專利名稱：一種口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置及其形成口腔生物膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置及其形成口腔生物膜的方法，屬于生物膜口腔醫(yī)療模型器械或者口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
作為單細(xì)胞的生命形式，細(xì)菌在長期以來的研究中始終以游離于液體培養(yǎng)基中的單細(xì)胞狀態(tài)作為研究對(duì)象，這樣在最大程度上簡化了外界環(huán)境的影響，也獲得了大量的研究成果，為現(xiàn)代微生物學(xué)奠定了基礎(chǔ)。然而在自然狀態(tài)下，細(xì)菌很少以這種游離于純培養(yǎng)中的形式而存在。生物膜是細(xì)菌最常見的生存形式，是指在固態(tài)的有機(jī)或無機(jī)介質(zhì)表面，大量微生物集聚于胞外多糖構(gòu)成的基質(zhì)內(nèi)并互相交聯(lián)而形成的微生物生態(tài)環(huán)境。
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，生物膜病占據(jù)了80％以上的微生物感染性疾病。生物膜通過其理化屏障的作用，給致病菌提供了抵御外部刺激的優(yōu)良生態(tài)環(huán)境，而在其中發(fā)展的基因傳導(dǎo)與接合，也有利于不同微生物間對(duì)耐藥基因的水平傳遞從而對(duì)傳統(tǒng)的抗生素療法造成很大的困難。危害人類口腔健康的主要疾病齲病，其主要致病因素也是以變形鏈球菌為主構(gòu)成的致齲性生物膜(牙菌斑)。
在齲病的細(xì)菌學(xué)研究中，由于口腔生態(tài)環(huán)境的復(fù)雜性，要在體內(nèi)研究某種或某些細(xì)菌與齲病的關(guān)系是非常困難的，因此，建立起能模擬口內(nèi)環(huán)境的口腔生物膜模型，有利于在體外進(jìn)行高可信度的口腔微生物學(xué)研究，獲得比傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)更加準(zhǔn)確和全面的結(jié)果。生物膜模型能在體外創(chuàng)造一種與體內(nèi)近似的生態(tài)環(huán)境，調(diào)控細(xì)菌的生長代謝條件，使之既具有與天然環(huán)境的一致性，又具有標(biāo)準(zhǔn)化和可調(diào)控性的顯著優(yōu)點(diǎn)，用生物膜模型來進(jìn)行口腔生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與簡單的體外實(shí)驗(yàn)相比，可信度更高，可重復(fù)性更好，是一種很有潛力的實(shí)驗(yàn)手段。
生物膜模型系統(tǒng)主要目的在于盡可能地模擬出口腔內(nèi)生態(tài)環(huán)境，以及將這一人工環(huán)境維持于穩(wěn)定的狀態(tài)。目前國內(nèi)劉正等報(bào)道的相關(guān)生物膜模型(中華口腔醫(yī)學(xué)雜志.1996；31(2)110-112.)僅為簡易的恒化器細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)，雖能滿足基本的微生物連續(xù)培養(yǎng)要求，但其結(jié)構(gòu)龐雜，核心部件為發(fā)酵罐連續(xù)靜態(tài)培養(yǎng)，仍不能有效模擬出口腔內(nèi)部唾液等營養(yǎng)液持續(xù)不斷的流動(dòng)環(huán)境，且對(duì)于污染的控制欠佳；而國外的同類產(chǎn)品，如Sissons等于Journal of Dental Research，1991，70(11)1409-16報(bào)道多工作站人工口腔系統(tǒng)(MAM)與Kinniment等建立的恒厚生物膜模型(Microbiology，1996，142，631-638)，盡管對(duì)環(huán)境條件的控制精度高，但其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)外圍設(shè)備的精度要求相應(yīng)也高，故其價(jià)格昂貴，應(yīng)用成本居高不下，盡管對(duì)口腔環(huán)境模擬良好但仍無法獲得推廣應(yīng)用。
