專利名稱：一種動物可食性組織中磺胺類藥物殘留篩選方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品抗菌素殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說屬于一種利用微生物學(xué)方法，篩選動物可食性組織中磺胺類藥物殘留的方法和用這種方法制備的試劑盒。
背景技術(shù)：
磺胺類藥物是一類應(yīng)用最早的人工合成抗菌藥物，具有抗菌譜廣、療效強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于畜、禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中，然而磺胺類藥物的過量使用必會導(dǎo)致食用動物產(chǎn)品中的殘留。
目前測定食品中磺胺類藥物殘留的分析方法有理化分析方法和生物分析方法。理化分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)、熒光胺衍生化薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫方法(ELISA)等。這些方法所需儀器價格昂貴，對操作人員要求較高，難于推廣，不適合高通量的樣品篩選。生物分析方法有ELISA方法和微生物學(xué)方法，ELISA方法雖具有快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但目前研制的磺胺多殘留ELISA試劑盒技術(shù)不夠成熟，且存在檢測費(fèi)用較高等問題。
應(yīng)用微生物學(xué)方法檢測動物食品中磺胺類藥物的殘留已有報道。它是基于抗菌物質(zhì)對微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作用，來定性或定量的確定樣品中的抗菌藥物的殘留，具有高通量、快速、方便、敏感等特點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)廣泛使用。歐盟四平皿法、德國三平皿法、新荷蘭腎檢測法等方法是將工作菌液加入40～45℃液體狀的瓊脂培養(yǎng)基中混合均勻，制成平板，4℃下保存，有效期為5d。這種方法操作繁瑣，費(fèi)力，有效期短，且對磺胺類敏感性不好(Korsrud GO，Boison JO，Nouws JF，MacNeil JD.Bacterial inhibition tests used to screen forantimicrobial veterinary drug residues in slaughtered animals.J AOAC Int.1998，81(1)21-4)，由此限制了這些方法在磺胺類殘留檢測中的應(yīng)用。美國、加拿大拭子法主要有美國的犢?？股睾突前奉愃幬锖Y選試劑盒(Calf Antibiotic and Sulfonamide Test，簡稱CAST)(U.S.Department of Agriculture(1984)，Performing the Calf Antibiotic and Sulfa Test. A SelfInstructional Guide，USDA/FSIS，Washington，DC；)和抗菌藥物快速篩選試劑盒(FastAntimicrobial Screening Test，簡稱FAST)(Fast Antimicrobial Screen Test，(FAST)for detectionof antibiotic and sulfonamide residues in Livestock kidney tissue-(1994)Performing the CalfAntibiotic and Sulfa Test.A SelfInstructional Guide，USDA/FSIS)，這兩種方法均以巨大芽孢桿菌作為工作菌液，兩個試劑盒的培養(yǎng)基的組成成分分別為CAST試劑盒的培養(yǎng)基為Mueller-Hinton培養(yǎng)基(如下述的文獻(xiàn)所述)，F(xiàn)AST試劑盒的培養(yǎng)基是在上述Mueller-Hinton培養(yǎng)基中加入了葡萄糖和溴甲酚紫。FAST試劑盒對抗生素與磺胺類藥物的靈敏度要高于CAST試劑盒，F(xiàn)AST對磺胺類藥物的檢測限為0.125～0.5μg/g，CAST為0.25～2.0μg/g(參見DeyBP，Thaker NH，Bright SA，Thaler AM.Fast antimicrobial screen test(FAST)improved screen testfor detecting antimicrobial residues in meat tissue.J AOAC Int.，2005，88(2)447-454)，上述兩種試劑盒均不能滿足磺胺類藥物的最大殘留限量(0.1μg/g)；同時，F(xiàn)AST對抗生素與磺胺類藥物的檢測時間要短于CAST，兩者檢測時間分別為6h和18h。培養(yǎng)基的配方是造成上述兩種試劑盒差異的主要原因?？朔F(xiàn)有方法和試劑盒存在的檢測時間長、靈敏度低和存放期短試劑盒是急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，建立一種基于微生物學(xué)的、方便、靈敏、用于可食性動物組織中磺胺類藥物殘留的篩選方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)靈敏度低、檢測時間長、操作費(fèi)時、費(fèi)力等缺陷。
