專利名稱：：一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，具體是利用萊茵衣藻構(gòu)建轉(zhuǎn)基因藻類生物反應(yīng)器，可實(shí)現(xiàn)快速、廉價(jià)生產(chǎn)各種藥用蛋白質(zhì)、可食性疫苗、具有生物學(xué)活性的次生代謝產(chǎn)物、工業(yè)原料等。
背景技術(shù)：
：DNA重組技術(shù)是二十世紀(jì)七十年代在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)展起來的。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展完善，外源基因的高效表達(dá)已經(jīng)成為基因工程制藥、基因診斷與治療、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和工業(yè)原材料生產(chǎn)的重要生物技術(shù)手段。研究開發(fā)出適應(yīng)不同技術(shù)需求的各種外源基因高效表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物技術(shù)的熱點(diǎn)問題。目前比較成熟的幾個(gè)外源基因表達(dá)系統(tǒng)雖然都有其各自的優(yōu)勢(shì)，但仍然存在各種不足大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然表達(dá)量大，但產(chǎn)物大多以包涵體形式存在，且不能進(jìn)行糖基化修飾；酵母表達(dá)系統(tǒng)解決了真核基因的產(chǎn)物糖基化問題，但也存在甲醛誘導(dǎo)物的毒性、產(chǎn)物乙醇累積及發(fā)酵底物的高成本等問題；高等植物表達(dá)系統(tǒng)能利用植物光合作用產(chǎn)物作為生產(chǎn)外源蛋白的底物，但其生產(chǎn)周期長(zhǎng)，占地空間大。于是人們想到利用藻類作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)外源蛋白。因?yàn)樵孱惣饶芟蟾叩戎参镆粯舆M(jìn)行光合作用，解決發(fā)酵底物問題，又能象細(xì)菌一樣進(jìn)行集約化生產(chǎn)。目前比較成熟的藻類外源基因表達(dá)系統(tǒng)是藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)，但藍(lán)藻屬于原核生物，同細(xì)菌一樣不能進(jìn)行真核基因表達(dá)產(chǎn)物的糖基化修飾，同時(shí)藍(lán)藻細(xì)胞壁較厚使表達(dá)產(chǎn)物難于分離，胞外多糖豐富，純培養(yǎng)較困難等。人們開始利用單細(xì)胞真核藻類來作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)，例如中國專利“轉(zhuǎn)基因小球藻的高效生物反應(yīng)器”(專利號(hào)ZL97112189.3)，以及中國專利“轉(zhuǎn)基因鹽藻生物反應(yīng)器”(專利號(hào)ZL00131217.0)。這些真核藻類表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了真核基因表達(dá)產(chǎn)物的糖基化修飾，但仍存在以下需改進(jìn)之處(1)表達(dá)系統(tǒng)不穩(wěn)定，表達(dá)水平達(dá)不到商業(yè)化應(yīng)用的需求；(2)藻類遺傳背景不夠清楚，達(dá)不到外源基因定點(diǎn)整合的要求；(3)藻類細(xì)胞內(nèi)無足夠表達(dá)產(chǎn)物儲(chǔ)藏場(chǎng)所，高表達(dá)會(huì)嚴(yán)重影響藻類生長(zhǎng)。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)屬于綠藻門團(tuán)藻目衣藻科，是一種單細(xì)胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(dòng)(如光合作用、鞭毛組裝、趨光性和生理節(jié)律等)的模式生物，與酵母細(xì)胞有許多共同的特征，素有“光合酵母”之稱。萊茵衣藻的細(xì)胞呈卵形，有細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；細(xì)胞質(zhì)里有一個(gè)大型杯狀葉綠體，占整個(gè)細(xì)胞體積的40-60％。細(xì)胞前部偏在一側(cè)的地方有一個(gè)紅色的眼點(diǎn)，眼點(diǎn)對(duì)光線的強(qiáng)弱很敏感。萊茵衣藻細(xì)胞的前端有兩根鞭毛，能夠擺動(dòng)，因此可以在水中自由游動(dòng)。萊茵衣藻的全身都能夠吸收溶解在水中的二氧化碳和無機(jī)鹽，并且能夠依靠眼點(diǎn)的感光和鞭毛的擺動(dòng)，游到光照和其他條件都適宜的地方，進(jìn)行光合作用，維持自己的生活。它具有無性生殖、有性生殖兩種方式，有光能自養(yǎng)、異養(yǎng)及光能異養(yǎng)3種不同的營養(yǎng)生長(zhǎng)方式，其生長(zhǎng)速度快且光合效率高。在20世紀(jì)80年代中后期，關(guān)于衣藻同源基因的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和調(diào)控有大量報(bào)道，但外源基因表達(dá)沒有成功。直到90年代初期才出現(xiàn)關(guān)于萊茵衣藻外源基因遺傳轉(zhuǎn)化與表達(dá)的報(bào)道(Halletal，ExpressionofaforeigngeneinChlamydomonasreinhardtii，Gene，124(1993)75-81)，多為利用報(bào)告基因和篩選基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，表達(dá)量很低且不穩(wěn)定。在90年代中后期出現(xiàn)了外源篩選基因在衣藻中的穩(wěn)定表達(dá)(Stevensetal，ThebacterialphleomycinresistancegenebleasadominantselectablemarkerinChlamydomonas.MolGenGenet251(1996)23-30)，這為外源基因在萊茵衣藻中的表達(dá)提供了基礎(chǔ)。國內(nèi)也出現(xiàn)了利用萊茵衣藻表達(dá)外源基因的報(bào)道(zhangetal，NS3-CChimericAntigenGeneofHepatitisCViruswasIntroducedSite-specificallyintoChloroplastGenomeofChlamydomonasreinhardtii，Hereditas，1999，21(6)1-6；wangetal，ExpressionandmolecularanalysisofphbBgeneinChlamydomonasreinhardtii，ChineseScienceBulletin，2004，49(16)1713-1717)，但表達(dá)水平有待提高，沒有建立完整的外源基因高效表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明建立了一套利用轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻進(jìn)行目的產(chǎn)物生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器技術(shù)體系。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，包括轉(zhuǎn)基因受體萊茵衣藻品系、含有篩選標(biāo)記表達(dá)框架的外源基因高效表達(dá)載體構(gòu)建、外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因藻的篩選與鑒定和外源基因表達(dá)調(diào)控方法。通過該方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻高效生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)快速、廉價(jià)生產(chǎn)各種藥用蛋白質(zhì)、工業(yè)原料、可食性疫苗、具有生物學(xué)活性的次生代謝產(chǎn)物等。