專利名稱：耐氯菌株v430的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐氯菌株V430的基因，它是腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430的16S rDNA基因。其中，腐生葡萄球菌V430已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏日期是2005年12月9日，保藏號(hào)是CCTCC NO.M205145。通過經(jīng)典表型鑒定和16S rDNA核苷酸序列分析相結(jié)合的方法，對(duì)耐氯菌株V430進(jìn)行了生理生化和16S rDNA分子水平的鑒定，由此確定它為腐生葡萄球菌。
背景技術(shù)：
自然界中，存在著一些可以在含有高濃度甚至是極端高濃度氯離子的環(huán)境中正常生長的微生物。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，這些微生物并非都可以應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水(氯離子濃度為5000-80000mg/L)的處理，只有對(duì)其經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和馴化后得到的耐氯微生物才能做到。耐氯微生物既可耐受高濃度氯離子環(huán)境，又可降解廢水中高濃度的有機(jī)物。篩選耐氯微生物的首選取樣點(diǎn)就是所要處理的廢水中，因?yàn)樵趶U水中存在著一定數(shù)量的微生物，這些微生物對(duì)廢水環(huán)境有較好的適應(yīng)能力。初篩選出來的耐氯微生物經(jīng)過馴化后，即可作為耐氯微生物菌株應(yīng)用到廢水處理實(shí)踐中。
微生物的分類方法常用的有經(jīng)典分類方法和分子生物學(xué)分類法。經(jīng)典分類方法主要指依據(jù)形態(tài)特征(Morphological characteristics)、培養(yǎng)特征(Cultural characteristics)及生理生化特征(Physiological characteristics)等分類的方法。分子生物學(xué)分類法，又稱分子分類方法，是指在分子水平上對(duì)生物個(gè)體的核酸及蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，并據(jù)此對(duì)生物個(gè)體進(jìn)行分類的方法。由于16S rDNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分類方法采用。
目前，16S rDNA序列分析的方法主要有兩種一種是16S rDNA提純后用反轉(zhuǎn)錄酶和保守引物進(jìn)行測(cè)序，另一種是擴(kuò)增16S rDNA基因?qū)?yīng)的DNA序列，然后將PCR產(chǎn)物回收后直接測(cè)序。
耐氯菌由于具有耐氯特性，其形態(tài)、胞壁、細(xì)胞內(nèi)蛋白、脂肪酸等大分子組成在有鹽存在的情況下會(huì)發(fā)生不同程度的改變，在菌株鑒定過程中，僅從形態(tài)上很難判斷它們的歸屬，而從生理特征和化學(xué)特征上鑒定又十分費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)于大量的分離菌株更是如此。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過16S rDNA序列分析方法，快速對(duì)耐氯菌株V430進(jìn)行分子水平的鑒定，確定其為腐生葡萄球菌。該菌株是新發(fā)現(xiàn)的能夠在高濃度氯離子環(huán)境下生存的耐氯菌株，它有助于降解廢水中的有機(jī)物。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
耐氯菌株V430的基因，其特征征在于為腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的16S rDNA基因，其菌株的16S rDNA全序列如下GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 1423上述16S rDNA序列全長1423個(gè)核苷酸。
采用BLAST分析法，將腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較，該菌株與腐生葡萄球菌的同源性為98.0-99.0％。
一種獲取耐氯菌株V430的基因的方法，其采用了提取細(xì)菌核DNA、16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測(cè)定和分析步驟，其特征在于(1)在提取細(xì)菌核DNA的過程中，采用了如下的緩沖液，TE緩沖液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0，STE緩沖液0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0，(2)在16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增過程中，采用了如下的擴(kuò)增條件和擴(kuò)增的引物PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min，PCR擴(kuò)增的引物是P1正向引物為5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物為5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’，(3)PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水，(4)16S rDNA的全序列測(cè)定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，其條件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM測(cè)序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)；然后，在AppliedBiosystem 373ADNA測(cè)序儀上測(cè)序；然后采用BLAST軟件，將測(cè)得的16S rDNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終確定其為腐生葡萄球菌株的基因全序列，在PCR測(cè)序時(shí)，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