本發(fā)明的第二個目的是研制與上述目的配套使用的試劑盒，以解決現(xiàn)有試劑盒存放期短，靈敏度較低的問題。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種動物可食性組織中磺胺類藥物殘留篩選方法，包括制備培養(yǎng)基、巨大芽孢桿菌工作菌液、抗菌藥物紙片和無菌棉拭子，其制備步驟如下所示1)將培養(yǎng)基、工作菌液、抗菌藥物紙片和含有甲氧芐啶的補(bǔ)充液單獨(dú)制備；2)將巨大芽孢桿菌制成孢子數(shù)為1×106個/ml工作菌液；3)將抗菌藥物紙片制備成直徑為7mm，含新霉素5μg的紙片；4)將所述的培養(yǎng)基制成如下所述的培養(yǎng)基，其組分如下培養(yǎng)基I牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氫鉀 0.5～1.0g/L瓊脂 15～20g/L無菌小牛血清 30～50ml/L甲氧芐啶 0.016～0.04mg/L補(bǔ)充水分至1L；培養(yǎng)基II牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L
磷酸二氫鉀0.5～1.0/L瓊脂 15～20g/L無菌小牛血清 30～50ml/L甲氧芐啶 0.016～0.04mg/L對氨基苯甲酸 0.1～0.2g/L補(bǔ)充水分至1L；按照以下步驟制備a)將上述培養(yǎng)基中的牛肉浸膏、酪蛋白胨、可溶性淀粉、磷酸二氫鉀和瓊脂加熱融化，調(diào)pH至7.0～7.5，121℃滅菌20min，冷卻至50℃；b)向步驟a)中加入滅活的無菌小牛血清和甲氧芐啶，得到培養(yǎng)基I；c)向步驟b)加入對氨基苯甲酸，得到培養(yǎng)基II；d)將步驟b)或c)的培養(yǎng)基分裝至培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基冷卻，并使培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的厚度為1.5～2mm；6)將工作菌液均勻涂布于培養(yǎng)基I或II上；7)將新霉素紙片置于培養(yǎng)基上作陽性對照；8)用棉拭子取待測組織的樣品，將其置于培養(yǎng)基I或II上；9)向棉拭子上滴加補(bǔ)充液；和10)將培養(yǎng)基I或II置于溫度44～45℃，培養(yǎng)5～8h，根據(jù)培養(yǎng)基I和II上抑菌圈的出現(xiàn)情況判斷待測樣品中是否含有磺胺類藥物。
在本發(fā)明中，所述的補(bǔ)充液中甲氧芐啶為1.5～2μg/ml(用10％NaCl溶液配制)。
基于上述發(fā)明，本發(fā)明制備一種適用于動物可食性組織中磺胺類藥物殘留篩選的試劑盒，該試劑盒包括工作菌液、培養(yǎng)基、抗菌藥物紙片和無菌棉拭子。所述的工作菌液為孢子數(shù)為1×106個/ml的巨大芽孢桿菌菌液，所述的抗菌藥物紙片為5μg新霉素/∮7mm，所述的補(bǔ)充液為甲氧芐啶液，所述的培養(yǎng)基為培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基II聯(lián)用的培養(yǎng)基，按照以下組分配制培養(yǎng)基I牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氫鉀 0.5～1.0g/L瓊脂 15～20g/L無菌小牛血清 30～50ml/L甲氧芐啶 0.016～0.04mg/L補(bǔ)充水分至1L；培養(yǎng)基II
牛肉浸膏1.5～3g/L酪蛋白胨8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氫鉀 0.5～1.0/L瓊脂15～20g/L無菌小牛血清30～50ml/L甲氧芐啶0.016～0.04mg/L對氨基苯甲酸0.1～0.2g/L補(bǔ)充水分至1L；按照以下步驟制備a)將上述培養(yǎng)基中的牛肉浸膏、酪蛋白胨、可溶性淀粉、磷酸二氫鉀和瓊脂加熱融化，調(diào)pH至7.0～7.5，121℃滅菌20min，冷卻至50℃；b)向步驟a)中加入滅活的無菌小牛血清和甲氧芐啶，得到培養(yǎng)基I；c)向步驟b)的培養(yǎng)基中加入對氨基苯甲酸，得到培養(yǎng)基II；d)將步驟b)或c)的培養(yǎng)基分裝至培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基冷卻，并使培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基厚度為1.5～2mm。
在本發(fā)明中，所述的含有甲氧芐啶的補(bǔ)充液溶液是用10％NaCl溶液配制而成，其中含甲氧芐啶1.5～2μg/ml(該補(bǔ)充液是在檢測過程中專門用于棉拭子取待測組織的樣品時作為增效劑的使用，它是一個獨(dú)立的成分(核心試劑)，而培養(yǎng)基中加入的甲氧芐啶是在配制培養(yǎng)基中預(yù)先與其他上述組分一起加入的)。
本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于在體外檢測動物可食性組織中磺胺類藥物殘留。
本發(fā)明試劑盒的檢測原理是利用甲氧芐啶(TMP)與磺胺類藥物的協(xié)同作用增強(qiáng)細(xì)菌對磺胺類藥物的敏感度，通過補(bǔ)充培養(yǎng)基和待測棉拭子中TMP的含量以提高樣品中磺胺類藥物的檢出能力。利用對氨基苯甲酸(PABA)與磺胺類藥物之間的拮抗作用，通過在培養(yǎng)基中補(bǔ)充PABA含量消除磺胺類藥物的影響，通過有和沒有PABA兩種培養(yǎng)基聯(lián)合定性分析殘留物是否為磺胺類藥物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明采用了菌種和培養(yǎng)基分離的方法，主要試劑均以工作液形式提供，解決了傳統(tǒng)微生物方法穩(wěn)定性差的問題；在測定樣品時，只需將棉拭子插入組織樣品，樣品前處理簡單，整個測定過程由6h縮短為5h，適合高通量的樣品篩選；對磺胺類藥物的靈敏度低，適用于定性檢測動物組織樣品中多種磺胺類藥物殘留；操作方法方便易行、靈敏度高、簡單、快速，將會為磺胺類藥物殘留的監(jiān)控提供有力的保障。


