凍，在氟塑料盤中預(yù)冷到-180℃，再投入液氮里保存。制成的顆粒凍精放在60-70℃水中的青霉素藥瓶里解凍。每5天輸精1次(輸精量為0.2mL/只)，受精率達(dá)81％-90％。Mitchell(1997)等和Ansah以及Bacldand(1983)估測了雞冷凍精子液的遺傳力，證明了精子抗凍能力的遺傳性；Lake(1981)認(rèn)為可根據(jù)精子抗凍能力選擇公雞。韓雪峰等(2003)也發(fā)現(xiàn)，公鴨的精子抗凍性存在極顯著差異(P＜0.01)，因此應(yīng)對公鴨精子抗凍性狀進(jìn)行選擇，以培育精子耐凍性強(qiáng)的品系提高冷凍精液的受精率。我國也先后開展了相關(guān)的研究，但至今，尚沒有冷凍精液在家禽生產(chǎn)中應(yīng)用的報道。可見，目前國內(nèi)外在(公)鵝精液冷凍保護(hù)試劑盒的研制和應(yīng)用上仍是空白。
綜合以上的國內(nèi)外研究資料不難發(fā)現(xiàn)，有許多精液冷凍效果不穩(wěn)定，甚至較差，此主要是在現(xiàn)有的精液冷凍技術(shù)方法上仍存在如下4個方面的不足或缺陷(1)精液冷凍基礎(chǔ)稀釋液的配方組成是最重要的環(huán)節(jié)之一，但在有關(guān)報道中很少詳細(xì)介紹稀釋液的組成成分，僅僅提到一些主要組分而已，而無詳盡的配方資料可以參考。在基礎(chǔ)稀釋液的配方及配伍上缺乏篩選。
(2)在冷凍保護(hù)劑的選擇和使用濃度上沒有預(yù)先進(jìn)行毒力性實驗，帶有一定的盲目性。
(3)在基礎(chǔ)稀釋液和冷凍保護(hù)劑的配伍和配比方面缺乏實驗依據(jù)。
(4)有些冷凍程序或技術(shù)工藝不合理，操作方法過于復(fù)雜、不方便使用。如冷凍平衡時間、平衡溫度以及冷凍必須進(jìn)行特異性測試；再如所要求的低溫(5℃)離心及滲析等，在生產(chǎn)上應(yīng)用，可行性就受到影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種保存精子活力高、保存時間長、使用簡便地鵝精液冷凍稀釋液試劑盒及使用方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是試劑盒共包括如下四種組分組分I谷氨酸鈉0.4-0.6、磷酸二氫鉀1.4-2.2、磷酸氫二鉀0.2-0.5、半胱胺酸0.006-0.01、果糖0.9-1.2、肌醇0.04-0.08、棉子糖0.5-0.8、青霉素鈉8-12、硫酸鏈霉素0.07-0.15、氯化鈣0.01-0.02、三羧甲基氨基甲烷0.1-0.3。
組分II雙蒸水100。
組分III硫酸魚精蛋白0.04-0.06g。
組分IV二甲基乙酰胺(DMA)4.5-5.5、乙二醇4.5-5.5ml。
以上各成分為重量單位，青霉素鈉為萬單位。
本發(fā)明的使用方法是I、第一步稀釋精液采集后，置于30℃的水溫中，用同溫的不含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第一步1∶1稀釋后，用棉花包好，放在5℃的冰箱中平衡2小時。
II、第二步稀釋第一步稀釋后，再用相同溫度的含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第二步稀釋，并繼續(xù)保存15~30min后進(jìn)行滴凍。滴凍時所用吸管及其它玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可進(jìn)行操作。
III、滴凍在盛有液氮的廣口液氮罐中，使銅紗網(wǎng)距液氮面高度保持1～2cm。待銅紗網(wǎng)充分冷卻后，開始滴凍。每毫升稀釋后的精液約滴十粒。滴凍后加蓋3分鐘，于液氮保存。采用干解凍法進(jìn)行解凍。精液顆粒解凍時，在40℃的恒溫下解凍。
