專利名稱：中藥川木通聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物、試劑盒及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥川木通的鑒定，具體地，是采用聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物進(jìn)行中藥 材鑒定，屬藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
川木通為常用中藥，有清熱利尿，通經(jīng)下乳等功能，藥用歷史悠久，《中華人民 共和國藥典》(一部)2005年版收載為毛茛科鐵線蓮屬植物小木通(C7e挑fl他.a/7Mfl/irf/i Franch.)或繡球藤(C. 3/o"tomi Buch-Ham)的莖。但是毛茛科13余種植物的莖藤在 不同的地區(qū)都不同程度的被作為川木通用，藥材使用混雜，關(guān)系臨床用藥的安全有效。 由于市場流通的川木通類藥材都為毛茛科鐵線蓮屬植物，藥材本身相似性大，常規(guī)鑒 定區(qū)別困難，且不準(zhǔn)確。缺乏有效的鑒別方法，造成市場流通混亂，為臨床應(yīng)用帶來 隱患。基于植物DNA序列的分子標(biāo)記技術(shù)適合于物種鑒別，因此急需'建立一種可靠的 分子標(biāo)記技術(shù)對〗11木通進(jìn)行鑒定的方法。
目前，在分子標(biāo)記技術(shù)在動植物品種鑒別方面得到廣泛的應(yīng)用。在藥材鑒定方面， 已經(jīng)成功應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)用于龜甲等中藥的鑒別。但是，這種方法對 不同的中藥材，鑒定的引物和鑒定的方法都不相同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了中藥川木通的鑒定方法，具體地，是中藥川木通聚合 酶鏈反應(yīng)鑒定引物進(jìn)行鑒定；本發(fā)明還提供了含有該鑒定引物的試劑盒。
本發(fā)明提供了一種中藥川木通聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，其中，鑒定引物DNA序列 為上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物 5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3'，引物合成采用全自動DNA合成儀進(jìn)行合成。
本發(fā)明還提供了使用該鑒定引物對中藥川木通進(jìn)行鑒定的方法，它包括如下鑒定 步驟
① 藥材DNA提取按照常規(guī)方法進(jìn)行提取(如改進(jìn)的CTAB法，見干滟，曾凡亞， 趙云等，油菜單株總DNA的快速制備，四川大學(xué)學(xué)報(bào).1999.36(5):936-939.)，提取后 采用紫外分光光度法測定DNA濃度后稀釋到80-100ng/pl。 .
② 模板DNA質(zhì)量的鑒定采用瓊脂糖電泳分析法結(jié)合紫外分光光度法進(jìn)行檢測， 提取得到的DNA樣品用2y。的瓊脂糖電泳分析鑒定;得到的條帶應(yīng)該為一條亮的條帶， 無拖尾現(xiàn)象；紫外分光光度法測定A260/A280等于1.8，表明DNA純度較高，可以進(jìn) 行PCR擴(kuò)增；
③ 鑒別性PCR:以反應(yīng)體系為25fil計(jì)算，PCR體系中試劑的用量為 10xPCR反應(yīng)緩沖液 2-3pl
25mM的MgCl2 1.5-3.0^1 2.5mM的dNTP 1.0-2.5^1
上游引物、下游引物各 0.5-1.5^U TaqDNA聚合酶 1個(gè)單位
供試DNA模板 1.0-2.0^1
去離子水 加到25jll;
在該范圍內(nèi)可以進(jìn)行正常的PCR反應(yīng)獲得清晰的條帶。
④ PCR循環(huán)在PCR儀上，94'C預(yù)變性5min，然后按下列參數(shù)進(jìn)入30個(gè)循環(huán) 變性94。C: 30-45 s
復(fù)性50-55'C: 30-45s 延伸72。C: 30-45 s，
循環(huán)結(jié)束后72'C保持5-10min;
⑤ 電泳檢測取出PCR反應(yīng)緩沖液5jU與10x加樣緩沖液0.5^1混合，2%瓊脂糖 凝膠電泳，用含0.005%的溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果；