圖1、圖2是應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒對樣品中磺胺類藥物殘留的結(jié)果判定示意圖，新霉素紙片在圖1和圖2的培養(yǎng)基上所產(chǎn)生的抑菌圈直徑20～26mm，A在圖1A和圖2A上，棉拭子周圍均無抑菌圈，結(jié)果判定為陰性；B棉拭子在圖1B上有清晰抑菌圈，在圖1B上無抑菌圈，抑菌圈直徑≥6mm者，結(jié)果判定為陽性，表明有磺胺類藥物殘留；C棉拭子在圖1C和圖2C均有清晰抑菌圈，則表明存在除磺胺類藥物以外的其他藥物殘留。
圖3是本發(fā)明試劑盒與同類試劑盒CAST、FAST試劑盒對磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低檢測限的比較柱形圖。圖中SST代表為本發(fā)明試劑盒，CAST代表CAST試劑盒，圖例FAST代表FAST試劑盒；SD為磺胺嘧啶，SM2為磺胺二甲嘧啶，SQ為磺胺喹噁啉，SMP為磺胺甲氧噠嗪，SMM為磺胺間甲氧嘧啶，SMZ為磺胺甲基異噁唑。
圖4是儲存時間對新霉素紙片抑菌圈直徑大小的影響。
圖5是儲存時間對巨大芽孢桿菌應(yīng)用工作菌液菌落濃度的影響。
圖6是本發(fā)明的篩選方法及其試劑盒——涂拭接種示意圖，圖中A、標(biāo)記點(diǎn)(X)開始，上下來回，由右向左涂拭；B、將培養(yǎng)皿順時針轉(zhuǎn)動1/4圈，重復(fù)1涂拭；C、再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動1/4圈，重復(fù)1涂拭過程；D、再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動1/4圈，重復(fù)1涂拭過程；E、最后將培養(yǎng)皿順時針轉(zhuǎn)動1/2圈，重復(fù)A的涂拭過程。
圖7是拭子與新霉素紙片的放置示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)方法操作，參見Dey B.P.，White C.A.and Thakre N.H..Detection of antimicrobial residues by fastantimicrobial screen test(FAST).USDA/FSIS.Microbiology Laboratory Guidebook.3rd edition，1998。鑒于本發(fā)明的方法和試劑盒研制互為依存，為了節(jié)約篇幅，以下的描述是將檢測方法的建立與試劑盒合在一起描述。
實(shí)施例1、篩選方法的建立(1)最佳培養(yǎng)基的設(shè)計在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分(牛肉浸膏1.5g/L，酪蛋白胨8.5g/L，可溶性淀粉0.75g/L)上測定三種影響藥物敏感性的因素試驗(yàn)，分別為ATMP的濃度TMP4μg/ml、TMP1.6μg/ml、TMP0.2μg/ml，按培養(yǎng)基體積1％添加；B培養(yǎng)基加至培養(yǎng)皿的體積5.5ml、7ml和8.5ml；C血清占培養(yǎng)基總量，依次設(shè)計為3％、5％、7％，以磺胺嘧啶0.1μg/ml為對象，涂拭孢子數(shù)為1×106個/ml的巨大芽孢桿菌工作菌液(Bacillus megaterium，菌株編號為ATCC9885，參見U.S.Department of Agriculture(1984)Performing the Calf Antibiotic and Sulfa Test.A SelfInstructional Guide，USDA/FSIS，Washington，DC，購自美國菌種保藏機(jī)構(gòu)，羅克維爾，馬里蘭州(American Type Culture Collection，Rockville，MD))(下列實(shí)施例均為同一來源菌株)，確定最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明按重量/體積計，牛肉浸膏1.5g/L，酪蛋白胨8.5g/L，可溶性淀粉0.75g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，瓊脂粉15g/L，加蒸餾水定容至1L，調(diào)pH為7.0。121℃滅<p>表8.實(shí)施例3引物特性

擴(kuò)增產(chǎn)物長142堿基，解鏈溫度82.3℃。限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)有二個MwoI切點(diǎn)(105和114)。PCR反應(yīng)首次變性81-94℃一分鐘，循環(huán)變性81-94℃10秒鐘，退火60℃一分鐘，延伸70℃30秒鐘。對照組不加酶，試驗(yàn)組每100微升反應(yīng)液加酶2微升。
試驗(yàn)結(jié)果列于表9。
表9.實(shí)施例3試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果說明變性溫度太低擴(kuò)增產(chǎn)物不能完成變性，對照組和試驗(yàn)組均無擴(kuò)增產(chǎn)物形成。變性溫度太高限制性核酸內(nèi)切酶MowI失活，對照組和試驗(yàn)組均形成擴(kuò)增產(chǎn)物，控制適當(dāng)?shù)淖冃詼囟葘φ战M形成苦增產(chǎn)物而試驗(yàn)組沒有擴(kuò)增產(chǎn)物形成。