本發(fā)明方法包括以下幾個(gè)方面的內(nèi)容1.轉(zhuǎn)基因受體藻的篩選與培養(yǎng)選擇轉(zhuǎn)基因受體藻可選用細(xì)胞壁缺陷的萊茵衣藻CC-849作為受體藻，但本發(fā)明不限于該品系。采用Tris-acetate-phosphate(TAP)培養(yǎng)基，在通氣和光照～90μE/m2.s的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因藻培養(yǎng)依生產(chǎn)規(guī)模采用不同規(guī)模的光合生物培養(yǎng)系統(tǒng)，大規(guī)模生產(chǎn)可采用跑道式藻類培養(yǎng)系統(tǒng)。2.外源基因萊茵衣藻表達(dá)載體的構(gòu)建外源基因高效表達(dá)載體包括萊茵衣藻強(qiáng)啟動(dòng)子(RBCS2啟動(dòng)子，atpA啟動(dòng)子，HSP70A-RBCS2合成啟動(dòng)子等)、目的基因(MT-like等)、終止子(RBCS2終止子，rbcL3′終止子等)、特定的篩選標(biāo)記基因(ble，aadA等)。(1)外源基因萊茵衣藻細(xì)胞核表達(dá)載體的構(gòu)建首先將載體pSP105上克隆有RBCS2的5′啟動(dòng)子序列和它的3′終止子序列，中間攜帶有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，利用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)插入外源基因構(gòu)成RBCS2的5′啟動(dòng)子、目的基因和RBCS2終止子的表達(dá)盒，通過EcoRV酶切位點(diǎn)將該表達(dá)盒插入pSP124載體上(pSP124上含有RBCS2啟動(dòng)子-ble-RBCS2終止子組成的ble基因的表達(dá)盒，編碼13.5KD的腐草霉素結(jié)合蛋白)，構(gòu)建含RBCS啟動(dòng)子的外源基因萊茵衣藻細(xì)胞核表達(dá)載體。載體pCB740上有Hsp70A-RBCS2合成啟動(dòng)子，以pCB740質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)上下引物上游引物PrHp1(5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT3′)HindIII下游引物PrHp2(5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′)PmaCI通過PCR從質(zhì)粒pCB740上擴(kuò)增出含HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子片段，經(jīng)電泳分離后從凝膠中回收，采用T-A克隆策略將其克隆到的pMD18-T載體上，得到的轉(zhuǎn)化子命名為HRT，通過PmaCI和HindIII從重組質(zhì)粒HRT上分離出HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子片段，將pSP105用PmaCI和HindIII雙酶切，經(jīng)電泳分離后從凝膠中回收切除了RBCS2啟動(dòng)子/740bp的pSP105質(zhì)粒片段/pSP105-1P，通過T4DNA連接酶將HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子連接到pSP105-1P，得到新的萊茵衣藻表達(dá)載體pH105，利用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)插入外源基因構(gòu)成含HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子、目的基因和RBCS2終止子的表達(dá)盒，通過EcoRV酶切位點(diǎn)將該表達(dá)盒插入pSP124載體上，構(gòu)建含HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子的外源基因萊茵衣藻細(xì)胞核表達(dá)載體。(2)外源目的基因萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建首先是利用同源重組片段衣藻葉綠體的psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列將外源基因定點(diǎn)整合到受體細(xì)胞葉綠體基因組psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列之間，利用萊茵衣藻葉綠體rbcL基因的5′啟動(dòng)子、rbcL基因的3’終止子驅(qū)動(dòng)外源基因在萊茵衣藻的表達(dá)，篩選標(biāo)記為aadA基因(賦予藻細(xì)胞鏈霉素、壯觀霉素抗性)。質(zhì)粒p53rGFPct上攜帶有衣藻葉綠體的rbcL5′啟動(dòng)子和rbcL3′終止子序列，通過NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，并插入外源目的基因，rbcL5′啟動(dòng)子和rbcL3′終止子序列可以在衣藻葉綠體中表達(dá)插入的外源基因，構(gòu)成rbcL啟動(dòng)子-目的基因-rbcL終止子的外源基因表達(dá)盒。載體p322上攜帶有衣藻葉綠體psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列，外源基因表達(dá)盒插入葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA之間的位置構(gòu)成p322-1；p423質(zhì)粒上攜帶有篩選標(biāo)記aadA基因的表達(dá)盒(atpA5′啟動(dòng)子-aadA-rbcL3′終止子)，通過EcoRI和Sacl雙酶切p423，獲得1.9kb的aadA基因表達(dá)盒，連入p322-1的EcoRI和Sacl位點(diǎn)，得到外源基因萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體。3.本發(fā)明所述的將外源目的基因?qū)肴R茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化方法包括(1)珠磨法萊茵衣藻CC-849在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106cells/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用TAP培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108cells/mL；吸取300μL懸浮液到5mL的兩個(gè)試管里(內(nèi)含已滅菌的石英砂)，將目的DNA酶切成線狀，取1μg-2μg加入試管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振蕩15秒后；把混合液轉(zhuǎn)移到25mL的帶螺旋帽的離心管中，加入10mL滅菌TAP培養(yǎng)液，在22℃溫度下60rpm振蕩搖床過夜培養(yǎng)(光照條件為90μE/m2/s)；室溫(20-25℃)離心收集細(xì)胞，去上清，用0.5mLTAP重懸，加入3.5mL0.5％TAP培養(yǎng)基，混勻后倒在TAP平板上(含10μg/mL的Zeomycin)，22℃光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)7-15天，平板上長(zhǎng)出綠色的單克隆藻落。(2)基因槍法萊茵衣藻在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106細(xì)胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用TAP液體培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108細(xì)胞/mL。吸取300μL懸浮液涂布于TAP固體平板培養(yǎng)基，22℃光照培養(yǎng)箱(光照條件為90μE/m2/s)中培養(yǎng)1-2天以形成細(xì)胞層。在無菌條件下用基因槍(Bio-Rad)轟擊。