本發(fā)明的有益效果是(1)對基礎(chǔ)營養(yǎng)稀釋粉的配方進(jìn)行了改進(jìn)，同時添加了很少被人們使用的三羧甲基氨基甲烷和硫酸魚精蛋白等成分，并進(jìn)行了準(zhǔn)確量化。
(2)冷凍保護(hù)劑同時選用了低毒性的雙冷凍劑，按9-11％的濃度進(jìn)行配合。
(3)首次對鵝精液冷凍稀釋液各組成成分按試劑盒的包裝形式進(jìn)行配制。使用方便，操作簡單。
(4)本試劑盒的使用配套有優(yōu)化的“二步法”精液冷凍工藝程序和精液冷凍顆粒解凍方法，提高了試劑盒的使用效果。
具體實施例方式
工藝條件主要器材冰箱、液氮罐，OLYPUS恒溫臺付倒立相差顯微鏡、恒溫水浴鍋、溫度計、采精杯、輸精管和保溫杯、血球計數(shù)板，計數(shù)器等。
藥品與試液甘油，乙二醇，二甲基亞B((DMSO)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、青、鏈霉素等；A液(含谷氨酸鈉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，果糖，Tris等)；B液(含谷氨酸鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，葡萄糖，肌醇，棉子糖等)，以上各種試劑成分均從商業(yè)上獲得。
1、鵝精液冷凍基礎(chǔ)營養(yǎng)稀釋粉配方的篩選以吉林白鵝父母代為試驗材料，隨機(jī)取260日齡的吉林白鵝、皖西白鵝父母代種公雞各90只，從中各選10只健康、精液品質(zhì)好的公鵝供采精用。采用不同配方的基礎(chǔ)營養(yǎng)稀釋液，對不同品種鵝的精液進(jìn)行稀釋，以甘油為冷凍保護(hù)劑，將精液按已優(yōu)化的冷凍步驟進(jìn)行冷凍保存試驗，通過試驗效果，篩選最佳稀釋液配方。每個配方重復(fù)試驗3次。
(1)不同配方成分的基礎(chǔ)營養(yǎng)稀釋粉的配置其中包括兩個系列、不同配置、配比的基礎(chǔ)營養(yǎng)稀釋粉，共有12個不同的配方(每個系列各6個配方)，分別以100ml雙蒸水稀釋成基礎(chǔ)稀釋液。這12個配方分別由A和B兩個系列構(gòu)成，其配方的主要成分為A系列(含谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、果糖、Tris等)；B系列(含谷氨酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、葡萄糖、肌醇、棉子糖等)。
(2)精液采集采用背部按摩法采集公鵝精液。采集過程中要求精液無糞便、血液和飼料等污染。采集后用棉花包好，置于保溫杯中，迅速帶回實驗室，待處理。
(3)精液冷凍步驟精液采集后，置于30℃的水溫中，用同溫的不含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第一步1∶1稀釋后，用棉花包好，放在5℃的水箱中平衡2小時左右，再用相同溫度的含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第二步稀釋。在冷凍箱中加入液氮，使銅紗網(wǎng)距液氮面高度保持1～2cm。待銅紗網(wǎng)充分冷卻后，開始滴凍。每毫升精液約滴十粒。滴凍后加蓋3分鐘，于液氮保存。數(shù)分鐘后用干解凍法進(jìn)行解凍。30℃下觀察精子活力。冷凍時所用吸管及其他玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可進(jìn)行操作。
(4)活力檢查以全部精子呈直線運(yùn)動，定為1.0，50％的精子直線運(yùn)動其活力定為0.5，10％的精子呈直線運(yùn)動其活力為0.1，依次類推。
2、精液冷凍保護(hù)劑的篩選與濃度確定本實驗以吉林白鵝父母代為材料，以甘油、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)為主要冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保護(hù)劑毒性檢驗。從中篩選出毒性最小、冷凍保護(hù)劑冷凍效果最好的保護(hù)劑及其最佳濃度。