提供腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的16S rDNA基因。本發(fā)明基因序列，通過提取細(xì)菌核DNA，16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測(cè)定和分析而獲得。本發(fā)明具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列2-1a是菌株V430菌株電鏡圖片圖2-1b是菌株V430菌株電鏡圖片圖2-1c是菌株V430菌株電鏡圖片圖2-2是菌株V430在液體不同氯離子濃度的SC培養(yǎng)基上生長情況2-3是菌株V430 PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳圖(1核DNA，2擴(kuò)增產(chǎn)物，MMarker)圖2-4a是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率2-4b是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率2-4c是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率2-4d是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率圖具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明提供的腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的基因，其16S rDNA全序列如圖1所示。
采用BLAST分析法，將腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較，該菌株與腐生葡萄球菌的同源性為98.0-99.0％，由此可以從分子水平確定本菌株是腐生葡萄球菌。同時(shí)，結(jié)合經(jīng)典分類方法所獲得的形態(tài)及生理生化特征，最終確定本菌株是腐生葡萄球菌。
本發(fā)明采用提取細(xì)菌核DNA、16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測(cè)定和分析步驟，來獲取CCTCC NO.M205145菌株的16S rDNA基因全序列。
上述步驟具體如下(1)細(xì)菌核DNA的提取1)用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液管內(nèi)培養(yǎng)過夜，取1.5ml菌液于Eppendorf管內(nèi)，8,000rpm室溫離心5min，徹底除去上清。
2)加STE溶液1.5ml洗滌一次，離心棄上清，再加入0.6mlTE溶液，重懸細(xì)菌。
3)加30ul10mg/ml的溶菌酶，37℃水浴45min4)加65μl10％的SDS，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃水浴2小時(shí)，至溶液變清。
5)加入等積體酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白層為止。
6)在上清液中加入1/10體積的3M的NaAc(pH5.2)。
7)加入等體積的異丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒纏繞挑出DNA細(xì)絲，在用70％的乙醇洗滌一次，自然涼干，并將DNA溶于100μl TE溶液中。
8)加入終濃度為50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增在50μL反應(yīng)體積中加入1μL模板DNA，0.1μg；0.5μLP1和P2，終濃度為0.5μM；1μLdNTP，每種NTP0.2mM；0.5μLTaq聚合酶，2U；5μL 10×PCR緩沖液。
PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min。
PCR擴(kuò)增的引物是P1正向引物為5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物為5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。
(3)PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。
(4)16S rDNA的全序列測(cè)定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，其條件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM測(cè)序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)；然后，在AppliedBiosystem 373ADNA測(cè)序儀上測(cè)序；然后采用BLAST軟件，將測(cè)得的16S rDNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終確定其為腐生葡萄球菌株的基因全序列。
在PCR測(cè)序時(shí)，使用如下的正反向引物
P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
本發(fā)明采用對(duì)16S rDNA序列測(cè)定和分析的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))，如圖2-3所示。
耐氯菌株V430的篩選方法及應(yīng)用如下一、一株耐氯菌株V430的篩選方法(一)、材料準(zhǔn)備1、菌源和實(shí)驗(yàn)廢水(1)菌源處理皂素廢水的生化系統(tǒng)中的活性污泥；(2)實(shí)驗(yàn)廢水(即混合皂素廢水)本實(shí)驗(yàn)廢水取自湖北省十堰市方坤置業(yè)有限公司皂素生產(chǎn)廢水；經(jīng)內(nèi)電解和CaO調(diào)配后，具體指標(biāo)為pH＝7.5-8.2，COD＝4000-17000mg/L，Cl-＝8000-30000mg/L，NH4-N 140-300mg/L。
2、培養(yǎng)基分離(完全)培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml。