具體步驟如下取50μL金粉懸浮液(60μg/mL)，加入2μg含有外源基因的環(huán)狀質(zhì)粒和50μL2MCaCl2和20μL0.1M亞精胺，通過渦輪振蕩器振蕩1-3分鐘以混合，8,000rpm離心10秒，棄上清，用無水乙醇清洗，振蕩，再8,000rpm離心10秒，棄上清，共5次，最后用60μL無水乙醇重懸沉淀。每次轟擊取10μL，轟擊參數(shù)如下真空度25inches·Hg，轟擊距離9cm，每皿轟擊3次，22℃光照培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到篩選平板上繼續(xù)培養(yǎng)(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長(zhǎng)出。(3)電激穿孔法萊茵衣藻CC-849在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106細(xì)胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用電激緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108細(xì)胞/mL。加入終濃度為4μg/mL的含外源基因的質(zhì)粒及25μg/mL的鮭精DNA，混勻后置冰上，吸取0.4mL于電轉(zhuǎn)杯中待用。電轉(zhuǎn)儀(Eppendorf)電激時(shí)電壓為1KV/cm，持續(xù)時(shí)間2秒，然后冰上放置10分鐘，補(bǔ)充10mLTAP液體培養(yǎng)基22℃光照培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)12-18小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到篩選平板上繼續(xù)培養(yǎng)(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長(zhǎng)出。4.本發(fā)明所述的外源目的基因?qū)肴R茵衣藻的整合位置為細(xì)胞核基因組或者葉綠體基因組。通過構(gòu)建整合到細(xì)胞核基因組的表達(dá)載體或整合到葉綠體基因組的表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)整合位點(diǎn)的控制。5.本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因藻篩選與鑒定包括(1)用含有篩選抗生素平板的篩選單克隆藻落，通過連續(xù)繼代培養(yǎng)15-20代后，進(jìn)行進(jìn)一步的分子檢測(cè)。(2)分子鑒定包括PCR-Southernblot檢測(cè)、RT-PCR-Southernblot檢測(cè)和Westernblot檢測(cè)。6.本發(fā)明所述的目的基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)包括強(qiáng)啟動(dòng)子的篩選、外源基因改造等。7.利用本發(fā)明所述的方法，建立了構(gòu)建一種生產(chǎn)類金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)MT-like基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的方法。本發(fā)明方法構(gòu)件的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器，相比于現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)基因組序列已測(cè)序完成(見ChlamydomonasCenter，www.chlamy.org)，遺傳背景清楚，便于外源基因的定點(diǎn)整合；(2)細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)大型杯狀葉綠體，占整個(gè)細(xì)胞體積的40-60％，同質(zhì)化容易；(3)具有無性生殖、有性生殖兩種方式，克服了植物組織培養(yǎng)困難，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量轉(zhuǎn)基因后代；(4)有光能自養(yǎng)、異養(yǎng)及光能異養(yǎng)3種不同的營養(yǎng)生長(zhǎng)方式；(5)易于同步化培養(yǎng)；(6)生物安全性高，轉(zhuǎn)化的外源基因不會(huì)象高等植物那樣通過花粉傳播給后代，避免了外源基因的環(huán)境擴(kuò)散；(7)其生長(zhǎng)速度快且光合效率高。與細(xì)菌、酵母等需要發(fā)酵底物的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器相比較，本發(fā)明構(gòu)建的一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器能利用光能將環(huán)境中的二氧化碳和水合成目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)的底物，大大降低了生產(chǎn)成本。與高等植物轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器相比較，本發(fā)明構(gòu)建的一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器生長(zhǎng)速率快，能象細(xì)菌那樣進(jìn)行集約化大規(guī)模培養(yǎng)，克服了高等植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、占地面積大的問題。與螺旋藻等原核轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器相比較，本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器是單細(xì)胞真核藻類，能表達(dá)來自高等動(dòng)物和植物的真核基因，克服了轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻表達(dá)真核基因時(shí)的糖基化修飾問題。與小球藻轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器相比較，本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的細(xì)胞較大，采用細(xì)胞壁缺陷的受體品系，遺傳轉(zhuǎn)化操作方便，且細(xì)胞壁易破，表達(dá)產(chǎn)物易于分離。與轉(zhuǎn)基因鹽藻生物反應(yīng)器相比較，本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器細(xì)胞生長(zhǎng)快，培養(yǎng)方便，不必在高鹽的極端環(huán)境中生長(zhǎng)。正因?yàn)榫哂幸陨系膬?yōu)點(diǎn)，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器是目前很好的真核生物轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)系統(tǒng)，具有非常廣闊的應(yīng)用前景，例如可用于名貴醫(yī)藥、可食性疫苗、保健食品等的生產(chǎn)。圖1是pSP105結(jié)構(gòu)示意圖，該載體包含包含5′RBCS2啟動(dòng)子(780bp)和3′RBCS2終止子，中間有PmaCI、SalI、BamHI和XbaI等位點(diǎn)。圖2是pH105載體的構(gòu)建過程，以來自pCB740質(zhì)粒的Hsp70A-RBCS2合成啟動(dòng)子取代pSP105上的5′RBCS2啟動(dòng)子，得到pH105載體。圖3是MT-like基因衣藻葉綠體表達(dá)載體p322A-MT構(gòu)建圖，含有aadA表達(dá)盒(atpA5′啟動(dòng)子-aadA-rbcL3′終止子)和MT-like基因表達(dá)盒rbcL5′啟動(dòng)子-(MT-like基因)-rbcL3′終止子，同源重組片段衣藻葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列。圖4是MT-like基因衣藻核表達(dá)載體pSP105MT-124構(gòu)建圖，含有ble基因表達(dá)盒(RBCS2啟動(dòng)子-ble-RBCS2終止子)和MT-like基因表達(dá)盒RBCS2啟動(dòng)子-(MT-like基因)-RBCS2終止子。