(1)冷凍保護(hù)劑毒性實驗取300日齡吉林白鵝父母代種公鵝80只，從中選10只健康、精液品質(zhì)好的公鵝供采精用。經(jīng)實驗篩選出的冷凍效果較好的兩種稀釋液(A、B液)中，分別加入一定濃度的甘油、乙二醇、DMA和DMSO，配成8種冷凍保護(hù)液(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8)。采集的精液分為8組，在相同溫度下分別用8種冷凍保護(hù)液進(jìn)行1∶2稀釋。以不加冷凍保護(hù)劑的鮮精液作為對照。稀釋后檢查精子活力，然后在20℃下保存，每隔兩小時觀察一次活力，直到精干全部死亡為止。記錄各次活力。計算精于生存指數(shù)。8種冷凍保護(hù)液分別為A1(A+乙二醇)、A2(A+甘油)、A3(A+DMA)、A4(A+DMSO)、A5(B+乙二醇)、A6(B+甘油)、A7(B+DMA)、A8(B+DMSO)。
(2)幾種不同的冷凍保護(hù)劑冷凍效果的比較以A、B液為基礎(chǔ)液，依次分別在其中加入相同濃度的甘油、乙二醇、DMA、DMSO組成8種冷凍保護(hù)液，將精液按冷凍步驟進(jìn)行冷凍，解凍后觀察精子活力。重復(fù)5次，比較各冷凍保護(hù)劑效果的優(yōu)劣。
(3)A、B基礎(chǔ)液中冷凍保護(hù)劑最佳濃度的確定A液中分別加入2％、4％、6％、8％、9％、10％、11％和12％的DMA配成冷凍保護(hù)液；以A液作為基礎(chǔ)液，添加不同比例的混合冷凍保護(hù)劑C1(含甘油+乙二醇，1∶1)，C2(含乙二醇+DMA，1∶1)，C3(含DMA)；以B液作稀釋液時，僅以DMA和乙二醇作冷凍保擴(kuò)劑，分為四組，其中D0含10％的DMA，D1含乙二醇和DMA，配比1∶1，濃度10％，D2含8％的乙二醇和DMA進(jìn)行配合，D3含10％的乙二醇和DMA，混合比為2∶2。分別配制成冷凍保護(hù)液，對精液進(jìn)行冷凍，解凍后觀察精子活力，比較不同濃度的冷凍保護(hù)劑對精液冷凍的保護(hù)效果，確定A、B液中最佳的冷凍保護(hù)劑濃度。重復(fù)3次。
3、精液冷凍保護(hù)稀釋液配方的優(yōu)化取300日齡吉林白鵝父母代種公鵝80只，從中選10只健康、精液品質(zhì)好的公鵝供采精用。本實驗力求在簡單、可行的條件下，進(jìn)行硫酸魚精蛋白和谷氨酰胺對雞精液冷凍效果作用的試驗研究，旨在為改進(jìn)現(xiàn)有的稀釋液配方，提高凍精的精子活力，為獲得較高的、穩(wěn)定的受精率和孵化率提供參考數(shù)據(jù)。
(1)硫酸魚精蛋白對精液冷凍的作用分別在上述試驗中已篩選出的A0、B0兩種最佳冷凍保護(hù)液中分別加入0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10克的硫酸魚精蛋白進(jìn)行冷凍(E1、E2、……、E7和F1、F2、……、F7共14個組)，以A0及B0作對照，進(jìn)行冷凍，解凍后觀察精子活力，重復(fù)3次。
(2)谷氨酰胺對精液冷凍的作用分別在上述A0、B0兩種最佳冷凍保護(hù)液中分別加入一定劑量的谷氨酰胺進(jìn)行冷凍(G1、G2、G3、G4、G5和H1、H2、H3、H4、H5共10個組)，以A0及B0作對照，進(jìn)行冷凍，解凍后觀察精子活力，重復(fù)3次。
4、精液冷凍條件的優(yōu)化在上述有關(guān)試驗的基礎(chǔ)上，從確定精液冷凍最佳時間和解凍溫度入手，摸索最佳冷凍方法，優(yōu)化冷凍程序，旨在改進(jìn)雞精液保存技術(shù)，以獲得較高、較穩(wěn)定的受精率。