篩選培養(yǎng)基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水(COD濃度為1000mg/L)，pH＝7.5；微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
擴(kuò)大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
SC培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl2加入量為12.6g-140g；當(dāng)CaCl2加入量為12.6g時(shí)，SC培養(yǎng)基內(nèi)[Cl-]＝10000mg/L。
斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
以上培養(yǎng)基分別于121℃高壓滅菌30min后備用。
3、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備國華SHA-B恒溫振蕩器，SHH150G光照生物培養(yǎng)箱，臥式壓力蒸汽滅菌器，WMX-1型微波密封消解COD速測(cè)儀，722S分光光度計(jì)，光學(xué)顯微鏡，pH計(jì)，超凈工作臺(tái)，鼓風(fēng)干燥箱，超薄切片機(jī)，日立H-7000FA投射顯微鏡，PTC200型PCR儀，電泳儀及電泳槽，凝膠紫外觀測(cè)儀等。
(二)、菌株的分離與篩選1、菌膠團(tuán)的破碎取2g皂素廢水處理系統(tǒng)中的厭氧活性污泥，加入事先滅菌好的裝有100ml無菌水的250ml的三角瓶內(nèi)，并加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團(tuán)打碎，得泥水混合物，備用。
2、耐氯離子優(yōu)勢(shì)菌種的分離利用無菌移液管吸取0.5ml上述泥水混合物，加入分離培養(yǎng)基4.5ml，35℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，待試管培養(yǎng)基變混濁，說明細(xì)菌已經(jīng)生長，然后平板稀釋涂布，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，并于斜面培養(yǎng)基上斜面保存。
3、耐氯離子優(yōu)勢(shì)菌種的篩選挑取上述分離出的單菌落，分別接種于篩選培養(yǎng)基內(nèi)，35℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐高氯離子的菌株。經(jīng)過篩選，最后得到一株編號(hào)為菌株V430的菌株，即耐氯菌株V430。耐氯菌株V430在加入不同濃度氯離子的液體SC培養(yǎng)基上生長情況如圖2-2所示(同時(shí)輔以[Cl-]＝3000mg/L時(shí)的OD600nm為對(duì)照值)。
二、耐氯菌株V430的菌落形態(tài)、生理和生化特征見表1。細(xì)胞形態(tài)見圖2-1a、圖2-1b、圖2-1c。
表1菌株V430的菌落形態(tài)特征以及主要的生理特征


表中符號(hào)說明“+”90％以上的菌株為陽性，“-”90％以上的菌株為陰性。
三、菌株V430為新的菌株將菌株V430的16S rDNA基因序列與國際GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行網(wǎng)上同源性比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌V430與腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)多個(gè)菌株的同源性高達(dá)98-99％以上。綜合菌株V430的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，可確定細(xì)菌V430為腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，菌株V430命名為腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430(即耐氯菌株V430)，查閱有關(guān)資料，尚無腐生葡萄球菌屬有關(guān)高濃度氯離子條件下難降解有機(jī)廢水以及對(duì)其耐氯能力研究的報(bào)道。腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430為新的菌株，已于2005年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號(hào)CCTCC NO.M205145。
本發(fā)明分離、篩選出的菌株V430，具有較好降解高濃度氯離子難降解皂素廢水的功能。這就拓寬了人們對(duì)腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含高濃度氯離子皂素廢水提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
四、耐氯菌株V430的應(yīng)用挑取腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430單菌落，于擴(kuò)大培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，取皂素混合廢水([Cl-]＝8000-20000/L，COD＝8000-10000mg/L)50ml分別加入250ml的錐形瓶中，分別加入菌株的菌懸液1ml，35℃、pH值＝7.5，厭氧反應(yīng)5天，計(jì)算菌株對(duì)廢水的COD的去除情況，降解因素實(shí)驗(yàn)除了所考察的因素外，其余均同以上條件。菌株V430去除COD的效率好，為50-60％；結(jié)果見圖2-4a、圖2-4b、圖2-4c、圖2-4d。
所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L，pH＝7.5。
1)為了考察菌株在不同氯離子濃度下，對(duì)COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為9864.2、14980、21061、24780、30080mg/L。耐氯菌株V430去除效果結(jié)果如圖1-4a。