其中加樣緩沖液是電泳專用加樣緩沖液，均采用市售產(chǎn)品。
如PCR反應(yīng)體積不為25^1，反應(yīng)物品的用量以25^1反應(yīng)劑量的比例為參考點(diǎn)，
相應(yīng)的增加或減少；
若擴(kuò)增有條帶，則供試品為川木通；若無擴(kuò)增條帶，則供試品不為川木通。 其中，供試DNA模板和陽性對照品(川木通DNA模板)均為按相同的常規(guī)方
法提取總DNA。
進(jìn)一步地，所述的鑒別性PCR，以反應(yīng)體系為25^1計(jì)算，PCR體系中試劑的用
量為
10xPCR反應(yīng)緩沖液 2.5^ 25mM的MgCl2
2.5mM的dNTP 1.5jU 上游引物、下游引物各 1.0^1 TaqDNA聚合酶 1個(gè)單位
供試DNA模板 1.0^1 去離子水加到 25jU。
本發(fā)明還提供了該鑒定引物在制備中藥川木通聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種用于鑒定中藥川木通真?zhèn)蔚脑噭┖?，包括下列部?br> a、特異性鑒定引物上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物
5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT陽3'，各U)fig/ml;
b、陽性對照品川木通DNA模板。 ' 進(jìn)一歩地，還包括下列部分
10xPCR反應(yīng)緩沖液、25mM的MgCI2、 2.5mM的dNTP、 TaqDNA聚合酶。
本發(fā)明解決了川木通的正品鑒別難題。發(fā)明人在對川木通的鑒別中，設(shè)計(jì)了鑒別 川木通的-對高特異性引物，該鑒定引物在給定的PCR條件下，只能特異性的鑒別川 木通，而對川木通的混淆品不能擴(kuò)增出片段。當(dāng)供試樣品用本鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 后，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測有無擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)，可準(zhǔn)確的判定藥材的真?zhèn)?，且本發(fā)明鑒 定方法穩(wěn)定性強(qiáng)，重現(xiàn)性高，
本發(fā)明對于中藥材收購、銷售、中藥生產(chǎn)、銷售部門快速、準(zhǔn)確的鑒別川木通藥 材，搞好藥材質(zhì)量控制是非常必要的，對于藥檢部門打擊假冒偽劣，凈化藥材市場具 有十分重要的意義。


圖l:特異性鑒定引物擴(kuò)增市售川木通品種電泳圖僅l、 2號正品川木通出現(xiàn)條 帶，可以快速鑒別川木通的真?zhèn)?。其中，l:小木通(川木通正品)2:繡球藤(川木通
正品)3:鈍萼鐵線蓮；4:粗齒鐵線蓮5:甘川鐵線蓮6:鐵線蓮7:毛果鐵線蓮8:
山木通9:威靈仙；10:尾葉鐵線蓮。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的制備
a、 特異性鑒定引物上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物 5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3'，引物合成采用全自動DNA合成儀進(jìn)行合成；各
l一；
b、 陽性對照品川木通DNA模板1.0jll;
c、 TaqDNA聚合酶l個(gè)單位、10xPCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、 dNTP;
d、 DNA提取試劑；(本發(fā)明采用的試劑均采用市售常規(guī)試劑)
其中，10xPCR反應(yīng)緩沖液2.5pl、 25mM的MgCl22.0jil、 2.5mM的dNTP 1.5pl。 實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒的制備
a、 特異性鑒定引物上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物 5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3'，引物合成采用全自動DNA合成儀進(jìn)行合成；各
b、 陽性對照品川木通DNA模板l.O(ll;