(1)精液稀釋后最佳作用時間的確定精液采集后用不含冷凍保護(hù)劑的A液進(jìn)行第1步稀釋(1∶1)，用棉花包好后，放在5℃的冰箱中平衡2h后，進(jìn)行第2步稀釋，稀釋后5、10、15、30、60、120min后(分別為M1、M2、MA3、M4、M5、M6組)進(jìn)行滴凍，觀察解凍后精子活力，確定2次稀釋至冷凍之間的最佳時間，即冷凍保護(hù)劑與精子作用的最佳時間，重復(fù)4次。
(2)不同解凍溫度對精子活力的影響冷凍后的同一組的精液顆粒分別在5、10、20、30、37、40、50、60、65、70℃溫度下(定為N1、N2、……、N10)進(jìn)行解凍，觀察解凍后各組精液的活力，確定最佳解凍溫度，重復(fù)4次。
5、精液冷凍效果的檢驗、比較從上述試驗中篩選出最佳精液冷凍稀釋液配方、冷凍保護(hù)劑及濃度，以優(yōu)化后的精液冷凍保存程序進(jìn)行公鵝精液冷凍，制成凍精顆粒。進(jìn)行凍精顆粒解凍后，人工授精，對種蛋的受精率進(jìn)行比較評價，以檢驗精液的最終冷凍效果。
取300日齡吉林白鵝父母代種公鵝80只，從中選10只健康、精液品質(zhì)好的公鵝供采精，進(jìn)行精液冷凍。取分別已冷凍保存了10天、30天、3個月、6個月、10個月、2年的冷凍精液進(jìn)行解凍后，人工授精。取300日齡、健康無病、產(chǎn)蛋率高的吉林白鵝父母代種母鵝600只，供輸精試驗。母鵝每隔4天輸精一次，從第二次輸精后的第7天開始收集種蛋，進(jìn)行孵化。所收集的種蛋在18℃恒溫條件下保存，在7天以內(nèi)入孵。孵化方式采用常用的人工孵化程序進(jìn)行，于孵化第7天檢驗種蛋的受精情況，統(tǒng)計種蛋的受精率。
本發(fā)明的效果1、精液冷凍試驗效果評價研究結(jié)果證實，以A液為基礎(chǔ)稀釋液的6個配方中，其中一個配方(見表1)的凍精顆粒解凍后的精子活力最高，為0.45-0.53。冷凍保護(hù)劑毒性及冷凍保護(hù)效果實驗表明，以9-11％的乙二醇和DMA(1∶1)進(jìn)行配合的A液冷凍液所獲得的精子活力最高，為0.43-0.57。經(jīng)A液配方冷凍液增加0.04-0.06克的硫酸魚精蛋白后，精子活力提高了3-6％；最后經(jīng)改進(jìn)精液冷凍條件后，解凍后的精子活力達(dá)0.47-0.68，受精率達(dá)76.7％-86.9％，接近于鮮精液人工授精效果，遠(yuǎn)高于本交條件下的種蛋受精率。
2、試劑盒組成成分的確定綜合上述“精液冷凍試驗效果評價”，最終確定，以稀釋液配方為精液冷凍的基礎(chǔ)營養(yǎng)稀釋粉配方，再添加9-11％的乙二醇和DMA(1∶1)冷凍保護(hù)劑及0.04-0.06克(每100ml基礎(chǔ)稀釋液中)的硫酸魚精蛋白進(jìn)行配合，組成本發(fā)明的試劑盒。
3、試劑盒使用說明用法瓶蓋啟開后，首先將組分瓶II中的雙蒸水100ml全部倒入組分瓶I中，同時加入組分瓶III的硫酸魚精蛋白，再將組分瓶I重新加蓋，充分搖勻，直至瓶中的基礎(chǔ)營養(yǎng)稀釋粉完全溶解。再將稀釋液平均分裝于兩瓶中，其中一瓶加入組分瓶IV中的冷凍保護(hù)劑，振蕩，以充分溶解、混合均勻，備用。
用量冷凍稀釋液∶鮮精液＝1∶1~2使用時注意①發(fā)現(xiàn)試劑瓶有破裂時勿用；②溶解后，冷凍稀釋液在冰箱保存不宜超過24小時。
保質(zhì)期常溫下2個月。
4、“二步法”精液冷凍程序的建立①第一步稀釋精液采集后，置于30℃的水溫中，用同溫的不含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第一步1∶1稀釋后，用棉花包好，放在5℃的冰箱中平衡2小時。
②第二步稀釋第一步稀釋后，再用相同溫度的含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第二步稀釋，并繼續(xù)保存15~30min后進(jìn)行滴凍。滴凍時所用吸管及其它玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可進(jìn)行操作。