“-”表示未出現(xiàn)抑菌圈(3)對氨基苯甲酸濃度的確定取供1μg/ml磺胺嘧啶1ml，至一個平皿中，將1×106個/孢子的巨大芽孢桿菌稀釋成10-4，再向平皿中加入稀釋好的巨大芽孢桿菌菌液1ml，注入15ml含不同濃度(0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L和1g/L)PABA的檢測用瓊脂培養(yǎng)基，同時設(shè)不加PABA空白對照組。每濃度5個平皿，共重復(fù)3次。重復(fù)培養(yǎng)后同一取樣的5個平皿結(jié)果相加。測定結(jié)果如表3所示。
結(jié)果表明培養(yǎng)基中PABA濃度為0.2g/L為最佳濃度。
表3不同濃度對氨基苯甲酸對磺胺嘧啶作用的巨大芽孢桿菌細(xì)菌數(shù)的影響

實(shí)施例2、試劑盒的制備(1)試劑盒的組成本發(fā)明的試劑盒包括裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿、孢子數(shù)為1×106個/ml的巨大芽孢桿菌菌液、5μg/直徑7mm新霉素濾紙片、2μg/ml甲氧芐啶補(bǔ)充溶液和無菌棉拭子(規(guī)格棉拭子頭部長度26～30mm，直徑4.2～4.8mm。121℃滅菌15min，37℃干燥，密封保存)。
(2)菌種的制備取巨大芽孢桿菌菌種接種于3個腦心浸出液培養(yǎng)基瓊脂上(購自英國Oxoid公司)，37℃培養(yǎng)18h。挑單個菌落接種至血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h。每個培養(yǎng)基上先挑取3個典型菌落作生化鑒定，然后挑取鑒定合格的單個菌落接種至AK-2芽孢生長瓊脂試管斜面(Dey BP，White C A and Thakre N H.Detection of antimicrobial residues by fast antimicrobial screen test(FAST).USDA/FSIS.Microbiology Laboratory Guidebook.3rd edition，1998)(菌種在培養(yǎng)和純化時，必須經(jīng)生化鑒定合格后，才能進(jìn)行下一步操作，否則菌種重新培養(yǎng))，37℃培養(yǎng)18h。用無菌生理鹽水洗下芽孢，移至有AK-2芽孢生長瓊脂的魯氏瓶中，37℃培養(yǎng)18～24h后，室溫培養(yǎng)6d，鏡檢。當(dāng)有80％芽孢形成時，用滅菌生理鹽水沖洗芽孢至滅菌的三角燒瓶中，100℃水浴加熱10min，分裝，在10000r/min離心20min，棄上清液。沉淀物用滅菌生理鹽水懸浮，離心，重復(fù)洗滌2次，將沉淀物用滅菌生理鹽水重新懸浮成孢子混合液。
稱取聚乙二醇4000 11.8g于100ml帶刻度的帶塞玻璃瓶中，于121℃滅菌5min；加入滅菌磷酸鹽緩沖液(3mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.1)磷酸氫二鉀306.9g和磷酸二氫鉀168.6g溶解至去離子水1000ml)34.1ml，充分震蕩，5000r/min漩渦混合5min，棄去。加入11.8g滅菌聚乙二醇4000，磷酸鹽緩沖液溶液(配方同前，pH7.1)34.1ml，前述孢子混合液25ml，用滅菌水補(bǔ)充至100ml，在5000r/min漩渦混勻5min，分裝到離心管中，于3000r/min離心2min。取上層液體至另一無菌50ml離心管中，于5℃，10000r/min下離心20min，棄去上清液。沉淀物加滅菌水20ml懸浮，在10000r/min條件下，5℃，離心20min，棄取上清液，重復(fù)洗滌5次。沉淀物用50％乙醇懸浮，收集菌懸液于100ml無菌玻璃瓶中，密封，4℃保存，有效期6個月。
菌落計數(shù)將巨大芽孢桿菌懸液用Butterfield磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀0.0425g溶解至1000ml去離子水，pH7.2)稀釋成10-1～10-10的菌液。取稀釋后菌液0.1ml至培養(yǎng)皿中，加入已融化的培養(yǎng)皿計數(shù)瓊脂10ml，混勻。每一濃度重復(fù)3個培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)48h，計數(shù)。以每皿菌落數(shù)在30-300的稀釋倍數(shù)計算孢子原液的濃度。根據(jù)孢子原液的濃度，用無菌50％乙醇將孢子原液稀釋到指定濃度1×106個/ml。應(yīng)用液儲存于滅菌容器中，4℃保存。
(3)培養(yǎng)基及平板的制備培養(yǎng)基I的制備取牛肉浸膏1.5g/L，酪蛋白胨8.5g/L，可溶性淀粉0.75g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，瓊脂粉15g/L，加熱融化，調(diào)pH值至7.0，121℃滅菌20min。冷卻至50℃后，加入無菌的小牛血清50ml，1.6μg/mlTMP溶液10ml，混合均勻后，每個培養(yǎng)皿中加入上述培養(yǎng)基5.5ml，均勻攤布，放置水平臺上，冷卻凝固，備用。
培養(yǎng)基II的制備取牛肉浸膏1.5g/L，酪蛋白胨8.5g/L，可溶性淀粉0.75g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，對氨基苯甲酸0.2g/L，瓊脂粉15g/L，加熱融化，調(diào)pH值至7.0，121℃滅菌20min。冷卻至50℃后，加入無菌的小牛血清50ml，1.6μg/mlTMP溶液10ml，混合均勻后，每個培養(yǎng)皿中加入上述培養(yǎng)基5.5ml，均勻攤布，放置水平臺上，冷卻凝固，備用。