圖5是MT-like-M基因衣藻核表達(dá)載體pH105MT-124構(gòu)建圖，含有ble基因表達(dá)盒(RBCS2啟動(dòng)子-ble-RBCS2終止子)和MT-like基因表達(dá)盒RBCS2啟動(dòng)子-(MT-like-M基因)-RBCS2終止子。圖6是MT-like基因衣藻葉綠體表達(dá)載體p322A-MT-M構(gòu)建圖，含有aadA表達(dá)盒atpA5′啟動(dòng)子-aadA-rbcL3′終止子和MT-like-M基因表達(dá)盒rbcL5′啟動(dòng)子-(MT-like-M基因)-rbcL3′終止子，同源重組片段衣藻葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1萊茵衣藻品系的選擇與培養(yǎng)本實(shí)施例選用萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtiicc-849(購自美國Duke大學(xué)衣藻遺傳中心，DukeUniversity，Durham，NC27708USA)作為轉(zhuǎn)基因操作的受體，該藻株為細(xì)胞壁缺陷型的萊茵衣藻品系，但本專利涉及所有用于轉(zhuǎn)基因操作的其它萊茵衣藻品系。萊茵衣藻培養(yǎng)時(shí)使用的培養(yǎng)基為TAP培養(yǎng)基，1L培養(yǎng)基的組份如下Tris2.42g，4倍Beijerincksalts(每升含16gNH4Cl，2gCaCl2·2H2O，4gMgSO4·7H2O)25mL，1M(K)PO4(pH7.0)緩沖液1mL，微量元素混合液(每升含11.4gH3BO3，22gZnSO4·7H2O，5.06gMnCl2·4H2O，4.99gFeSO4·7H2O，1.61gCoCl2·6H2O1.57gCuSO4·5H2O1.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O，50gNa2EDTA)1mL，冰醋酸1mL，H2O975mL，pH7.0。萊茵衣藻培養(yǎng)條件如下溫度22-25℃，光照90μE/m2/s的條件下連續(xù)光照培養(yǎng)，通氣量可調(diào)整(0.5L/min左右)，藻細(xì)胞濃度達(dá)到1×108-109細(xì)胞/mL時(shí)離心收集。實(shí)施例2外源目的基因萊茵衣藻高效表達(dá)載體的構(gòu)建1.外源目的基因萊茵衣藻核表達(dá)載體的構(gòu)建載體pSP105(Stevens，D.R.，等ThebacterialphleomycinresistancegenebleasadominantselectablemarkerinChlamydomonas.1996，Mol.Gen.Genet.251，23-30.)上克隆有RBCS2的5′啟動(dòng)子序列和它的3′終止子序列，中間攜帶有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI等限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，可以插入外源基因并在衣藻核基因組中表達(dá)外源基因(見圖1)。載體pCB740(SchrodaM.，等SequenceelementswithinanHSP70promotercounteracttranscriptionaltransgenesilencinginChlamydomona.PlantJ，2002，31(4)445-455)上克隆有Hsp70A-RBCS2合成啟動(dòng)子。載體pSP124(VictoriaLumbreras，等EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.PlantJ，1998，14(4)441-447)上含有ble基因的表達(dá)盒(RBCS2啟動(dòng)子-ble-RBCS2終止子)，編碼13.5KD的腐草霉素結(jié)合蛋白，它產(chǎn)生的抗體使衣藻具有腐草霉素和Zeomycin抗性，作為衣藻轉(zhuǎn)化時(shí)的篩選標(biāo)記。以pCB740質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)兩條引物上游引物PrHp1(5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT3′)HindIII下游引物PrHp2(5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′)PmaCI通過PCR(程序是94℃變性3min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min)從質(zhì)粒pCB740上擴(kuò)增出含HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子片段(約498bp)，經(jīng)電泳分離后從凝膠中回收，采用T-A克隆策略將其克隆到的pMD18-T載體(大連寶生物工程有限公司，遼寧省大連經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)東北二街19號(hào))上，得到的轉(zhuǎn)化子命名為HRT，通過PmaCI和HindIII(大連寶生物工程有限公司)從重組質(zhì)粒HRT上分離出HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子片段(約498bp)。將pSP105用PmaCI和HindIII雙酶切，經(jīng)電泳分離后從凝膠中回收切除了RBCS2啟動(dòng)子(740bp)的pSP105質(zhì)粒片段(pSP105-1P)，通過T4DNA連接酶(大連寶生物工程有限公司)將HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子連接到pSP105-1P，得到新的萊茵衣藻表達(dá)載體，命名為pH105(見圖2)。2.外源目的基因萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例選擇來自紫羊茅植物(Festucarubracv.Merlin)的類金屬硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體為例。利用同源重組片段衣藻葉綠體的psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列將外源基因定點(diǎn)整合到受體細(xì)胞葉綠體基因組psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列之間。利用萊茵衣藻葉綠體rbcL基因的5′啟動(dòng)子、rbcL基因的3’終止子驅(qū)動(dòng)外源基因在萊茵衣藻的表達(dá)。篩選標(biāo)記為aadA基因，賦予藻細(xì)胞鏈霉素、壯觀霉素抗性。質(zhì)粒p53rGFPct(Franklin，S.E.，等DevelopmentofaGFPreportergeneforChlamydomonasreinhardtiichloroplast.PlantJ2002，30733-744)上攜帶有衣藻葉綠體的rbcL5′啟動(dòng)子和rbcL3′終止子序列，通過NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，并插入外源目的基因，rbcL5′啟動(dòng)子和rbcL3′終止子序列可以在衣藻葉綠體中表達(dá)插入的外源基因。載體p322(購自美國Duke大學(xué)衣藻遺傳中心，DukeUniversity，Durham，NC27708USA)上攜帶有衣藻葉綠體psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列，方便外源基因表達(dá)盒插入葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA之間的位置；p423(購自美國Duke大學(xué)衣藻遺傳中心，DukeUniversity，Durham，NC27708USA)質(zhì)粒上攜帶有aadA基因的表達(dá)盒(atpA5′啟動(dòng)子-aadA-rbcL3′終止子)，aadA基因可使藻細(xì)胞具有壯觀霉素和鏈霉素抗性，成為萊茵衣藻葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。