從圖2-4a可以看出，當(dāng)[Cl-]＝9864.2mg/L時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為3d，菌株V430對(duì)COD的去除率僅為39.31％，但是隨著廢水中氯離子濃度的升高，菌株V430對(duì)COD的去除率增加，當(dāng)廢水中氯離子濃度達(dá)到2.5萬mg/L時(shí)，菌株V430對(duì)COD的去除率可達(dá)64.38％，并且菌株V430對(duì)COD的去除率隨著廢水中氯離子濃度的繼續(xù)增加而變化不大，當(dāng)廢水中氯離子濃度高達(dá)3萬mg/L時(shí)，菌株V430對(duì)COD的去除率仍保持在60％。
2)為了考察菌株在不同COD濃度下(6610.4、7906.4、11209.6、13420.0、16196.2mg/L)，對(duì)COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為20000mg/L。耐氯菌株V430去除效果結(jié)果如圖2-4b。通過實(shí)驗(yàn)可知當(dāng)廢水中[Cl-]＝20000mg/L、COD濃度達(dá)到1萬mg/L時(shí)，菌株V430對(duì)COD的去除率較好，可達(dá)62.37％。
3)從圖2-4c和2-4d可以看出，菌株V430對(duì)COD的去除率隨pH的增加先增加后下降，其最高去除率在pH為7.5-8時(shí)，達(dá)到62％。離心處理后的廢水，發(fā)現(xiàn)pH為7-8時(shí)，濕菌體量明顯高于pH為9、10、11時(shí)，可見在pH在中性時(shí)，有利于菌株的生長；當(dāng)接種量在1-4ml之間變化時(shí)，菌株V430對(duì)COD的去除率無明顯變化，基本為60％，當(dāng)接種量為1ml時(shí)，其去除率最好。這是因?yàn)榫甑纳L需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)菌懸液為1ml時(shí)，其需要的物質(zhì)容易得到滿足。
<110>中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)<120>耐氯菌株V430的基因<160>1423<210>1<211>1423bp<212>DNA<213>腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320
TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 142權(quán)利要求
1.耐氯菌株V430的基因，其特征征在于為腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的16S r DNA基因，其菌株的16S r DNA全序列如下GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 1423上述16S r DNA序列全長1423個(gè)核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐氯菌株V430的基因，其特征在于采用BLAST分析法，將腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S r DNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較，該菌株與腐生葡萄球菌的同源性為98.0-99.0％。
3.一種獲取權(quán)利要求1或2所述耐氯菌株V430的基因的方法，其采用了提取細(xì)菌核DNA、16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測(cè)定和分析步驟，其特征在于(1)在提取細(xì)菌核DNA的過程中，采用了如下的緩沖液，TE緩沖液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0，STE緩沖液0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0，(2)在16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增過程中，采用了如下的擴(kuò)增條件和擴(kuò)增的引物PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min，PCR擴(kuò)增的引物是P1正向引物為5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物為5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’，(3)PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水，(4)16S rDNA的全序列測(cè)定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，其條件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM測(cè)序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)；然后，在AppliedBiosystem 373 A DNA測(cè)序儀上測(cè)序；然后采用BLAST軟件，將測(cè)得的16S rDNA全序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終確定其為腐生葡萄球菌株的基因全序列，在PCR測(cè)序時(shí)，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACA ATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
全文摘要
本發(fā)明涉及耐氯菌株V430的基因，它是腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430的16S rDNA基因，本發(fā)明基因序列，通過提取細(xì)菌核DNA，16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，以及16S rDNA的全序列測(cè)定和分析而獲得。本發(fā)明具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1900283SQ20061001813
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月10日
發(fā)明者信欣, 王焰新, 鮑建國, 劉慧 , 李平, 楊雪芬 申請(qǐng)人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)