(4)新霉素紙片的制備取直徑為7mm濾紙紙片200枚放入1個潔凈青霉素瓶中，121℃滅菌15min，37℃干燥后，加入500μg/ml新霉素(購自中國獸藥監(jiān)察所，含量為709IU/mg，生產(chǎn)批號3099310)溶液2ml，使每1片紙片浸潤，4℃平衡過夜。37℃干燥后，密封，室溫(22-25℃)儲存。每1紙片含新霉素5μg。
(5)甲氧芐啶補(bǔ)充液的配制準(zhǔn)確稱取甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品(含量為99.87％)10.01mg，加入80ml無菌20％乙醇，充分混合，并定容至100ml，成濃度為100μg/ml的甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取上述甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)儲備存液1ml，用無菌10％氯化鈉稀釋定容至50ml，成濃度為2μg/ml的甲氧芐啶補(bǔ)充液，-20℃保存。
實(shí)施例3、本發(fā)明試劑盒使用的操作程序3.1本發(fā)明試劑盒操作步驟第1步仔細(xì)檢查培養(yǎng)箱的溫度，將溫度設(shè)為44～45℃，培養(yǎng)箱內(nèi)放置一廣口瓶，裝水約120ml。從冰箱中取出培養(yǎng)基及菌液，放置室溫。
第2步將待檢樣品放置于干凈的托盤中，用一把潔凈的手術(shù)刀組織樣(腎臟、肌肉、肝臟)快速切開，切口約2cm深。注意切面保持平整。
第3步；取出無菌的棉拭子后，將兩支棉拭子從切口處垂直插入待測組織中，并稍用力將切面夾緊，使棉拭子頭充分接觸組織。棉拭子放置于組織中至少30min，直至棉拭子吸滿組織液。
第4步在設(shè)有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿外側(cè)用記號筆做一參照標(biāo)記，作為涂拭巨大芽孢桿菌菌種的起點(diǎn)。檢查盛芽孢瓶子的蓋子是否旋緊。密封后，劇烈搖動芽孢懸液，使芽孢混合均勻。打開盛芽孢瓶瓶蓋，插入無菌棉拭子，待棉拭子完全浸透后取出。將盛芽孢瓶的瓶蓋旋緊，用封口膜再次密封。注意不要重復(fù)使用棉拭子。
第5步涂拭菌液的過程如附圖6。
第6步打開盛新霉素的瓶蓋，用鑷子取出紙片，在距培養(yǎng)皿做記號的邊緣12～13mm的位置放置一片新霉素紙片，用鑷子輕壓紙片，使紙片完全貼在培養(yǎng)基上。注意新霉素紙片放置好后，不要挪動新霉素紙片的位置，若紙片位置不合適，應(yīng)重新取培養(yǎng)基進(jìn)行涂拭。
第7步檢查棉拭子頭在組織中是否吸收飽和，待吸滿后取出，用剪刀將棉拭子桿剪斷，剩約10～15mm長，分別放置于已涂拭菌液的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基II)表面(呈兔耳狀)，棉拭子頭應(yīng)遠(yuǎn)離新霉素紙片。每個培養(yǎng)皿放置兩個棉拭子(即可測定兩個樣品)，放好后注意用鑷子輕壓棉拭子桿以固定。見附圖7。
第8步向放好棉拭子上用移液器吸取50μL的甲氧芐啶溶液滴至棉拭子上，將制備好的培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度44℃。將本試劑盒培養(yǎng)5h，不應(yīng)超過12h，判定結(jié)果。
第9步小心將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，仔細(xì)檢查培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基II表面細(xì)菌生長情況。觀察培養(yǎng)基表面是否有部分細(xì)菌生長。若有，繼續(xù)下步操作；若沒有，可能是材料或操作存在問題。
第10步仔細(xì)檢查新霉素紙片周圍區(qū)域，紙片周圍透明清晰的區(qū)域稱為抑菌圈。該圈主要用作指示試劑盒是否有效的陽性對照，若紙片周圍沒有抑菌圈，表明試劑盒材料存在問題或操作不當(dāng)。用塑料直尺量取抑菌圈的直徑，若抑菌圈的直徑在20mm以下，表明實(shí)驗(yàn)操作存在問題，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
第11步仔細(xì)檢查棉拭子頭周圍的區(qū)域，棉拭子頭周圍存在透明清晰的區(qū)域稱為抑菌圈。此抑菌圈的產(chǎn)生是因?yàn)槊奘米宇^中的磺胺類藥物擴(kuò)散至培養(yǎng)基中抑制細(xì)菌的生長而產(chǎn)生。棉拭子頭周圍有抑菌圈表明測定結(jié)果為陽性。棉拭子頭處均長滿了細(xì)菌表明腎組織液中沒有殘留。棉拭子頭周圍不存在抑菌圈表明測定結(jié)果為陰性。
3.2本發(fā)明試劑盒結(jié)果判定若新霉素紙片在培養(yǎng)基I和II上所產(chǎn)生的抑菌圈直徑20～26mm內(nèi)，則可以進(jìn)行結(jié)果判定(見圖1和圖2)。
在培養(yǎng)基I和II上，棉拭子周圍均無抑菌圈，結(jié)果判定為陰性。
棉拭子在培養(yǎng)基I上有清晰抑菌圈，在培養(yǎng)基II上無抑菌圈，抑菌圈直徑≥6mm者，結(jié)果判定為陽性，表明有磺胺類藥物殘留。
棉拭子在培養(yǎng)基I和II均有清晰抑菌圈，則表明有除磺胺類藥物以外其他藥物殘留。