③滴凍在盛有液氮的廣口液氮罐中，使銅紗網(wǎng)距液氮面高度保持1～2cm。待銅紗網(wǎng)充分冷卻后，開始滴凍。每毫升稀釋后的精液約滴十粒。滴凍后加蓋3分鐘，于液氮保存。
5、精液冷凍顆粒解凍方法采用干解凍法進(jìn)行解凍精液顆粒解凍時，解凍溫度以30～40℃之間為宜。凍精經(jīng)40℃的水浴解凍后，在20min內(nèi)將解凍精液用完，方可獲得較高的受精率。
實施例
實施例1在技術(shù)推廣基地，操作者用本試劑盒，試劑盒中，基礎(chǔ)營養(yǎng)稀釋粉組成成分為谷氨酸鈉0.55g，磷酸二氫鉀2.0g，磷酸氫二鉀0.36g，半胱胺酸0.07g，果糖0.11g，肌醇0.05g，棉子糖0.6g，Tris0.2g，青霉素鈉10萬單位，硫酸鏈霉素0.09g，氯化鈣0.01g；硫酸魚精蛋白，0.042g；DMA5.0g和乙二醇4.5ml。按試劑盒使用說明配制冷凍稀釋液。
采用背部按摩法采集公鵝精液。采集過程中要求精液無糞便、血液和飼料等污染。采集后用棉花包好，置于保溫杯中，迅速帶回實驗室，待處理。并嚴(yán)格按照上述所建立的“二步法”精液冷凍程序，即①第一步稀釋精液采集后，置于30℃的水溫中，用同溫的不含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第一步1∶1稀釋后，用棉花包好，放在5℃的冰箱中平衡2小時。②第二步稀釋第一步稀釋后，再用相同溫度的含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第二步稀釋，并繼續(xù)保存15~30min后進(jìn)行滴凍。滴凍時所用吸管及其它玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可進(jìn)行操作。③滴凍在盛有液氮的廣口液氮罐中，使銅紗網(wǎng)距液氮面高度保持1～2cm。待銅紗網(wǎng)充分冷卻后，開始滴凍。每毫升稀釋后的精液約滴十粒。滴凍后加蓋3分鐘，于液氮保存。采用干解凍法進(jìn)行解凍。精液顆粒解凍時，在40℃的恒溫下解凍。輸精前，首先進(jìn)行精子活力檢查，并按前述的精子活力記分方法進(jìn)行記錄。
選用300日齡、健康無病、產(chǎn)蛋率高的吉林白鵝父母代種母鵝1500只，進(jìn)行輸精。在20min內(nèi)把解凍精液用完。母鵝每隔4天輸精一次，從第二次輸精后的第7天開始收集種蛋，進(jìn)行孵化。所收集的種蛋在18℃恒溫條件下保存，在7天以內(nèi)入孵。孵化方式采用常用的人工孵化程序進(jìn)行，于孵化第7天檢驗種蛋的受精情況，統(tǒng)計種蛋的受精率。檢查結(jié)果如表1所示表1 鵝精液冷凍保護(hù)試劑盒使用效果觀察

根據(jù)表2的精子活力和種蛋受精率結(jié)果顯示，在所檢測的6批保存時間不同的冷凍精液中，隨著凍精顆粒冷凍保存時間的不同，保存6天至1年，其精子活力差異不顯著，但保存1年與2、3年時間的精子活力有一定差異，隨時間的延長，精子活力呈降低趨勢。但精子活力均在0.40以上(0.40-0.68)，達(dá)到并超過了用于人工授精的標(biāo)準(zhǔn)(0.3)。在對種蛋受精的影響上，凍精顆粒保存時間對種蛋受精率有一定影響，但在使用后仍獲得了較高受精率，76.8％-86.3％。均接近于鮮精的人工授精效果。
實施例2在技術(shù)推廣相關(guān)單位，操作者按試劑盒使用說明配備了冷凍稀釋液。采用背部按摩法采集公鵝精液。并嚴(yán)格按照上述所建立的“二步法”精液冷凍程序，進(jìn)行鵝的精液冷凍后。操作者按照實施例子1中的方法和操作步驟進(jìn)行冷凍精液顆粒解凍，精子活力檢查、記錄；并進(jìn)行凍精解凍后的人工授精、種蛋采集、保存人工孵化、記錄等。所輸精的父母代種母鵝1200只，390日齡、健康無病、產(chǎn)蛋率高。進(jìn)行輸精后，結(jié)果如表2所示表2 鵝精液冷凍保護(hù)試劑盒使用效果觀察

