專利名稱：甲基纖維素水凝膠固定化酶電極及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化酶電極，具體說是一種甲基纖維素水凝膠固定化酶電極及其制備方法和和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
電化學(xué)酶傳感器結(jié)合了電化學(xué)方法的高靈敏性和酶的高選擇性，其主要應(yīng)用是定量檢測復(fù)雜樣品中組分的含量。為了提高電化學(xué)酶傳感器測定的專一性、靈敏度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和使用壽命，研究工作主要集中在構(gòu)筑酶傳感器條件的優(yōu)化，如選擇固定酶的材料、固定方法、適當(dāng)?shù)拿浇轶w和電極基底材料等。
生物電化學(xué)酶傳感器的制備中，最關(guān)鍵的技術(shù)包括(1)如何將酶固定在電極表面；(2)如何保持固定化酶的催化活性；(3)酶修飾電極能在有機相使用。使用的方法有吸附法，包埋法，自組裝法等，其中吸附法容易造成酶的流失，電極壽命短，而自組裝法固定酶的量較少，而且制作過程所需的時間較長。所以固定化酶的方法主要是包埋法。使用包埋法，要求固定材料能形成穩(wěn)定的膜；具有生物親和性；能保持酶的催化活性等特點。存在的不足是傳統(tǒng)的包埋法中所用的凝膠主要有聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯醇等有機合成高分子材料，這些材料的生物親合性較差、傳質(zhì)阻力大，制備的酶電極不能用于有機相。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有較高的穩(wěn)定性、響應(yīng)快和重現(xiàn)性好、能在有機相等特殊條件下使用、應(yīng)用范圍廣，可用于化工、醫(yī)藥、環(huán)境等行業(yè)的安全檢測、環(huán)保監(jiān)測、生產(chǎn)過程控制等的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極，為制備生物傳感器尋找新的固定化材料。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述甲基纖維素水凝膠固定化酶電極的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供上述甲基纖維素水凝膠固定化酶電極的應(yīng)用。
本發(fā)明的設(shè)計思想是甲基纖維素在熱水溶液中呈粘稠無序的水溶膠，冷卻后聚糖鏈呈螺旋狀且聚集成空腔，空腔里含有大量的水。在有機小分子的協(xié)同作用下，形成的甲基纖維素水凝膠膜具有較強的彈性和較高穩(wěn)定性。利用甲基纖維素這一特性和良好的生物親和性，制備甲基纖維素固定化酶電極。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的將甲基纖維素0.1～0.6克溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成甲基纖維素水凝膠；將有機溶劑與上述甲基纖維素水凝膠按有機溶劑∶甲基纖維素水凝膠＝1∶3～1∶6體積比混合后，再與酶溶液等體積混合，攪拌均勻制成混合溶液；滴涂在電極表面，室溫干燥，得到甲基纖維素固定化酶電極。
本發(fā)明可在有機溶劑中加入媒介體，將含有媒介體的有機溶劑(濃度為0.01mol·L-1)與甲基纖維素水凝膠混合(含有媒介體的有機溶劑與甲基纖維素水凝膠體積比為1∶3～1∶6)均勻后，再與酶溶液等體積混合，攪拌均勻，滴涂在電極表面，室溫干燥，得到含有媒介體的甲基纖維素固定化酶電極。
本發(fā)明所述的有機溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、甘油、吡啶或環(huán)己烷等。
本發(fā)明所述的酶為血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶、過氧化氫酶、酪氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶或乙醇脫氫酶等。
所述的媒介體為二茂鐵及其衍生物；鋨、釕有機配合物；醌類或有機染料等。
由于本發(fā)明制備的甲基纖維素水凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，加入有機溶劑后，加速了凝膠化過程，使甲基纖維素水凝膠溶脹效應(yīng)小，具有較強的彈性、高穩(wěn)定性和良好的生物親和性，制備的酶電極響應(yīng)穩(wěn)定。制備酶電極時，將酶、媒介體與甲基纖維素水凝膠混合均勻成膜，制備的酶電極響應(yīng)快，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，使用壽命長，準(zhǔn)確度高，精密度好，測量范圍寬。在水相、含水有機相和有機相中，能催化還原有機氯化物、過氧化物、酚和一氧化氮等。
本發(fā)明制備的酶電極使用范圍廣，在水相、含水有機相和有機相中均能使用且均具有生物催化活性。因為甲基纖維素水凝膠為包埋在凝膠內(nèi)的酶提供微水環(huán)境，保持酶的原始構(gòu)象和催化活性，同時酶不易泄漏出來，所以該酶電極具有較高的穩(wěn)定性。


圖1為本發(fā)明的實施例1的甲基纖維素水凝膠包埋血紅蛋白的原子力顯微形貌圖。
圖2為本發(fā)明的血紅蛋白、肌紅蛋白、辣根過氧物酶和過氧化氫酶修飾電極的循環(huán)伏安圖。