本發(fā)明者在前期研究中建立了由變形鏈球菌、血液鏈球菌、唾液鏈球菌、內(nèi)氏放線菌等組成的多菌系生物膜模型，中國專利03135320.7題為《口腔生物膜模型裝置及其口腔生物膜形成的方法》，實(shí)驗(yàn)證明該模型具有較好的可靠性與可重復(fù)性，能夠用于對(duì)口腔生物膜的各項(xiàng)體外研究。然而，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中我們也發(fā)現(xiàn)該模型也存在一些缺陷，首先，該生物膜模型僅能對(duì)模型中特定并唯一時(shí)間點(diǎn)的生物膜形成狀況進(jìn)行觀察，所得數(shù)據(jù)有限，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)性生物膜形成過程的全程實(shí)時(shí)檢測(cè)。其次是該模型的核心部件恒流培養(yǎng)室為不規(guī)則外形，難以作到標(biāo)準(zhǔn)化，在實(shí)驗(yàn)中難以控制各恒流培養(yǎng)室的清除率達(dá)到一致，使得各恒流培養(yǎng)室難以作到真正意義的平行可比。因此，本發(fā)明者對(duì)已有生物膜模型的恒流培養(yǎng)室進(jìn)行了一定的改造，改用標(biāo)準(zhǔn)外形的器件，并根據(jù)需要在其頂部設(shè)置了多個(gè)開口，可以放置多個(gè)固定標(biāo)本的加樣器，同時(shí)也可以安裝多種檢測(cè)裝置(如pH記錄儀，氧化還原電勢(shì)記錄儀)的探頭。在此基礎(chǔ)之上開發(fā)出了一種口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置及形成口腔生物膜的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人工菌斑生物膜的連續(xù)實(shí)時(shí)檢測(cè)，得到了大量有意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為齲病的病因和發(fā)病機(jī)制、篩選防齲藥物、評(píng)估藥物防齲效能和研究藥物作用機(jī)制提供了有力的技術(shù)平臺(tái)，經(jīng)檢索未見有類似的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種可以對(duì)人工菌斑生物膜進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)的口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置及其形成口腔生物膜的方法，其特點(diǎn)是將多個(gè)羥磷灰石片(HA Discs)置于含有定量實(shí)驗(yàn)菌株的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中，定時(shí)給以蔗糖溶液以提供實(shí)驗(yàn)細(xì)菌無氧酵解所需的底物，使細(xì)菌在羥磷灰石表面形成實(shí)驗(yàn)性生物膜即人工菌斑，然后在生物膜形成過程中的不同時(shí)期取出羥磷灰石片，檢測(cè)其表面形成生物膜的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)，以對(duì)實(shí)驗(yàn)性生物膜的形成過程進(jìn)行全面的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)各種防齲藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)性生物膜及齲病形成的全程實(shí)時(shí)檢測(cè)，進(jìn)而確定防齲藥物的作用效果和作用機(jī)制。
本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置含有堿液罐、培養(yǎng)基罐、發(fā)酵罐、恒流培養(yǎng)室和加樣瓶。其中恒流培養(yǎng)室為多個(gè)豎式標(biāo)準(zhǔn)圓柱形培養(yǎng)室串聯(lián)連接，堿液罐通過蠕動(dòng)泵與發(fā)酵罐連接，培養(yǎng)基罐通過蠕動(dòng)泵與發(fā)酵罐連接，發(fā)酵罐通過過濾器和蠕動(dòng)泵引入惰性氣體N2和CO2，發(fā)酵罐通過蠕動(dòng)泵和過濾器向外排出廢液、廢氣，發(fā)酵罐通過蠕動(dòng)泵和恒流培養(yǎng)室連接，每個(gè)恒流培養(yǎng)室通過蠕動(dòng)泵和過濾器向外排出廢液、廢氣，培養(yǎng)基罐和加樣瓶分別通過蠕動(dòng)泵與多個(gè)恒流培養(yǎng)室連接。