根據(jù)來自紫羊茅植物的類金屬硫蛋白基因序列(MiMa，Wing-KeungTsang，Pui-SangLauandYuk-ShanWong.1997.CloningandSequencingoftheMetallothionein-likecDNA(AccessionNo.U96646)FromFestucarubracv.Merlin(PGR97-098).PlantPhysiol.1141136)，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司(上海市漕寶路500號(hào))人工合成帶有NdeI和XbaI酶切位點(diǎn)的類金屬硫蛋白基因片段，具體序列如下1cgccatatgcagatgtcttgcagctgcggatcaagctgtggctgcggctcaaactgcaagNdeI61tgcgggaagatgtaccctgacctggacgagcaggccagcaccaccacccaggccgtggtc121gtcgtcggcgtggctcatgagaacaaggctggacagtttgagatggcctccggcgagggc181tgcaaatgcggcgccaactgcaagtgtgacccctgcaactgctaacgtgtctagactXbaI通過EcoRI和SacI雙酶切p423，獲得1.9kb的aadA基因表達(dá)盒(atpA5′啟動(dòng)子-aadA-rbcL3′終止子)，連入p322的EcoRI和SacI位點(diǎn)，得到p322A。將MT-like基因插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位點(diǎn)，得到MT-like基因表達(dá)盒(rbcL5′啟動(dòng)子-MT-like基因-rbcL3′終止子)，獲得p53MT質(zhì)粒。通過BamHI從p53MT質(zhì)粒切下MT-llike基因表達(dá)盒，插入p322A的BamHI位點(diǎn)，得到類金屬硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體p322A-MT(見圖3)。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建(整合到萊茵衣藻核基因組)本實(shí)施例選擇來自紫羊茅植物(Festucarubracv.Merlin)的類金屬硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因來構(gòu)建生產(chǎn)類金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)MT-like基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器。MT-like基因衣藻核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)來自紫羊茅植物的類金屬硫蛋白基因序列(MiMa，Wing-KeungTsang，Pui-SangLauandYuk-ShanWong.1997.CloningandSequencingoftheMetallothionein-likecDNA(AccessionNo.U96646)FromFestucarubracv.Merlin(PGR97-098).PlantPhysiol.1141136)，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司(上海市漕寶路500號(hào))人工合成帶有PmaCI和SalI酶切位點(diǎn)的類金屬硫蛋白基因片段，具體序列如下1cgccacgtgcagatgtcttgcagctgcggatcaagctgtggctgcggctcaaactgcaagPmaCI61tgcgggaagatgtaccctgacctggacgagcaggccagcaccaccacccaggccgtggtc121gtcgtcggcgtggctcatgagaacaaggctggacagtttgagatggcctccggcgagggc181tgcaaatgcggcgccaactgcaagtgtgacccctgcaactgctaacgtggtcgacctSalI將該基因片段用PmaCI和SalI雙酶切后，連接到pSP105和pH105的多克隆位點(diǎn)，分別獲得中間載體pSP105MT和pH105MT，用EcoRI分別酶切pSP105MT和pH105MT后，分別得到包含RBCS2啟動(dòng)子、MT-like基因、RBCS2終止子的表達(dá)框架(pSP105MT-1P)和包含HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子、MT-like基因、RBCS2終止子的表達(dá)框架(pH105MT-1P)，將pSP105MT-1P和pH105MT-1P插入到帶有選擇標(biāo)記基因ble的pSP124S載體(VictoriaLumbreras，DavidR.StevensandSaulPurton，1998.EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron)的EcoRI位點(diǎn)，構(gòu)成可以進(jìn)行萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化載體pSP105MT-124(見圖4)和pH105MT-124(見圖5)。萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化本實(shí)施例以珠磨法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻CC-849，具體步驟如下(1)萊茵衣藻CC-849在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106cells/mL，室溫離心收集，用TAP培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108cells/mL。(2)吸取300μL懸浮液到5mL的兩個(gè)試管里(內(nèi)含已滅菌的石英砂)，將目的DNA(pSP105MT-124或pH105MT-124)酶切成線狀，取1μg-2μg加入試管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振蕩15秒。(3)把混合液轉(zhuǎn)移到25mL的帶螺旋帽的離心管中，加入10mL滅菌TAP培養(yǎng)液，在22℃溫度下60rpm振蕩搖床過夜培養(yǎng)(光照條件為90μE/m2/s)。(4)室溫離心收集細(xì)胞，去上清，用0.5mLTAP重懸，加入3.5mL0.5％TAP培養(yǎng)基，混勻后倒在TAP平板上(含10μg/mL的Zeomycin)，22℃光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)7-15天，平板上長(zhǎng)出綠色的單克隆藻落。轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的篩選與鑒定上述篩選平板培養(yǎng)基中含有10μg/mL的Zeomycin，如果藻細(xì)胞能在篩選平板上長(zhǎng)出單克隆藻落，說明轉(zhuǎn)化載體上的標(biāo)記基因ble已經(jīng)整合到基因組中。要確定該藻落為轉(zhuǎn)目的基因衣藻，首先通過連續(xù)繼代培養(yǎng)15-20代后，進(jìn)行進(jìn)一步的分子檢測(cè)。具體方法如下(以轉(zhuǎn)MT-like基因萊茵衣藻為例)(1)以轉(zhuǎn)基因衣藻的總DNA為模板，按MT-like基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增出MT-like基因片段，以地高辛標(biāo)記的完整的MT-like基因?yàn)樘结?，進(jìn)行PCR-Southernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段可與探針雜交，轉(zhuǎn)基因衣藻出現(xiàn)和陽性對(duì)照一致的雜交印跡反應(yīng)，而對(duì)照組沒有印跡。這表明含MT-like基因已經(jīng)整合到萊茵衣藻的基因組中。