專利名稱:一種新型固定化胰蛋白酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種胰蛋白酶,尤其是一種新型固定化胰蛋白酶及其制備方法,屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
隨著生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大,作為催化劑的胰蛋白酶在工業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛。胰蛋白酶屬于水溶性蛋白質(zhì),在溶解狀態(tài)下與底物溶液形成的均相反應(yīng)體系中表現(xiàn)出高的催化活性。但是該酶在溶液中穩(wěn)定性差,容易發(fā)生自消化反應(yīng),且以溶液狀態(tài)使用只能是一次性的,導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加,因而應(yīng)用受到一定限制。為了解決胰蛋白酶在工業(yè)上的應(yīng)用難題,可以將其制備成為固定化酶使用。胰蛋白酶制備成為固定化酶后,具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)酶制成固定化酶后,抑制了酶的自消化現(xiàn)象,減少了副反應(yīng);(2)在酶反應(yīng)完成以后,通過離心、過濾等簡單方法就能將酶與產(chǎn)物分離;(3)固定化酶在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性好,失活和變性少;(4)固定化酶便于回收和重復(fù)利用,降低了生產(chǎn)成本。
目前已經(jīng)公開的固定化胰蛋白酶的制備方法較多,例如《華西藥學(xué)雜志》2003(3),176~178報(bào)道孫曉豐等將殼聚糖涂布在硅膠上制成載體,以戊二醛為交聯(lián)劑,通過交聯(lián)作用將胰蛋白酶固定在載體上制得固定化胰蛋白酶;《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2000(2),154~155,211報(bào)道陳輝等以戊二醛交聯(lián)的網(wǎng)狀殼聚糖為載體,通過交聯(lián)作用制備得到固定化胰蛋白酶;《生物技術(shù)》2005(4),56~58報(bào)道溫燕梅等利用磁性聚乙二醇為載體,戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化胰蛋白酶;《南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》1989(2),49~53報(bào)道唐梓進(jìn)等采用水合氧化鈦鰲合法固定胰蛋白酶;《武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》1999(2),203~206報(bào)道了王樂勤等使用硅烷化磁鐵粉固定胰蛋白酶的研究;《生物化學(xué)雜志》1991(3),339~343報(bào)道了葛世軍等采用聚苯乙烯陰離子交換樹脂作為載體制備固定胰蛋白酶的研究;《過程工程學(xué)報(bào)》2005(2),183~187報(bào)道了魏榮卿等提出了使用雙醛淀粉柔性固定化酶的制備方法。
以上工藝制備所得的固定化胰蛋白酶較自由的胰蛋白酶更加穩(wěn)定,且容易回收并反復(fù)利用,但是仍然存在不足。主要表現(xiàn)在(1)由于固定化胰蛋白酶是固體,因而難以同固體底物發(fā)生反應(yīng);(2)由于固定化胰蛋白酶難溶于水,在實(shí)際應(yīng)用中只能以固液非均相形式進(jìn)行反應(yīng),酶反應(yīng)催化效率大大低于自由的胰蛋白酶,因此上述方法制得的固定化胰蛋白酶在工業(yè)應(yīng)用上有一定的局限性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有固定化胰蛋白酶的缺點(diǎn),提供一種新型固定化胰蛋白酶及其制備方法。該酶在反應(yīng)時(shí)不但能夠溶解于底物溶液,而且酶促反應(yīng)完后還能被快速簡易回收。因此,本發(fā)明制備的固定化胰蛋白酶既有已知固定化酶穩(wěn)定性好,可反復(fù)利用的特點(diǎn),也有自由胰蛋白酶催化效率高,可與固體底物反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案來如下一種新型固定化胰蛋白酶,其特征在于它是利用葡聚糖衍生物合成的以如下分子式表示的化合物為載體,通過加入交聯(lián)劑和胰蛋白酶溶液,使酶與載體共價(jià)偶聯(lián)制得;所述固定化胰蛋白酶的酶活力為固定化前自由胰蛋白酶的60~85%,即活力回收為60~85%。