發(fā)酵罐為夾層，夾層內(nèi)設(shè)循化水浴進(jìn)口和出口，罐內(nèi)置pH控制電極，發(fā)酵罐置于電磁攪拌器上。
恒流培養(yǎng)室為豎式標(biāo)準(zhǔn)圓柱形，恒流培養(yǎng)室頂部設(shè)有多個(gè)加樣器，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求在多個(gè)加樣器上放置多個(gè)固定標(biāo)本，固定標(biāo)本為羥磷灰石，加樣器垂直放置于恒流培養(yǎng)室內(nèi)部，恒流培養(yǎng)室內(nèi)設(shè)多通道pH記錄儀電極和廢液、廢氣排出口，恒流培養(yǎng)室放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育，由電磁攪拌器提供30rpm左右的攪拌速度以模擬口腔環(huán)境內(nèi)唾液流動(dòng)的動(dòng)態(tài)環(huán)境。
羥磷灰石片由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室材料研究室提供。
口腔生物膜的形成方法1、動(dòng)態(tài)模型裝置無菌連接完成之后，將發(fā)酵罐置于電磁攪拌器上，獲得30-100ppm的攪拌速度，溫度由循環(huán)水浴箱維持在37℃左右，堿液罐提供堿性溶液使發(fā)酵罐內(nèi)菌懸液的液相pH值維持在7.0左右，堿性溶液的加入由pH控制器和蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)，待各菌生長穩(wěn)定后備用。
2、培養(yǎng)基罐內(nèi)盛有人工唾液培養(yǎng)基BM-5作為實(shí)驗(yàn)菌的主要營養(yǎng)來源，由蠕動(dòng)泵向發(fā)酵罐和恒流培養(yǎng)室內(nèi)恒速加入。
3、加樣瓶內(nèi)盛有防齲藥物和蔗糖溶液，由分配器和蠕動(dòng)泵控制向恒流培養(yǎng)室內(nèi)加入，以提供實(shí)驗(yàn)生物膜致齲的底物蔗糖以及所研究的防齲藥物，根據(jù)研究目的可以采用不同的藥物和藥物濃度。
4、恒流培養(yǎng)室置于密封的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，由電磁攪拌器提供30ppm左右的攪拌速度以模擬口腔環(huán)境內(nèi)唾液流動(dòng)的動(dòng)態(tài)環(huán)境。
5、根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，在恒流培養(yǎng)室內(nèi)放置多個(gè)加樣器，在實(shí)驗(yàn)過程中，按照要求的時(shí)間間隔，連續(xù)取出加樣器，檢測(cè)加樣器上羥磷灰石表面形成的生物膜的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)，直到全部加樣器取盡為止，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)性生物膜形成過程的縱向連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、能有效模擬口內(nèi)生態(tài)環(huán)境并穩(wěn)定地形成實(shí)驗(yàn)性生物膜，已通過大量研究驗(yàn)證了其在齲病學(xué)與口腔材料學(xué)的應(yīng)用效能。
2、采用多通道并聯(lián)培養(yǎng)技術(shù)，能同時(shí)比較不同生物膜處理措施的差別，也極大地簡化了工作流程，更便于使用。
3、可以在實(shí)驗(yàn)過程中的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)取出標(biāo)本，檢測(cè)標(biāo)本表面生物膜的形成狀況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置標(biāo)本的數(shù)量，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)性生物膜的全程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