(2)提取轉(zhuǎn)基因衣藻總RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，按MT-like基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過RT-PCR擴(kuò)增出MT-like基因片段，以地高辛標(biāo)記的完整的MT-like基因?yàn)樘结?，進(jìn)行RT-PCR-Southernblot檢測(cè)，若轉(zhuǎn)基因衣藻出現(xiàn)和陽性對(duì)照一致的雜交印跡反應(yīng)，而對(duì)照組沒有印跡，表明整合進(jìn)衣藻基因組中的MT-like基因在衣藻細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性，可在mRNA水平進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄。(3)提取轉(zhuǎn)基因藻的總蛋白，用MT-like蛋白作標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過HPLC分析比較轉(zhuǎn)基因藻；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因藻的總蛋白與目的產(chǎn)物單克隆抗體進(jìn)行Westernblot分析，在轉(zhuǎn)基因藻中檢測(cè)到MT-like蛋白，而對(duì)照樣品則不能檢測(cè)到該蛋白。說明導(dǎo)入到衣藻中的MT-like已經(jīng)表達(dá)，并翻譯出目的產(chǎn)物。通過上面的鑒定，確認(rèn)轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器已經(jīng)構(gòu)建完成，利用RBCS2啟動(dòng)子獲得轉(zhuǎn)基因藻Tr-RBCS2；利用HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子獲得轉(zhuǎn)基因藻Tr-HSP70A-RBCS2。目標(biāo)產(chǎn)物的分離技術(shù)目標(biāo)產(chǎn)物的分離方法依產(chǎn)物的特性不同可以采取不同的分離途經(jīng)。本發(fā)明專利涉及從轉(zhuǎn)基因衣藻中分離目標(biāo)產(chǎn)物的各類方法，包括有機(jī)萃取、相分配、柱層析、電泳和超濾等。本實(shí)施例采用親和層析法，具體步驟如下(以轉(zhuǎn)MT-like基因萊茵衣藻為例)轉(zhuǎn)基因藻細(xì)胞經(jīng)光誘導(dǎo)和熱激處理，離心(4000g)收集，每克萊茵衣藻加入3mLpH8.0的Tris-HCl緩沖液和2mL乙醇-氯仿溶液(1∶1)，80℃水浴變性10分鐘，破碎采用超聲波破碎法，超聲波強(qiáng)度200kw/m2，處理時(shí)間為15分鐘，離心(4000g)15分種，取上清液為初提液。將初提液上樣到用洗脫液(0.01M的NH4HCO3pH8.5)平衡過的SephadexG-50層析柱，經(jīng)洗脫液在4℃條件下洗脫，收集并脫鹽處理獲得純化的MT-ike蛋白。比較轉(zhuǎn)基因藻Tr-RBCS2和轉(zhuǎn)基因藻Tr-HSP70A-RBCS2的MT-like蛋白含量，轉(zhuǎn)基因藻Tr-HSP70A-RBCS2的表達(dá)量高出20倍。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建(整合到萊茵衣藻葉綠體DNA)外源基因改造本發(fā)明為了使外源基因在萊茵衣藻中高效表達(dá)，在不影響外源基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能特性的基礎(chǔ)上對(duì)外源基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑?，改造方法包括在基因中插入具有增?qiáng)子作用的衣藻內(nèi)含子、將外源基因密碼子換成衣藻優(yōu)先密碼子等。本實(shí)施例中，使用衣藻優(yōu)先密碼子(見http//www.chlamy.org/的衣藻密碼子表)對(duì)紫羊茅植物MT-like基因(下圖第一行)進(jìn)行改造，得到MT-like-M(下圖第二行)，結(jié)果如下1atgtcttgcagctgcggatcaagctgtggctgcggctcaaactgcaagtgcgggaagatg1atgtgcagctgcagcggctgcggcaactgcaagtgcaagatg61taccctgacctggacgagcaggccagcaccaccacccaggccgtggtcgtcgtcggcgtg61tacgacctggacgagcaggccagcaccaccacccaggccgtggtcgtcgtcggcgtg121gctcatgagaacaaggctggacagtttgagatggcctccggcgagggctgcaaatgcggc121gagaacaaggctcaggagatggcctccggcgagggctgctgcggc181gccaactgcaagtgtgacccctgcaactgctaa181gccaactgcaaggacccctgcaactgctaaMT-like基因表達(dá)載體的構(gòu)建(葉綠體基因組表達(dá)系統(tǒng))按照MT-like基因序列和經(jīng)過優(yōu)先密碼子改造后MT-like-M基因序列，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司(上海市漕寶路500號(hào))人工合成的類金屬硫蛋白基因片段，其MT-like基因和MT-like-M基因葉綠體基因組表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體構(gòu)建過程同實(shí)施例3，得到p322A-MT(見圖3)和p322A-MT-M(見圖6)。萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化(1)通過“基因槍法”對(duì)p322A-MT-M轉(zhuǎn)化萊茵衣藻萊茵衣藻CC-849在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106細(xì)胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用TAP液體培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108細(xì)胞/mL。吸取300μL懸浮液涂布于TAP固體平板培養(yǎng)基，22℃光照培養(yǎng)箱(光照條件為90μE/m2/s)中培養(yǎng)1-2天以形成細(xì)胞層。在無菌條件下用基因槍(Bio-Rad)轟擊。具體步驟如下取50μL金粉懸浮液(60μg/mL)，加入2μg含有外源基因的環(huán)狀質(zhì)粒(p322A-MT-M)和50μL2MCaCl2和20μL0.1M亞精胺，通過渦輪振蕩器振蕩1-3分鐘以混合，8,000rpm離心10秒，棄上清，用無水乙醇清洗，振蕩，再8,000rpm離心10秒，棄上清，共5次，最后用60μL無水乙醇重懸沉淀。每次轟擊取10μL，轟擊參數(shù)如下真空度25inches·Hg，轟擊距離9cm，每皿轟擊3次，22℃光照培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到篩選平板上繼續(xù)培養(yǎng)(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長(zhǎng)出。(2)通過“電激穿孔法”對(duì)p322A-MT轉(zhuǎn)化萊茵衣藻萊茵衣藻CC-849在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106細(xì)胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用電激緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108細(xì)胞/mL。加入終濃度為4μg/mL的含外源基因的質(zhì)粒(p322A-MT)及25μg/mL的鮭精DNA，混勻后置冰上，吸取0.4mL于電轉(zhuǎn)杯中待用。電轉(zhuǎn)儀(Eppendorf)電激時(shí)電壓為1KV/cm，持續(xù)時(shí)間2秒，然后冰上放置10分鐘，補(bǔ)充10mLTAP液體培養(yǎng)基22℃光照培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)12-18小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到篩選平板上繼續(xù)培養(yǎng)(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長(zhǎng)出。轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的篩選與鑒定上述篩選平板培養(yǎng)基中含有100μg/mL的壯觀霉素，如果藻細(xì)胞能在篩選平板上長(zhǎng)出單克隆藻落，說明轉(zhuǎn)化載體上的標(biāo)記基因aadA已經(jīng)整合到葉綠體基因組中。要確定該藻落為轉(zhuǎn)目的基因衣藻，首先通過連續(xù)繼代培養(yǎng)15-20代后，再進(jìn)行分子檢測(cè)。具體方法如下(以轉(zhuǎn)MT-like基因萊茵衣藻為例)(1)以轉(zhuǎn)基因衣藻的總DNA為模板，按MT-like基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增出MT-like基因片段，以地高辛標(biāo)記的完整的MT-like基因?yàn)樘结槪M(jìn)行PCR-Southernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段可與探針雜交，轉(zhuǎn)基因衣藻出現(xiàn)和陽性對(duì)照一致的雜交印跡反應(yīng)，而對(duì)照組沒有印跡。這表明含MT-like基因已經(jīng)整合到萊茵衣藻的基因組中。(2)提取轉(zhuǎn)基因衣藻總RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，按MT-like基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過RT-PCR擴(kuò)增出MT-like基因片段，以地高辛標(biāo)記的完整的MT-like基因?yàn)樘结?，進(jìn)行RT-PCR-Southernblot檢測(cè)，若轉(zhuǎn)基因衣藻出現(xiàn)和陽性對(duì)照一致的雜交印跡反應(yīng)，而對(duì)照組沒有印跡，表明整合進(jìn)衣藻基因組中的MT-like基因在衣藻細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性，可在mRNA水平進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄。(3)提取轉(zhuǎn)基因藻的總蛋白，用MT-like蛋白作標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過HPLC分析比較轉(zhuǎn)基因藻；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因藻的總蛋白與目的產(chǎn)物單克隆抗體進(jìn)行Westernblot分析，在轉(zhuǎn)基因藻中檢測(cè)到MT-like蛋白，而對(duì)照樣品則不能檢測(cè)到該蛋白。說明導(dǎo)入到衣藻中的MT-like已經(jīng)表達(dá)，并翻譯出目的產(chǎn)物。通過上面的鑒定，確認(rèn)轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器(葉綠體基因組表達(dá)系統(tǒng))已經(jīng)構(gòu)建完成，利用MT-like基因獲得的轉(zhuǎn)基因藻為Tr-MT-like；利用MT-like-M基因獲得的轉(zhuǎn)基因藻為Tr-MT-like-M。目標(biāo)產(chǎn)物的分離技術(shù)目標(biāo)產(chǎn)物的分離方法同實(shí)施例三，結(jié)果表明，在同樣的誘導(dǎo)條件下，單位干重的轉(zhuǎn)基因藻(Tr-MT-like-M)的表達(dá)量是轉(zhuǎn)基因藻Tr-MT-like的12倍。權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，它包括下列步驟A、轉(zhuǎn)基因受體藻的篩選與培養(yǎng)；B、含篩選標(biāo)記基因表達(dá)框架的外源基因萊茵衣藻表達(dá)載體構(gòu)建；C、外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因藻的篩選；D、外源基因表達(dá)調(diào)控，其包括外源基因的改造、強(qiáng)啟動(dòng)子的篩選、控制外源目的基因?qū)肴R茵衣藻的融合位置為細(xì)胞核基因組或葉綠體基因組。2.按權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征是構(gòu)建一種生產(chǎn)類金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)MT-like基因的萊茵衣藻生物反應(yīng)器，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)MT-like基因的萊茵衣藻，并從中分離類金屬硫蛋白。3.按權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因受體藻的篩選與培養(yǎng)，選擇萊茵衣藻為轉(zhuǎn)基因受體藻，采用Tris-acetate-phosphate/TAP培養(yǎng)基，在通氣和光照～90μE/m2.s的條件下培養(yǎng)。4.按權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征是含篩選標(biāo)記基因表達(dá)框架外源基因萊茵衣藻表達(dá)載體包括萊茵衣藻強(qiáng)啟動(dòng)子/RBCS2啟動(dòng)子，HSP70A-RBCS2合成啟動(dòng)子、atpA啟動(dòng)子，目的基因/MT-like、終止子/RBCS2終止子，rbcL3′終止子、篩選標(biāo)記基因/ble，aadA，其構(gòu)建過程包括(1)外源基因萊茵衣藻細(xì)胞核表達(dá)載體的構(gòu)建A首先將載體pSP105上克隆有RBCS2的5′啟動(dòng)子序列和它的3′終止子序列，中間攜帶有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，利用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)插入外源基因構(gòu)成RBCS2的5′啟動(dòng)子、目的基因和RBCS2終止子的表達(dá)盒，通過EcoRV酶切位點(diǎn)將該表達(dá)盒插入pSP124載體上/pSP124上含有ble基因的表達(dá)盒/RBCS2啟動(dòng)子-ble-RBCS2終止子，編碼13.5KD的腐草霉素結(jié)合蛋白，構(gòu)建含RBCS2啟動(dòng)子的外源基因萊茵衣藻細(xì)胞核表達(dá)載體；B載體pCB740上克隆有Hsp70A-RBCS2合成啟動(dòng)子，以pCB740質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)上下引物上游引物PrHp1/5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT3′HindIII下游引物PrHp2/5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′PmaCI通過PCR從質(zhì)粒pCB740上擴(kuò)增出含HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子片段，經(jīng)電泳分離后從凝膠中回收，采用T-A克隆策略將其克隆到的pMD18-T載體上，得到的轉(zhuǎn)化子命名為HRT，通過PmaCI和HindIII從重組質(zhì)粒HRT上分離出HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子片段，將pSP105用PmaCI和HindIII雙酶切，經(jīng)電泳分離后從凝膠中回收切除了RBCS2啟動(dòng)子/740bp的pSP105質(zhì)粒片段/pSP105-1P，通過T4DNA連接酶將HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子連接到pSP105-1P，得到萊茵衣藻表達(dá)載體pH105，利用