其中,m的取值范圍為1,2或3。
本發(fā)明所述的固定化胰蛋白酶的制備方法包括如下工藝步驟A、載體的制備取2~4g精制葡聚糖衍生物粉末,置于30~60ml的極性有機(jī)溶劑中,攪拌加熱5min后,加入濃度為10~50%的酸酐極性有機(jī)溶液,于60~85℃回流加熱4~8h;加熱完后,離心收集沉淀,用30~75%乙醇洗滌沉淀至pH近中性,再于50~70℃烘干即得載體。
所述極性有機(jī)溶劑選自乙醇、丙酮或二甲亞砜。
所述的酸酐極性有機(jī)溶液選自乙酸酐、丙二酸酐或丁二酸酐溶液。
B、固定化酶的制備取1g載體,溶于20ml緩沖液中,10~20℃攪拌10min后,向溶液中加入10ml濃度為10%的交聯(lián)劑溶液和10ml濃度為100mg/ml的胰蛋白酶溶液,10~20℃攪拌3~5h,待反應(yīng)完后,調(diào)節(jié)溶液pH至固定化酶完全析出,離心收集沉淀,即得共價(jià)偶聯(lián)的固定化胰蛋白酶。
可提及的是所述交聯(lián)劑屬于零長度交聯(lián)劑,是水溶性有機(jī)物,主要是活化氨基,催化酰胺鍵形成。
C、固定化酶的精制與回收取1g固定化胰蛋白酶,加入30ml緩沖液中,攪拌溶解,過濾收集濾液,調(diào)節(jié)濾液pH,至固定化胰蛋白酶沉淀完全析出,以上操作步驟重復(fù)三次,收集沉淀即得精制固定化胰蛋白酶;將沉淀溶于50ml緩沖液中,即得固定化酶溶液,進(jìn)行活力測定后,調(diào)節(jié)pH至固定化酶沉淀完全,離心回收固定化胰蛋白酶。
所述緩沖溶液選自濃度為200mmol/L,pH為6~9的磷酸緩沖溶液。
本發(fā)明所述的固定化胰蛋白酶酶比活力的測定方法如下(1)固定化胰蛋白酶活力的測定以苯甲酰L-精氨酸乙酯(英文縮寫為BAEE)為底物,用紫外吸收法進(jìn)行測定。固定化胰蛋白酶活力單位(U)的定義規(guī)定為以BAEE為底物反應(yīng)液,在pH8.0,25℃,反應(yīng)體積3.0ml,光徑1cm的條件下,測定ΔA253。每分鐘使ΔA253增加0.001,反應(yīng)液中所加入的酶量為一BAEE單位。
(2)蛋白質(zhì)含量測定采用Folin-酚試劑法(Lowry法)。
本發(fā)明原料易得、操作簡單,制備的固定化胰蛋白酶不但穩(wěn)定性好,可反復(fù)利用,而且能夠溶解于底物溶液中,可與固體底物反應(yīng),其催化效率高,有較好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1活力回收率測定A、取3g精制葡聚糖衍生物粉末,置于40ml無水乙醇溶液中,攪拌加熱5min后,加入濃度為30%的乙酸酐極性有機(jī)溶液,于65℃回流加熱6h。加熱完畢,離心收集沉淀,用50%乙醇洗滌沉淀至pH近中性,60℃烘干即得載體。
B、取1g載體,溶于20ml濃度為200mmol/L,pH為6~9的磷酸緩沖溶液中,10℃攪拌10min后,向溶液中加入10ml濃度為10%的交聯(lián)劑溶液和10ml濃度為100mg/ml的胰蛋白酶溶液(酶活力為3000U),10℃攪拌4h。反應(yīng)完后,調(diào)節(jié)溶液pH至固定化酶完全析出,離心收集沉淀,即得固定化胰蛋白酶。
C、取1g固定化胰蛋白酶,加入30ml濃度為200mmol/L,pH為6~9的磷酸緩沖溶液中,攪拌溶解,過濾收集濾液,調(diào)節(jié)濾液pH,至固定化胰蛋白酶沉淀完全析出。以上操作步驟重復(fù)三次,收集沉淀即得精制固定化胰蛋白酶。將沉淀溶于50ml緩沖液中,即得固定化酶溶液。
E、取1ml酶液,采用紫外吸收法,測得酶活為2520U,活力回收率為85%。
實(shí)施例2最適pH和最適溫度測定A、取4g精制葡聚糖衍生物粉末,置于50ml丙酮中,攪拌加熱5min后,加入濃度為20%的丙二酸酐極性有機(jī)溶液,于70℃回流加熱4h。加熱完畢,離心收集沉淀,用30%乙醇洗滌沉淀至pH近中性,70℃烘干即得載體。
B、取1g載體,溶于20ml前述磷酸緩沖液中,15℃攪拌10min后,向溶液中加入10ml濃度為10%的交聯(lián)劑溶液和10ml濃度為100mg/ml的胰蛋白酶溶液(酶活力為3000U),15℃攪拌6h。反應(yīng)完畢,調(diào)節(jié)溶液pH至固定化酶完全析出,離心收集沉淀,即得固定化胰蛋白酶。
C、取1g固定化胰蛋白酶,加入30ml緩沖液中,攪拌溶解,過濾收集濾液,調(diào)節(jié)濾液pH,至固定化胰蛋白酶沉淀完全析出。以上操作步驟重復(fù)三次,收集沉淀即得精制固定化胰蛋白酶。將沉淀溶于50ml緩沖液中,即得固定化酶溶液。
D、各取1ml酶液,分別置于pH 4~10和溫度為30~80℃的緩沖液反應(yīng)體系中,測得其最適pH為9~10,最適溫度為60℃。