4、選用的主要設(shè)備均為市場(chǎng)上常用產(chǎn)品，成本控制良好，與國際同類產(chǎn)品比較，具有相當(dāng)好的價(jià)格優(yōu)勢(shì)。
5、采用密閉培養(yǎng)方式從而有效地控制了污染在模型內(nèi)的發(fā)生。
四

圖1為口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置示意圖1、堿液罐2、培養(yǎng)基罐3、發(fā)酵罐4、豎式標(biāo)準(zhǔn)圓柱形恒流培養(yǎng)室5、羥磷灰石片6、加樣器7、加樣瓶8、電磁攪拌器9、恒溫水浴箱10、多通道pH測(cè)量儀11、電磁攪拌器12、廢液出口13、廢氣出口P1-P7為蠕動(dòng)泵F1-F3為濾器圖2為豎式標(biāo)準(zhǔn)圓柱形恒流培養(yǎng)室結(jié)構(gòu)示意3為恒流培養(yǎng)室液相各處理組pH的動(dòng)態(tài)變化圖4為不同時(shí)間各處理組羥磷灰石表面生物膜各菌生長曲線a、不同時(shí)間處理組HAdisc表面生物膜S.mutans生長曲線b、不同時(shí)間處理組HAdisc表面生物膜S.sanguis生長曲線c、不同時(shí)間處理組HAdisc表面生物膜A.naeslundii生長曲線d、不同時(shí)間處理組HAdisc表面生物膜L.rhamnosusi生長曲線圖5為不同時(shí)間各處理組羥磷灰石表面生物膜各菌構(gòu)成圖a、不同時(shí)間25mM蔗糖組HAdisc表面生物膜細(xì)菌計(jì)數(shù)b、不同時(shí)間4000ppm五倍子組HAdisc表面生物膜細(xì)菌計(jì)數(shù)c、不同時(shí)間蒸餾水組HAdisc表面生物膜細(xì)菌計(jì)數(shù)圖6為實(shí)驗(yàn)組生物膜形態(tài)的熒光顯微鏡觀FM×200A24小時(shí)，B48小時(shí)，C72小時(shí)，D96小時(shí)，E120小時(shí)圖7為陰性對(duì)照組生物膜形態(tài)的熒光顯微鏡觀FM×200A24小時(shí)，B48小時(shí)，C72小時(shí)，D96小時(shí)，E120小時(shí)圖8為空白組生物膜形態(tài)的熒光顯微鏡觀FM×200A24小時(shí)，B48小時(shí)，C72小時(shí)，D96小時(shí)，E120小時(shí)五具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
實(shí)施例口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置如圖1-2所示，含有堿液罐1、培養(yǎng)基罐2、發(fā)酵罐3、恒流培養(yǎng)室4和加樣瓶7。堿液罐1通過蠕動(dòng)泵P1與發(fā)酵罐3連接，其中，恒流培養(yǎng)室為多個(gè)豎式標(biāo)準(zhǔn)圓柱形恒流培養(yǎng)室串聯(lián)連接。培養(yǎng)基罐2通過蠕動(dòng)泵P2與發(fā)酵罐3連接，發(fā)酵罐3通過濾器F2和蠕動(dòng)泵P4引入惰性氣體N2和CO2，發(fā)酵罐3通過蠕動(dòng)泵P5和濾器F1排出廢液、廢氣，發(fā)酵罐3通過蠕動(dòng)泵P6與多個(gè)并聯(lián)恒流培養(yǎng)室4連接，每個(gè)恒流培養(yǎng)室4通過蠕動(dòng)泵P7和過濾器F3向外排出廢液、廢氣，培養(yǎng)基罐2和加樣瓶7分別通過蠕動(dòng)泵P2、P3與多個(gè)恒流培養(yǎng)室4并聯(lián)連接。發(fā)酵罐3通過循環(huán)水浴保持罐內(nèi)溫度為37℃，罐內(nèi)放置pH控制器，維持液相pH值在7.0左右，發(fā)酵罐3置于電磁攪拌器8上。每個(gè)恒流培養(yǎng)室4內(nèi)垂直放置有多個(gè)加樣器6，每個(gè)加樣器6上固定有羥磷灰石片5，恒流培養(yǎng)室4內(nèi)同時(shí)安裝有多通道pH測(cè)量記錄儀電極10和廢液排出口12、廢氣排出口13，恒流培養(yǎng)室4放置于恒溫培養(yǎng)箱9內(nèi)37℃恒溫孵育，由電磁攪拌器11提供30rpm左右的攪拌速度模擬口腔環(huán)境內(nèi)唾液的流動(dòng)循環(huán)。恒流培養(yǎng)室和加樣器可用玻璃、塑料或金屬制作。羥磷灰石片由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室材料研究室制作提供。