實(shí)施例4、試劑盒的靈敏度、量-反應(yīng)關(guān)系、準(zhǔn)確度、精確度、假陰性率、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(1)試劑盒的靈敏度試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(如表4所述)，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液溶解并用蒸餾水稀釋成濃度為1000μg/ml標(biāo)準(zhǔn)貯備液。選擇6種不同來源的均質(zhì)的空白豬肌肉及腎臟組織(以下實(shí)施例相同)，每份組織各5g，加入磺胺類藥物各0.5ml，使待測組織中磺胺類藥物濃度分別達(dá)到0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4μg/g，靜置30min，加滅菌的磷酸緩沖液(磷酸鹽緩沖液(pH7.0)的配制如下磷酸氫二鉀21.8g和磷酸二氫鉀17.1g溶解，并定容至1000ml蒸餾水)9.5ml，漩渦混合5min，室溫靜置30min，在4000r/min下離心10min，取上清液供培養(yǎng)基I檢測，同時取標(biāo)準(zhǔn)溶液(磺胺類藥物濃度依次為0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4μg/ml)測定。每個濃度設(shè)5個重復(fù)，共測定30次。以30次測定結(jié)果均為陽性者的最小濃度為最低檢測限。本試驗(yàn)的檢測結(jié)果見表4。由表4可看出本發(fā)明的試劑盒對豬肌肉和腎臟組織中6種磺胺類藥物的最低檢測限為0.025～0.1μg/g。本發(fā)明試劑盒與同類試劑盒CAST、FAST試劑盒對磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低檢測限的比較見圖3所示。
表4本發(fā)明的方法對在標(biāo)準(zhǔn)溶液和豬組織中磺胺類藥物的最低檢測限試驗(yàn)結(jié)果

(2)試劑盒的量-反應(yīng)關(guān)系試驗(yàn)稱取均質(zhì)的空白豬肌肉、腎臟組織樣品5g，加入磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)工作液(如上所述)0.5ml，使組織中藥物濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、4μg/g，經(jīng)制樣，取上清液供培養(yǎng)基I檢測。每種濃度5個重復(fù)，測定5次。將測得的抑菌圈直徑與相應(yīng)對數(shù)濃度線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。表5顯示了本發(fā)明的試劑盒對6種磺胺類藥物實(shí)測的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍和相關(guān)系數(shù)，表明在0.1～4μg/ml(g)濃度范圍內(nèi)，本發(fā)明試劑盒對豬肌肉、腎臟組織中6種磺胺類藥物測定的相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，具有良好的線性關(guān)系。
表5本發(fā)明試劑盒對6種磺胺類藥物測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍和相關(guān)系數(shù)


結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的輪胎非常明顯地減少了側(cè)壁的中空變形。
圖6示出了對于變化“A”(實(shí)線)和“I”(虛線)來說側(cè)壁的變形值，其為側(cè)壁上的角位置函數(shù)；與上面給出值不同，這些曲線是通過具有“預(yù)先處理”的連接區(qū)域的輪胎而獲得；它們的位置如箭頭所示。
圖7和8示出了根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實(shí)施例。
圖7示意性地示出了一個簾布層160，其具有兩個翼片161。當(dāng)然，圖中示出的翼片已被放大，以便更好地示出根據(jù)本發(fā)明的方法的原理。
圖8示出了根據(jù)本發(fā)明的方法的兩個階段。
在第一階段(圖8(a))，用于形成胎體加強(qiáng)元件的簾布層160被纏繞在一個成型鼓(圖中未示出)上，以便獲得簾布層邊緣的重疊部分170，所述重疊部分170平行于成型鼓的軸線180。
然后(圖8(b))，通過將翼片161沿著由簾布層160邊緣限定的直線折疊，將翼片161折疊過來，其中翼片161從所述邊緣上伸出。
這樣，形成了一個具有連接區(qū)域的胎體層，如圖8(c)所示，連接區(qū)域設(shè)置有覆蓋條。
圖9示意性地通過剖面示出了所獲得的連接區(qū)域，以及形成覆蓋條的折疊翼片161。
如圖7中所示的情況，沒有必要使用預(yù)先切除的簾布層。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，當(dāng)簾布層被纏繞在制造成型鼓上時，可以對其進(jìn)行切除。
表8本發(fā)明的試劑盒對豬腎臟和肌肉組織中的假陰性率(％)