圖3為本發(fā)明實施例1的血紅蛋白修飾電極檢測亞硝酸根的循環(huán)伏安圖。
圖4為本發(fā)明實施例3的辣根過氧化物酶修飾電極檢測雙氧水的循環(huán)伏安圖。
具體實施例方式
實施例1制備血紅蛋白修飾電極。0.2g甲基纖維素(KGM)溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.2％的水凝膠，將甲基纖維素水凝膠和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(KGM∶DMF＝4∶1)，與血紅蛋白溶液(1.34×10-4M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準(zhǔn)確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測一氧化氮，過氧化物和氯代乙烷，測量范圍寬。
實施例2制備肌紅蛋白修飾電極。0.2g甲基纖維素溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.2％的水凝膠，將甲基纖維素水凝膠和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(KGM∶DMF＝4∶1)，與肌紅蛋白溶液(2.04×10-5M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準(zhǔn)確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測一氧化氮，過氧化物和氯代乙烷，測量范圍寬。
實施例3制備辣根過氧化物酶修飾電極。0.2g甲基纖維素溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.2％的水凝膠，將甲基纖維素水凝膠和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(KGM∶DMF＝4∶1)，與辣根過氧化物酶溶液(7.82×10-5M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準(zhǔn)確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測過氧化物，測量范圍寬。
實施例4
制備過氧化氫酶修飾電極。0.2g甲基纖維素溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.2％的水凝膠，將甲基纖維素水凝膠和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液(KGM∶DMF＝4∶1)，與過氧化氫酶溶液(6.53×10-5M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準(zhǔn)確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測過氧化物，測量范圍寬。
實施例5制備二茂鐵為媒介體的辣根過氧化物酶修飾電極。0.2g甲基纖維素溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.2％的水凝膠。將媒介體二茂鐵溶于有機溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，濃度為0.01mol·L-1，然后將二茂鐵的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液與甲基纖維素水凝膠混合(體積比為1∶4)均勻后，再與辣根過氧化物酶溶液(7.82×10-5M)等體積混合。取10μl混合溶液滴涂在裂解石墨電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約8小時。該電極具有優(yōu)異的性能，響應(yīng)時間快(30秒)；使用壽命長(30天)；準(zhǔn)確度高(＜5％)；精密度好(＜5‰)在水相、含水有機相和有機相中，能檢測過氧化物，測量范圍寬。
圖2中，肌紅蛋白(a)、血紅蛋白(b)、辣根過氧物酶(c)、過氧化氫酶(d)和甲基纖維素(e)。橫坐標(biāo)為相對于飽和甘汞電極(SCE)的電位(E)，單位為V，縱坐標(biāo)為電流(I)，單位為微安(μA)。
圖3中，亞硝酸根的濃度(μM)分別為(a)0，(b)8.48，(c)16.82，(d)33.10，(e)48.86。橫坐標(biāo)為相對于飽和甘汞電極(SCE)的電位(E)，單位為V，縱坐標(biāo)為電流(I)，單位為微安(μA)。
圖4中，雙氧水的濃度(μM)分別為(a)0，(b)15.6，(c)30.2，(d)44.6。橫坐標(biāo)為相對于飽和甘汞電極(SCE)的電位(E)，單位為V，縱坐標(biāo)為電流(I)，單位為微安(μA)。
本發(fā)明利用甲基纖維素水凝膠將血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶和辣根過氧化物酶固定在玻碳電極表面，形成穩(wěn)定的血紅素蛋白質(zhì)-甲基纖維素膜修飾電極。在甲基纖維素膜中，血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶和辣根過氧化物酶等血紅素蛋白質(zhì)直接與電極之間傳遞電子。