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)插入外源基因構(gòu)成HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子、目的基因和RBCS2終止子的表達(dá)盒，通過EcoRV酶切位點(diǎn)將該表達(dá)盒插入pSP124載體上，構(gòu)建含HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子的外源基因萊茵衣藻細(xì)胞核表達(dá)載體；(2)外源目的基因萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建首先是利用同源重組片段衣藻葉綠體的psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列將外源基因定點(diǎn)整合到受體細(xì)胞葉綠體基因組psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列之間，利用萊茵衣藻葉綠體rbcL基因的5′啟動(dòng)子、rbcL基因的3’終止子驅(qū)動(dòng)外源基因在萊茵衣藻的表達(dá)，篩選標(biāo)記為aadA基因，質(zhì)粒p53rGFPct上攜帶有衣藻葉綠體的rbcL5′啟動(dòng)子和rbcL3′終止子序列，通過NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，并插入外源目的基因，rbcL5′啟動(dòng)子和rbcL3′終止子序列可以在衣藻葉綠體中表達(dá)插入的外源基因，構(gòu)成rbcL5′啟動(dòng)子-目的基因-rbcL3′終止子的外源基因表達(dá)盒，載體p322上攜帶有衣藻葉綠體psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列，外源基因表達(dá)盒插入葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA之間的位置構(gòu)成p322-1；p423質(zhì)粒上攜帶有篩選標(biāo)記aadA基因的表達(dá)盒/atpA5′啟動(dòng)子-aadA-rbcL3′終止子，通過EcoRI和SacI雙酶切p423，獲得1.9kb的aadA基因表達(dá)盒，連入p322-1的EcoRI和SacI位點(diǎn)，得到外源基因萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征在于外源目的基因?qū)肴R茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化方法包括(1)珠磨法萊茵衣藻CC-849在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106cells/mL，室溫離心收集，用TAP培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108cells/mL；吸取300μL懸浮液到5mL的兩個(gè)試管里，將目的DNA酶切成線狀，取1μg-2μg加入試管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振蕩15秒后，把混合液轉(zhuǎn)移到25mL的帶螺旋帽的離心管中，加入10mL滅菌TAP培養(yǎng)液，在22℃溫度下60rpm振蕩搖床過夜培養(yǎng)/光照條件為90μE/m2/s；室溫離心收集細(xì)胞，去上清，用0.5mLTAP重懸，加入3.5mL0.5％TAP培養(yǎng)基，混勻后倒在TAP篩選平板上，22℃光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)7-15天，平板上長(zhǎng)出綠色的單克隆藻落；(2)基因槍法萊茵衣藻在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106細(xì)胞/mL，室溫離心收集，用TAP液體培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108細(xì)胞/mL。吸取300μL懸浮液涂布于TAP固體平板培養(yǎng)基，22℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天以形成細(xì)胞層，光照條件為90μE/m2/s，在無菌條件下用基因槍/Bio-Rad轟擊，取50μL金粉懸浮液/60μg/mL，加入2μg含有外源基因的環(huán)狀質(zhì)粒和50μL2MCaCl2和20μL0.1M亞精胺，通過渦輪振蕩器振蕩1-3分鐘以混合，8,000rpm離心10秒，棄上清，用無水乙醇清洗，振蕩，再8,000rpm離心10秒，棄上清，共5次，最后用60μL無水乙醇重懸沉淀，每次轟擊取10μL，轟擊參數(shù)如下，真空度25inches·Hg，轟擊距離9cm，每皿轟擊3次，22℃光照培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到篩選平板上繼續(xù)培養(yǎng)1-2周，溫度為22℃，光照為90μE/m2/s，至綠色單克隆長(zhǎng)出；(3)電激穿孔法萊茵衣藻CC-849在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為1-2×106細(xì)胞/mL，室溫離心收集，用電激緩沖液/10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108細(xì)胞/mL。加入終濃度為4μg/mL的含外源基因的質(zhì)粒及25μg/mL的鮭精DNA，混勻后置冰上，吸取0.4mL于電轉(zhuǎn)杯中待用，電轉(zhuǎn)儀/Eppendorf電激時(shí)電壓為1KV/cm，持續(xù)時(shí)間2秒，然后冰上放置10分鐘，補(bǔ)充10mLTAP液體培養(yǎng)基22℃光照培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)12-18小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到篩選平板上繼續(xù)培養(yǎng)1-2周，溫度為22℃，光照為90μE/m2/s，至綠色單克隆長(zhǎng)出。6.按權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征是轉(zhuǎn)基因藻篩選與鑒定包括(1)用含有篩選抗生素的平板篩選單克隆藻落，通過連續(xù)繼代培養(yǎng)15-20代后，進(jìn)行進(jìn)一步的分子檢測(cè)；(2)分子鑒定包括PCR-Southernblot檢測(cè)、RT-PCR-Southernblot檢測(cè)、Westernblot檢測(cè)和產(chǎn)物分析。全文摘要本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法。利用萊茵衣藻作為轉(zhuǎn)基因受體生物，通過構(gòu)建含有篩選標(biāo)記基因表達(dá)框架的外源基因高效表達(dá)載體構(gòu)建，利用“珠磨法”、基因搶法、或電擊穿孔等方法，將來源于不同生物體(包括動(dòng)物、植物和微生物等)的目的基因?qū)肴R茵衣藻體內(nèi)，并根據(jù)需要整合到細(xì)胞核基因組、或葉綠體基因組中，采用一系列基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻高效生物反應(yīng)器。該方法構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻生物反應(yīng)器生長(zhǎng)速度快、繁殖周期短、產(chǎn)物易分離、光合自養(yǎng)和可集約化大規(guī)模培養(yǎng)等特性，實(shí)現(xiàn)快速、廉價(jià)生產(chǎn)各種藥用蛋白質(zhì)、工業(yè)原料、可食性疫苗、具有生物學(xué)活性的次生代謝產(chǎn)物等。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1827769SQ20061001830公開日2006年9月6日申請(qǐng)日期2006年1月26日優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日發(fā)明者胡章立,王潮崗,吳錦霞,黎雙飛,雷安平申請(qǐng)人:深圳大學(xué)