口腔生物膜的形成方法1、動(dòng)態(tài)模型裝置無菌連接完成之后，將發(fā)酵罐3置于電磁攪拌器8上，獲得30-100ppm的攪拌速度，溫度由循環(huán)水浴箱維持在37℃左右，堿液罐1提供堿性溶液使發(fā)酵罐內(nèi)菌懸液的液相pH值維持在7.0左右，堿性溶液的加入由pH控制器和蠕動(dòng)泵P1調(diào)節(jié)，待各菌生長穩(wěn)定后備用。
2、培養(yǎng)基罐2內(nèi)盛有人工唾液培養(yǎng)基BM-5作為實(shí)驗(yàn)菌的主要營養(yǎng)來源，由蠕動(dòng)泵P2向發(fā)酵罐3和每個(gè)恒流培養(yǎng)室4內(nèi)恒速加入。
3、加樣瓶7內(nèi)盛有防齲藥物和蔗糖溶液，由分配器和蠕動(dòng)泵P3控制向每個(gè)恒流培養(yǎng)室4內(nèi)加入，以提供實(shí)驗(yàn)生物膜致齲的底物蔗糖以及所研究的防齲藥物，根據(jù)研究目的可以采用不同的藥物和藥物濃度。
4、恒流培養(yǎng)室4置于密封的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，由電磁攪拌器11提供30ppm左右的攪拌速度以模擬口腔環(huán)境內(nèi)唾液流動(dòng)的動(dòng)態(tài)環(huán)境。
5、根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，在恒流培養(yǎng)室內(nèi)放置多個(gè)加樣器6，在實(shí)驗(yàn)過程中，按照要求的時(shí)間間隔，連續(xù)取出加樣器6，檢測(cè)加樣器上羥磷灰石5表面形成的生物膜的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)，直到全部加樣器取盡為止，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)性生物膜形成過程的縱向連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
以下為本模型裝置在齲病學(xué)研究中的應(yīng)用實(shí)例1.實(shí)驗(yàn)菌株變形鏈球菌 Streptococcus mutans ATCC 25175
血鏈球菌Streptococcus sanguis ATCC 10556內(nèi)氏放線菌 Actinomyces naeslundii WVU 627乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus AC 413以上菌株均由華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
2.培養(yǎng)條件2.1發(fā)酵罐培養(yǎng)條件溫度37℃由循環(huán)水浴箱維持；攪拌低速，由磁力攪拌器8控制，使發(fā)酵罐中菌懸液混勻；厭氧環(huán)境95％N2，5％CO2，流速10ml/min，由蠕動(dòng)泵P4控制；pH用0.1N NaOH溶液維持在0.7左右，由Ph控制儀與蠕動(dòng)泵P1調(diào)節(jié)；清除濾D＝0.1/hr由蠕動(dòng)泵P5控制。
2.2恒流培養(yǎng)室培養(yǎng)條件溫度37℃由循環(huán)水浴箱維持?jǐn)嚢璧退?，由磁力攪拌?1控制，提供生物膜形成過程中需要的剪切力清除率D＝0.75/hr由蠕動(dòng)泵P7控制給樣恒流培養(yǎng)室內(nèi)各實(shí)驗(yàn)菌生長達(dá)到穩(wěn)定后，每12小時(shí)給樣1次，每次給樣量為生物膜連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)總?cè)莘e的1/10，加樣由蠕動(dòng)泵P3及分配器控制。