在水凝膠之中加入適量的二甲基甲酰胺，增強了甲基纖維素水凝膠的凝膠化過程，將蛋白質(zhì)牢固地固定在電極表面，而且能促進蛋白質(zhì)與電極之間的電子傳遞。
電極表面的血紅素蛋白質(zhì)在水溶液中能電催化還原O2、H2O2和NO。穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-甲基纖維素修飾電極應(yīng)用于H2O2、NO和NO2-的定量測定。
血紅素蛋白質(zhì)-甲基纖維素修飾電極在乙醇、DMSO和DMF等親水性有機溶劑與水的混合溶液中，也表現(xiàn)出直接電化學(xué)和催化活性，表明有機溶劑并沒有較大地影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其催化功能，說明甲基纖維素水凝膠中含水空腔在保持蛋白質(zhì)構(gòu)象和活性諸方面起了重要的作用。蛋白質(zhì)-甲基纖維素膜修飾電極能快速地催化還原O2、有機過氧化物和NO，也能催化氯代乙烷脫氯，可用于這些物質(zhì)的定量檢測。
本發(fā)明的修飾電極還包括以下應(yīng)用(1)在水溶液中，血紅素蛋白質(zhì)-甲基纖維素修飾電極催化還原H2O2和NO，用于這些物質(zhì)的定量檢測；(2)在乙醇/水的混合溶液中，血紅素蛋白質(zhì)-甲基纖維素修飾電極催化還原NO、有機過氧化物和氯代乙烷，用于這些物質(zhì)的定量檢測。
(3)在水溶液中和乙醇/水的混合溶液中，血紅素蛋白質(zhì)-甲基纖維素修飾電極能催化還原氧氣，作為生物燃料電池的正極。
權(quán)利要求
1.一種甲基纖維素水凝膠固定化酶電極，其特征在于將甲基纖維素溶解于沸水中配制成甲基纖維素水凝膠，將甲基纖維素水凝膠與有機溶劑混合后，再與酶溶液混合制得混合溶液，將此混合溶液滴涂在電極基底表面，室溫干燥，得到甲基纖維素固定化酶電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極，其特征在于所述有機溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、甘油、吡啶或環(huán)己烷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極，其特征在于所述酶是血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶、過氧化氫酶、酪氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶或乙醇脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極，其特征在于在所述有機溶劑中加入媒介體，媒介體為二茂鐵及其衍生物；鋨、釕有機配合物；醌類或有機染料。
5.一種權(quán)利要求1所述的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極的制備方法，其特征在于將0.1～0.6克甲基纖維素溶解于100mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成甲基纖維素水凝膠；將有機溶劑與上述甲基纖維素水凝膠按1∶3～1∶6體積比混合后，再與酶溶液等體積均勻混合；將此混合溶液滴涂在電極表面，室溫干燥，得到甲基纖維素固定化酶電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極的制備方法，其特征在于在所述有機溶劑中加入媒介體得含有媒介體有機溶劑，將含有濃度為0.01mol·L-1媒介體的有機溶劑與甲基纖維素水凝膠按1∶3～1∶6體積比混合后，再與酶溶液等體積均勻混合；將此混合溶液滴涂在電極表面，室溫干燥，得到含媒介體的甲基纖維素固定化酶電極。
7.一種權(quán)利要求1所述的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極在水溶液中催化還原H2O2、NO和NO2-，及其定量檢測這些物質(zhì)中的應(yīng)用。
8.一種權(quán)利要求1所述的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極在乙醇/水的混合溶液中催化還原NO、有機過氧化物和氯代乙烷，及其定量檢測這些物質(zhì)中的應(yīng)用。
9.一種權(quán)利要求1所述的甲基纖維素水凝膠固定化酶電極在水溶液中和乙醇/水的混合溶液中，催化還原氧氣，作為生物燃料電池的正極的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種甲基纖維素水凝膠固定化酶電極及其制備方法和應(yīng)用。將甲基纖維素0.1～0.6克溶解于100mL沸水中配制成甲基纖維素水凝膠，將甲基纖維素水凝膠與有機溶劑混合后，再與酶溶液混合制得混合溶液，將此混合溶液滴涂在電極基底表面，室溫干燥，得到甲基纖維素固定化酶電極。本發(fā)明利用甲基纖維素的特性和良好的生物親和性，制備甲基纖維素固定化酶電極。本發(fā)明制備的酶電極使用范圍廣，在水相、含水有機相和有機相中均能使用且均具有生物催化活性。該酶電極響應(yīng)快，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，使用壽命長，準(zhǔn)確度高，精密度好，測量范圍寬。
文檔編號C12N11/04GK1885021SQ200610019468
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月25日
發(fā)明者劉慧宏 申請人:襄樊學(xué)院