(5)試劑盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)1)新霉素紙片的穩(wěn)定性試驗(yàn)將本發(fā)明制備的新霉素紙片儲存于2～8℃，每月取新霉素紙片測定其抑菌圈直徑。取新制備的培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基成分及含量如下蛋白胨6g、胰蛋白胨4g、牛肉浸膏1.5g、酵母浸膏3g、葡萄糖1g，溶解于1000ml蒸餾水中溶解，調(diào)節(jié)pH為7.3，加入瓊脂粉15g，濕熱滅菌即得)，涂布新配制的枯草芽孢桿菌孢子液(Bacillus subtilis，ATCC6633，美國菌種保藏機(jī)構(gòu)，羅克維爾，馬里蘭州(American Type Culture CollectionTM，Rockville，MD))，其孢子液濃度為1×106個/ml。取新霉素紙片3枚置于培養(yǎng)基表面，在29℃培養(yǎng)18h，測量培養(yǎng)基表面抑菌圈的直徑是否在20～26mm范圍內(nèi)，作為鑒別培養(yǎng)基失效期的參考標(biāo)準(zhǔn)。由圖4可見，本發(fā)明制備的新霉素紙片貯存2～8℃，8個月內(nèi)的抑菌圈直徑在21.6～23mm之間，其有效期可以定在6個月以內(nèi)。
2)巨大芽孢桿菌的工作菌液的穩(wěn)定性將本發(fā)明制備的孢子液濃度為1×106個/ml巨大芽孢桿菌保存于2～8℃，用菌落計數(shù)法每月測定菌液的菌落濃度，觀察菌落濃度隨時間變化的趨勢。結(jié)果表明，孢子液的濃度略有下降，6個月內(nèi)變化較小(圖5)。用新制備的新霉素紙片放置于已涂布儲備應(yīng)用工作菌液的本發(fā)明的培養(yǎng)基表面，新霉素紙片抑菌圈直徑在20～26mm范圍內(nèi)，說明菌液在6個月內(nèi)是有效的。
3)試劑盒培養(yǎng)基的穩(wěn)定性試驗(yàn)新制備本發(fā)明試劑盒的培養(yǎng)基若干，將培養(yǎng)皿封裝于鋁塑復(fù)合袋中，于室溫20～25℃和2～8℃儲存。每月取樣，每次抽樣6個培養(yǎng)皿，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基的感觀指標(biāo)。同時，每個培養(yǎng)皿涂拭新制備巨大芽孢桿菌應(yīng)用工作菌液(1×106個/ml)，并分別用新配制的0.1μg/ml磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液和新制備新霉素紙片考核。如果檢測培養(yǎng)基沒有雜菌污染，從外觀上無顯著的變化，而且巨大芽孢桿菌生長茂盛、均勻，新霉素紙片的抑菌圈在20～26mm范圍內(nèi)則判定該培養(yǎng)基有效。從表9和表10可見，無論是在室溫還是在2～8℃供試的培養(yǎng)基在6個月內(nèi)，培養(yǎng)基的感觀指標(biāo)無明顯變化；6個月內(nèi)培養(yǎng)基I均能檢測出0.1μg/ml磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，培養(yǎng)基II上磺胺嘧啶不能被檢出。新霉素紙片的抑菌圈直徑在20～26mm范圍內(nèi)波動，符合規(guī)定試劑盒性能指標(biāo)。
表9本發(fā)明的試劑盒中培養(yǎng)基□的穩(wěn)定性試驗(yàn)

注“ND”未出現(xiàn)抑菌圈表10本發(fā)明的試劑盒中培養(yǎng)基□的穩(wěn)定性試驗(yàn)


注ND不出現(xiàn)抑菌圈實(shí)施例5、動物體內(nèi)殘留試驗(yàn)表11本發(fā)明試劑盒適用性試驗(yàn)

說明SST培養(yǎng)基□上產(chǎn)生的抑菌圈直徑；N無抑菌圈；+陽性；-陰性；ND未檢出；選擇品種為“長大”的斷奶仔豬16頭，每頭豬的體重為15±2.5kg，隨機(jī)分為2組，對照組4頭，試驗(yàn)組12頭。預(yù)試7天，飼喂不含任何抗菌藥物的飼料。7天后進(jìn)入正式試驗(yàn)。對照組日糧配方中不加磺胺嘧啶，試驗(yàn)組日糧配方中添加100mg/kg體重磺胺嘧啶。試驗(yàn)期間，使豬自由采食，自由飲水。連續(xù)飼喂5天后，試驗(yàn)組停止飼喂加磺胺嘧啶日糧。停藥后0天、3天、5天、7天分別屠宰加藥組豬3頭和空白對照組豬1頭，采集背最長肌和腎臟，同時本發(fā)明試劑盒和高效液相色譜法(HPLC)測定，考察本發(fā)明試劑盒對實(shí)際樣品的檢出能力。
表11中列出了本發(fā)明試劑盒和HPLC法對磺胺嘧啶實(shí)際發(fā)生樣品的檢測結(jié)果。用本發(fā)明試劑盒檢測肌肉和腎臟中磺胺嘧啶殘留，肌肉中可檢出時間為停藥后0天，停藥后3～5天采集的肌肉樣品檢測均為陰性；腎臟中可檢出時間為停藥后5天。本發(fā)明試劑盒共檢出肌肉陽性樣品3份，陰性樣品9份，腎臟陽性樣品8份，陰性樣品4份；空白組肌肉和腎臟組織均未測出。用HPLC法測定，肌肉中磺胺嘧啶可檢出時間為3d，檢出肌肉陽性樣品為3份，低于最高殘留限量的為3份，低于檢測限量的樣品6份；腎臟中磺胺嘧啶停藥后5d仍能檢出，總檢出為8份，其中濃度高于最高殘留限量的為7份，低于限量的樣品為1份，不喂藥對照組均未檢出。由結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒對磺胺嘧啶在肌肉檢測結(jié)果與HPLC法符合率為100％；與腎臟的符合率為93.75％。
權(quán)利要求