3.實(shí)驗(yàn)流程本實(shí)驗(yàn)為模擬牙齒表面菌斑生物膜的形成，采用羥磷灰石片(HA Discs)置于含有實(shí)驗(yàn)混合菌株的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中，以在其表面形成多菌系生物膜。模型中的發(fā)酵罐為實(shí)驗(yàn)混合菌的儲(chǔ)庫，而與發(fā)酵罐相連的數(shù)個(gè)平行的恒流培養(yǎng)室為實(shí)驗(yàn)生物膜形成的場(chǎng)所。
實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將在TPY固體培養(yǎng)基中復(fù)蘇的變形鏈球菌、乳酸桿菌、血鏈球菌與內(nèi)氏放線菌傳代，經(jīng)過生化鑒定后接種到發(fā)酵罐的人工唾液培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，其pH值由pH控制器控制平衡，新鮮人工唾液培養(yǎng)基由蠕動(dòng)泵連續(xù)加入?；A(chǔ)連續(xù)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定之后，將發(fā)酵罐中的混合菌懸液通過蠕動(dòng)泵加入到各個(gè)平行的恒流培養(yǎng)室中，同時(shí)向各恒流培養(yǎng)室中加入新鮮的人工唾液培養(yǎng)基，細(xì)菌與新鮮培養(yǎng)基的比例為1∶9(v/v)，24小時(shí)后停止接種細(xì)菌，繼續(xù)加入新鮮人工唾液至各恒流培養(yǎng)室中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。每日對(duì)恒流培養(yǎng)室液相環(huán)境中的細(xì)菌進(jìn)行生長檢測(cè)，待各恒流培養(yǎng)室中的混合菌連續(xù)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定之后(連續(xù)三日無顯著差異)，在各恒流培養(yǎng)室中插入多個(gè)固定有HA Discs的加樣器，使HA Discs完全浸入混合菌懸液中，同時(shí)將處理溶液加入恒流培養(yǎng)室中(1次/12小時(shí)，每次加入體積為恒流培養(yǎng)室溶液體積的1/10)，此后，按照24小時(shí)的時(shí)間間隔連續(xù)從恒流培養(yǎng)室中取出一個(gè)加樣器，對(duì)HA Discs表面形成的生物膜進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)、結(jié)構(gòu)觀察，直至恒流培養(yǎng)室中的加樣器取盡為止。
4.人工唾液本實(shí)驗(yàn)采用的人工唾液配方為生物膜改良培養(yǎng)基BM-5III型豬胃粘蛋白(Hog gastric mucin，Type III，Sigma) 2.50g/l肽胨(Proteose peptone，F(xiàn)luka) 2.00g/l胰酶分解酪蛋白胨(Peptone from casein，tryptic digest，F(xiàn)luka) 1.00g/l酵母提取物(Yeast extract，Oxoid) 1.00g/l氯化鉀(KCl) 2.50g/l葡萄糖(Glucose) 0.50g/l胱氨酸鹽酸鹽(Cystiene-Hydrochloride，Sigma) 0.10g/l氯化血紅素(Heamin，上海東風(fēng)生化技術(shù)公司) 1.00mg/l四川大學(xué)博士學(xué)位論文14磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O) 0.114g/l磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.20g/l以1N NaOH溶液調(diào)整其pH值為7.5，121℃，15psi，消毒70min。
5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例本例為研究天然藥物五倍子對(duì)實(shí)驗(yàn)生物膜的影響A實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)對(duì)恒流培養(yǎng)室中加樣的不同，分為以下各組陰性對(duì)照組25mM蔗糖溶液，加入恒流培養(yǎng)室中的終濃度為2.5mM。