實(shí)施例3酸堿溶解度測定A、取20g精制葡聚糖衍生物粉末,置于500ml二甲亞砜溶劑中,攪拌加熱5min后,加入濃度為10%的丁二酸酐極性有機(jī)溶液,于65℃回流加熱8h。加熱完后,離心收集沉淀,用30%乙醇洗滌沉淀至pH近中性。70℃烘干即得載體。
B、取10g載體,溶于200ml緩沖液中,13℃攪拌10min后,向溶液中加入100ml濃度為10%的交聯(lián)劑溶液和100ml濃度為100mg/ml的胰蛋白酶溶液(酶活力為3000U),13℃攪拌4h。反應(yīng)完后,調(diào)節(jié)溶液pH至固定化酶完全析出,離心收集沉淀,即得固定化胰蛋白酶。
C、取10g固定化胰蛋白酶,加入300ml緩沖液中,攪拌溶解,過濾收集濾液,調(diào)節(jié)濾液pH,至固定化胰蛋白酶沉淀完全析出。以上操作步驟重復(fù)三次,收集沉淀即得精制固定化胰蛋白酶。
D、各取0.5g固定化酶,分別置于pH 4~10的緩沖液反應(yīng)體系中,測定其在各個(gè)pH條件下的溶解度。測得其在pH6~10范圍內(nèi)可溶。
權(quán)利要求
1.一種新型固定化胰蛋白酶,其特征在于它是利用葡聚糖衍生物合成的以如下分子式表示的化合物為載體,通過加入交聯(lián)劑和胰蛋白酶溶液,使酶與載體共價(jià)偶聯(lián)制得;所述固定化胰蛋白酶的酶活力為固定化前自由胰蛋白酶的60~85%,即活力回收為60~85%; 其中,m的取值范圍為1,2或3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化胰蛋白酶的制備方法,其特征在于包括如下工藝步驟A、載體的制備取2~4g精制葡聚糖衍生物粉末,置于30~60ml的極性有機(jī)溶劑中,攪拌加熱5min后,加入濃度為10~50%的酸酐極性有機(jī)溶液,于60~85℃回流加熱4~8h;加熱完后,離心收集沉淀,用30~75%乙醇洗滌沉淀至pH中性,再于50~70℃烘干即得載體;B、固定化酶的制備取1g載體,溶于20ml緩沖液中,10~20℃攪拌10min后,向溶液中加入10ml濃度為10%的交聯(lián)劑溶液和10ml濃度為100mg/ml的胰蛋白酶溶液,10~20℃攪拌3~5h,待反應(yīng)完后,調(diào)節(jié)溶液pH至固定化酶完全析出,離心收集沉淀,即得共價(jià)偶聯(lián)的固定化胰蛋白酶;C、固定化酶的精制與回收取1g固定化胰蛋白酶,加入30ml緩沖液中,攪拌溶解,過濾收集濾液,調(diào)節(jié)濾液pH,至固定化胰蛋白酶沉淀完全析出;以上操作步驟重復(fù)三次,收集沉淀即得精制固定化胰蛋白酶;將沉淀溶于50ml緩沖液中,即得固定化酶溶液,進(jìn)行活力測定后,調(diào)節(jié)pH至固定化酶沉淀完全,離心回收固定化胰蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化胰蛋白酶的制備方法,其特征在于所述極性有機(jī)溶劑選自乙醇、丙酮或二甲亞砜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化胰蛋白酶的制備方法,其特征在于所述的酸酐極性有機(jī)溶液選自乙酸酐、丙二酸酐或丁二酸酐溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化胰蛋白酶的制備方法,其特征在于所述交聯(lián)劑屬于零長度水溶性有機(jī)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化胰蛋白酶的制備方法,其特征在于所述緩沖溶液選自濃度為200mmol/L,pH為6~9的磷酸緩沖溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化胰蛋白酶,其特征在于在pH6~10的酸堿溶液中可溶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型固定化胰蛋白酶及其制備方法,它是利用葡聚糖衍生物合成適合的固定化酶載體,通過交聯(lián)劑將酶與載體相聯(lián)制得,所述固定化胰蛋白酶的酶活力為固定化前自由胰蛋白酶的60~85%,即活力回收為60~85%。本發(fā)明原料易得、操作簡單,制備的固定化胰蛋白酶不但穩(wěn)定性好,可反復(fù)利用,而且能夠溶解于底物溶液中,可與固體底物反應(yīng),其催化效率高,有較好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/76GK1869213SQ20061002099
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日
發(fā)明者張濤, 王玉明, 劉樺 申請(qǐng)人:成都醫(yī)學(xué)院