1.一種動物可食性組織中磺胺類藥物殘留篩選方法，包括制備培養(yǎng)基、巨大芽孢桿菌工作菌液、抗菌藥物紙片和無菌棉拭子，其步驟如下所示1)將培養(yǎng)基、工作菌液、抗菌藥物紙片和甲氧芐啶補(bǔ)充液單獨(dú)制備；2)將巨大芽孢桿菌制成孢子數(shù)為1×106個/ml工作菌液；3)將抗菌藥物紙片制備成直徑為7mm，含新霉素5μg的紙片；4)將所述的培養(yǎng)基制成如下的培養(yǎng)基，其組分如下培養(yǎng)基I牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉0.75～1.5g/L磷酸二氫鉀0.5～1.0g/L瓊脂 15～20g/L無菌小牛血清 30～50ml/L甲氧芐啶 0.016～0.04mg/L補(bǔ)充水分至1L；及培養(yǎng)基II牛肉浸膏 1.5～3g/L酪蛋白胨 8.5～17g/L可溶性淀粉0.75～1.5g/L磷酸二氫鉀0.5～1.0/L瓊脂 15～20g/L無菌小牛血清 30～50ml/L甲氧芐啶 0.016～0.04mg/L對氨基苯甲酸 0.1～0.2g/L補(bǔ)充水分至1L；按照以下步驟制備a)將上述培養(yǎng)基中的牛肉浸膏、酪蛋白胨、可溶性淀粉、磷酸二氫鉀和瓊脂加熱融化，調(diào)pH至7.0～7.5，121℃滅菌20min，冷卻至50℃；b)向步驟a)中加入滅活的無菌小牛血清和甲氧芐啶，得到培養(yǎng)基I；c)向步驟b)加入對氨基苯甲酸，得到培養(yǎng)基II；d)將步驟b)或c)的培養(yǎng)基分裝至培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基冷卻，并使培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的厚度為1.5～2mm；6)將工作菌液均勻涂布于培養(yǎng)基I或II上；7)將新霉素紙片置于培養(yǎng)基上作陽性對照；8)用棉拭子取待測組織的樣品，將其置于培養(yǎng)基I或II上；9)向棉拭子上滴加所述的甲氧芐啶補(bǔ)充液；和10)將培養(yǎng)基I或II置于溫度44～45℃，培養(yǎng)5～8h，根據(jù)培養(yǎng)基I和II上抑菌圈的出現(xiàn)情況判斷待測樣品中是否含有磺胺類藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲氧芐啶補(bǔ)充液中甲氧芐啶為1.5～2μg/ml。
3.權(quán)利要求1或2所述的一種動物可食性組織中磺胺類藥物殘留篩選方法的試劑盒，包括培養(yǎng)基、巨大芽孢桿菌工作菌液、抗菌藥物紙片和無菌棉拭子，其特征在于，所述的工作菌液為孢子數(shù)為1×106個/ml的巨大芽孢桿菌菌液，所述的抗菌藥物紙片為5μg新霉素/∮7mm，所述的補(bǔ)充液為甲氧芐啶液，所述的培養(yǎng)基為培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基II聯(lián)用的培養(yǎng)基，按照以下組分配制培養(yǎng)基I牛肉浸膏1.5～3g/L酪蛋白胨8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氫鉀 0.5～1.0g/L瓊脂15～20g/L無菌小牛血清30～50ml/L甲氧芐啶0.016～0.04mg/L補(bǔ)充水分至1L；培養(yǎng)基II牛肉浸膏1.5～3g/L酪蛋白胨8.5～17g/L可溶性淀粉 0.75～1.5g/L磷酸二氫鉀 0.5～1.0/L瓊脂15～20g/L無菌小牛血清30～50ml/L甲氧芐啶0.016～0.04mg/L對氨基苯甲酸0.1～0.2g/L補(bǔ)充水分至1L；按照以下步驟制備a)將上述培養(yǎng)基中的牛肉浸膏、酪蛋白胨、可溶性淀粉、磷酸二氫鉀和瓊脂加熱融化，調(diào)pH至7.0～7.5，121℃滅菌20min，冷卻至50℃；b)向步驟a)中加入滅活的無菌小牛血清和甲氧芐啶，得到培養(yǎng)基I；c)向步驟b)的培養(yǎng)基中加入對氨基苯甲酸，得到培養(yǎng)基II；d)將步驟b)或c)的培養(yǎng)基分裝至培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基冷卻，并使培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基厚度為1.5～2mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于補(bǔ)充液中的甲氧芐啶為1.5～2μg/ml。
5.權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在體外檢測動物可食性組織中磺胺類藥物殘留中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品殘留抗菌素檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種利用微生物學(xué)方法，檢測動物可食性組織中磺胺類藥物殘留的方法及其試劑盒。其方法包括制備培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基II，用巨大芽孢桿菌作工作菌液，新霉素紙片作質(zhì)控用的抗菌素紙片，甲氧芐啶作增效用的補(bǔ)充液，將培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基II聯(lián)用，用棉拭子粘取待測動物組織樣品，并向棉拭子上滴少許甲氧芐啶補(bǔ)充液，然后將其與所述的培養(yǎng)基接觸培養(yǎng)。根據(jù)棉拭子周圍出現(xiàn)抑菌圈的有無判定檢測結(jié)果。本發(fā)明還公開了應(yīng)用上述方法的專用試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是檢測方法簡便，靈敏度高，試劑盒存放時間長，適合高通量的樣品篩選。
文檔編號C12Q1/04GK1858232SQ20061001864
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月27日
發(fā)明者袁宗輝, 伍金娥, 王玉蓮, 謝長清, 余歡, 陳冬梅, 陶燕飛, 劉振利, 黃玲利, 常超 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)