空白對(duì)照組不含任何糖類的蒸餾水作為空白對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)組含4mg/ml的五倍子提取物的25mM蔗糖溶液，加入恒流培養(yǎng)后藥物終濃度為0.4mg/ml。
B恒流培養(yǎng)室液相各處理組pH的動(dòng)態(tài)變化如圖3所示，在8次加藥的過程中，陽性對(duì)照組加入濃度為25mmol/L的蔗糖溶液后pH值出現(xiàn)了周期性波動(dòng)，在3個(gè)小時(shí)左右達(dá)到最低點(diǎn)，最低pH下降至4.5以下，隨著時(shí)間的推移，pH逐漸上升，大約3個(gè)小時(shí)以后恢復(fù)到加糖前的水平。在實(shí)驗(yàn)組，同樣反映出相似的pH變化規(guī)律。隨著五倍子的加入，pH出現(xiàn)緩慢下降，于3小時(shí)左右達(dá)到最低點(diǎn)，隨后緩慢上升，6小時(shí)后恢復(fù)到加藥前的水平，約pH7.0左右。整個(gè)連續(xù)培養(yǎng)過程中，蒸餾水組pH未見明顯波動(dòng)，維持在pH7.5左右。
C恒流培養(yǎng)室中HAdic表面實(shí)驗(yàn)生物膜活菌計(jì)數(shù)在生物膜培養(yǎng)周期內(nèi)，不同藥物處理對(duì)不同時(shí)間，不同種類的生物膜細(xì)菌定植的影響不同。五倍子組表現(xiàn)出同蒸餾水組和蔗糖組相似的細(xì)菌定植穩(wěn)定期(約72小時(shí))，24小時(shí)生物膜細(xì)菌計(jì)數(shù)和120小時(shí)生物膜細(xì)菌計(jì)數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)，對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株而言，五倍子組表現(xiàn)出對(duì)乳酸桿菌明顯的抑制作用，整個(gè)培養(yǎng)周期其細(xì)菌計(jì)數(shù)均較低，對(duì)變形鏈球菌也有一定的抑制，對(duì)內(nèi)氏放線菌、血液鏈球菌抑制不明顯。對(duì)120小時(shí)生物膜，五倍子組與蔗糖組相比，乳酸桿菌被明顯抑制(P＜0.05)，變形鏈球菌也在一定程度上被抑制，內(nèi)氏放線菌、血液鏈球菌抑制不明顯。對(duì)生物膜細(xì)菌構(gòu)成，雖然各實(shí)驗(yàn)菌在生物膜黏附數(shù)量上有著一定的差異，但各組在細(xì)菌構(gòu)成上未見有顯著變化(P＞0.05)。
D各處理組實(shí)驗(yàn)生物膜形態(tài)的熒光顯微鏡觀察生物膜的FM觀察發(fā)現(xiàn)，隨著連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組生物膜均表現(xiàn)出細(xì)菌及胞外多糖基質(zhì)的增加，但各處理組表現(xiàn)為完全不同的生物膜形態(tài)外觀。同蔗糖組相比，即使在120小時(shí)生物膜，五倍子組也未見大量成團(tuán)、成片的致密細(xì)菌多糖基質(zhì)團(tuán)塊，生物膜呈現(xiàn)較為疏松的外觀。
權(quán)利要求
1.一種口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置，含有堿液罐(1)、培養(yǎng)基罐(2)、發(fā)酵罐(3)、恒流培養(yǎng)室(4)和加樣瓶(7)，其特征在于恒流培養(yǎng)室(4)為多個(gè)豎式標(biāo)準(zhǔn)圓柱形培養(yǎng)室串聯(lián)連接，堿液罐(1)通過蠕動(dòng)泵P1與發(fā)酵罐(3)連接，培養(yǎng)基罐(2)通過蠕動(dòng)泵P2與發(fā)酵罐(3)連接，發(fā)酵罐(3)通過過濾器F2和蠕動(dòng)泵引入惰性氣體N2和CO2，發(fā)酵罐(3)通過蠕動(dòng)泵P5和過濾器F1向外排出廢液、廢氣，發(fā)酵罐(3)通過蠕動(dòng)泵P6和恒流培養(yǎng)室(4)連接，每個(gè)恒流培養(yǎng)室(4)通過蠕動(dòng)泵P7和過濾器F3向外排出廢液、廢氣，培養(yǎng)基罐(2)和加樣瓶(7)分別通過蠕動(dòng)泵P2、P3與多個(gè)恒流培養(yǎng)室(4)并聯(lián)連接。
2.如權(quán)力要求1所述口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置，其特征在于發(fā)酵罐(3)為夾層，夾層內(nèi)設(shè)循環(huán)水浴進(jìn)口和出口，罐內(nèi)置pH控制電極，發(fā)酵罐(3)置于電磁攪拌器(8)上。