從表2中可見，凍精顆粒解凍后的精子活力范圍，為0.44-0.70，種蛋受精率為84.7-86.2％，兩項技術(shù)指標(biāo)均接近于鮮精的人工授精效果。此外，這兩項技術(shù)參數(shù)與表1中相吻合，表明，該試劑盒性能穩(wěn)定，重現(xiàn)率較高。
實施例3在技術(shù)推廣相關(guān)單位，操作者按試劑盒使用說明配制了冷凍稀釋液。采用背部按摩法采集公鵝精液。并嚴(yán)格按照上述所建立的“二步法”精液冷凍程序，進(jìn)行鵝的精液冷凍后。操作者按照實施例子1中的方法和操作步驟進(jìn)行冷凍精液顆粒解凍，精子活力檢查、記錄；并進(jìn)行凍精解凍后的人工授精、種蛋采集、保存人工孵化、記錄和統(tǒng)計等。所輸精的父母代種母鵝1500只，330日齡、健康無病、產(chǎn)蛋率高。進(jìn)行輸精后，結(jié)果如表3所示
表3 鵝精液冷凍保護(hù)試劑盒使用效果觀察

從表3中可見，凍精顆粒解凍后的精子活力范圍，為0.43-0.69，種蛋受精率為83.9-85.1％，兩項技術(shù)指標(biāo)均與表1、2中相一致，接近于鮮精的人工授精效果。此表明，該試劑盒性能穩(wěn)定，重現(xiàn)率較高，應(yīng)用效果較理想。
權(quán)利要求
1.一種鵝精液冷凍稀釋液試劑盒，其組分是組分I谷氨酸鈉0.4-0.6、磷酸二氫鉀1.4-2.2、磷酸氫二鉀0.2-0.5、半胱胺酸0.006-0.01、果糖0.9-1.2、肌醇0.04-0.08、棉子糖0.5-0.8、青霉素鈉8-12、硫酸鏈霉素0.07-0.15、氯化鈣0.01-0.02、三羧甲基氨基甲烷0.1-0.3；組分II雙蒸水100；組分III硫酸魚精蛋白0.04-0.06g；組分IV二甲基乙酰胺(DMA)4.5-5.5、乙二醇4.5-5.5ml；以上各成分為重量單位，青霉素鈉為萬單位。
2.一種鵝精液冷凍稀釋液試劑盒的使用方法，其使用方法是I、第一步稀釋精液采集后，置于30℃的水溫中，用同溫的不含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第一步1∶1稀釋后，用棉花包好，放在5℃的冰箱中平衡2小時。II、第二步稀釋第一步稀釋后，再用相同溫度的含冷凍保護(hù)劑的稀釋液進(jìn)行第二步稀釋，并繼續(xù)保存15~30min后進(jìn)行滴凍；滴凍時所用吸管及其它玻璃器皿，都要在5℃下充分平衡后方可進(jìn)行操作；III、滴凍在盛有液氮的廣口液氮罐中，使銅紗網(wǎng)距液氮面高度保持1～2cm；待銅紗網(wǎng)充分冷卻后，開始滴凍；每毫升稀釋后的精液約滴十粒；滴凍后加蓋3分鐘，于液氮保存；采用干解凍法進(jìn)行解凍；精液顆粒解凍時，在40℃的恒溫下解凍。
全文摘要
一種鵝精液冷凍稀釋液試劑盒及使用方法，屬于動物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，其試劑盒組分組分I谷氨酸鈉0.4－0.6、磷酸二氫鉀1.4－2.2、磷酸氫二鉀0.2－0.5、半胱胺酸0.006－0.01、果糖0.9－1.2、肌醇0.04－0.08、棉子糖0.5－0.8、青霉素鈉8－12、硫酸鏈霉素0.07－0.15、氯化鈣0.01－0.02、三羧甲基氨基甲烷0.1－0.3。組分II雙蒸水100。組分III硫酸魚精蛋白0.04－0.06g。組分IV二甲基乙酰胺(DMA)4.5－5.5、乙二醇4.5－5.5ml。有益效果是使用了三羧甲基氨基甲烷和硫酸魚精蛋白等成分，并進(jìn)行了準(zhǔn)確量化。首次對鵝精液冷凍稀釋液各組成成分按試劑盒的包裝形式進(jìn)行配制。使用方便，操作簡單。提高了試劑盒的使用效果。
文檔編號C12N5/06GK101037665SQ200610016649
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者徐日福, 吳偉, 高光, 崔柏勛, 孫永峰 申請人:徐日福, 吳偉