3.如權(quán)力要求1所述口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置，其特征在于恒流培養(yǎng)室(4)為豎式標(biāo)準(zhǔn)圓柱形，每個(gè)恒流培養(yǎng)室(4)的頂部設(shè)有多個(gè)加樣器(6)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求可在多個(gè)加樣器上放置多個(gè)固定標(biāo)本，固定標(biāo)本為羥基磷灰石，加樣器(6)垂直放置于恒流培養(yǎng)室(4)內(nèi)部，恒流培養(yǎng)室(4)內(nèi)設(shè)多通道pH記錄儀(10)電極，廢液排出口(12)、廢氣排出口(13)，恒流培養(yǎng)室(4)放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育，由電磁攪拌器(11)提供30rpm左右的攪拌速度以模擬口腔環(huán)境內(nèi)唾液的動(dòng)態(tài)流動(dòng)環(huán)境。
4.如權(quán)力要求1～3之所述口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置形成口腔生物膜的方法，其特征在于該方法含有以下步驟1)動(dòng)態(tài)模型裝置連接完成之后，將發(fā)酵罐(3)置于電磁攪拌器(8)上，獲得30～100rpm的轉(zhuǎn)速，溫度由循環(huán)水浴保持在37℃左右，堿液罐(1)提供堿液使發(fā)酵罐內(nèi)的pH＝7.0左右，由pH控制器和蠕動(dòng)泵P1調(diào)節(jié)，待各菌生長穩(wěn)定后備用。2)培養(yǎng)基罐(2)內(nèi)盛有人工唾液培養(yǎng)基BM-5，作為實(shí)驗(yàn)菌的主要營養(yǎng)來源，由蠕動(dòng)泵P2向發(fā)酵罐(3)和每個(gè)恒流培養(yǎng)室(4)內(nèi)恒速加入。3)加樣瓶(7)內(nèi)盛有藥物和蔗糖溶液，向每個(gè)恒流培養(yǎng)室(4)內(nèi)實(shí)驗(yàn)生物膜提供致齲的底物蔗糖以及所需研究的防齲藥物，根據(jù)研究目的的差別可采用不同的藥物和濃度。4)恒流培養(yǎng)室(4)置于密封的橫流培養(yǎng)箱內(nèi)，由電磁攪拌器(11)提供30rpm左右的攪拌速度以模擬口腔環(huán)境內(nèi)唾液流動(dòng)的動(dòng)態(tài)環(huán)境。5)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，在每個(gè)恒流培養(yǎng)室(4)內(nèi)放置多個(gè)加樣器(6)，在實(shí)驗(yàn)過程中，按照要求的時(shí)間間隔連續(xù)取出加樣器(6)，檢查加樣器(6)上羥磷灰石表面形成的生物膜的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)，直到全部加樣器(6)取盡為止，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)性生物膜形成過程的縱向連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
全文摘要
一種口腔生物膜動(dòng)態(tài)模型裝置，含有堿液罐(1)、培養(yǎng)基罐(2)、發(fā)酵罐(3)、恒流培養(yǎng)室(4)和加樣瓶(7)。其特征在于恒流培養(yǎng)室(4)為多個(gè)豎式標(biāo)準(zhǔn)圓柱形恒流培養(yǎng)室串聯(lián)連接，堿液罐(1)通過蠕動(dòng)泵P1與發(fā)酵罐(3)連接，培養(yǎng)基罐(2)通過蠕動(dòng)泵P2與發(fā)酵罐(3)連接，發(fā)酵罐(3)通過過濾器F2和蠕動(dòng)泵P4引入惰性氣體N
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1858200SQ200610020608
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者周學(xué)東, 朱昞, 李繼遙, 郝玉慶, 趙今 申請(qǐng)人:四川大學(xué)