c、 TaqDNA聚合酶l個(gè)單位、10xPCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、 dNTP (市售)；
d、 DNA提取試劑(市售);
其中，IOxPCR反應(yīng)緩沖液2^1、 25mM的MgCl21.5nl、 2.5mM的dNTP l.Opl 。
實(shí)施例3本發(fā)明試劑盒的制備
a、 特異性鑒定引物上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3',下游引物 5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3'，引物合成采用全自動DNA合成儀進(jìn)行合成；各
b、 陽性對照品川木通DNA模板2.0fll;
c、 TaqDNA聚合酶l個(gè)單位、10xPCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、 dNTP (市售)；
d、 DNA提取試劑(市售)；
其中，10xPCR反應(yīng)緩沖液3^1、 25mM的MgCl2 3.0pl、 2.5mM的dNTP 2.5jil。
實(shí)施例4本發(fā)明中藥川木通的鑒定方法 采用實(shí)施例1制備的試劑盒進(jìn)行以下鑒定試驗(yàn)。
首先從市售川木通藥材不同種的原植物中提取總DNA，用RAPD方法從160對引 物中篩選出可以進(jìn)行良好擴(kuò)增的10條引物進(jìn)行分別擴(kuò)增，擴(kuò)增出多個(gè)基因片段，選取 僅存在于川木通正品小木通和繡球藤中存在的條帶進(jìn)行膠回收連接轉(zhuǎn)化到pMD18-T 載體中后進(jìn)行DNA測序，根據(jù)測序結(jié)果分別在原有隨機(jī)引物的基礎(chǔ)上延伸后設(shè)計(jì)不同 的引物(20bp左右)，分別用所有市售已經(jīng)正確鑒定品種的DNA作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，拋棄假陽性引物(可以在非川木通品種上擴(kuò)增出條帶的)，選取一對陽性PCR 引物作為最終的鑒別性引物，該引物可以在川木通正品(小木通和繡球藤)中擴(kuò)增出 478bp的片段，其他品種不能擴(kuò)增出片段。
上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'
下游引物5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT國3'
引物合成采用國際通用的全自動DNA合成儀進(jìn)行合成，IODI管，每管稀釋到 lO^ig/ml即可用于PCR鑒定反應(yīng)。
① 藥材DNA提取按照常規(guī)方法進(jìn)行，提取后采用紫外分光廣度法測定DNA 濃度后稀釋到80-100ng^l;比如改進(jìn)的CTAB法，見干滟，曾凡亞，趙云等，油菜單 株總DNA的快速制備，四川大學(xué)學(xué)報(bào).1999.36(5):936-939.。
② 模板DNA質(zhì)量的鑒定采用瓊脂糖電泳分析法結(jié)合紫外分光光度法進(jìn)行檢測， 提取得到的DNA樣品用2V。的瓊脂糖電泳分析，得到的條帶應(yīng)該為一條亮的條帶，無 拖尾現(xiàn)象；紫外分光光度法測定A260/A280約等于1.8，表明DNA純度較高，可以進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。
(D鑒別性PCR:以反應(yīng)體系為25pl計(jì)算，PCR體系中各種試劑的用量為 10xPCR反應(yīng)緩沖液 2.5nl MgCl2(25mM) 2%1
dNTP (2.5mM) 1.5jil 上游、下游引物 l.Ojd TaqDNA聚合酶 1個(gè)單位
供試DNA模板 l.Opl 去離子水 加到25^1
PCR循環(huán)在PCR儀上，94。C予變性5min，然后按下列參數(shù)進(jìn)入30個(gè)循環(huán) 變性94。C: 30-45 s
復(fù)性50-55。C: 30-45s 延伸72。C: 30-45 s，
循環(huán)結(jié)束后72。C保持5-10min。
⑤電泳檢測取出PCR反應(yīng)液5H1與lOx加樣緩沖液0.5^1混合，2%瓊脂糖凝膠 電泳檢測(含0.005%的溴化乙錠)擴(kuò)增結(jié)果。
如果出現(xiàn)條帶，就為正品川木通，反之，則不是正品川木通。實(shí)結(jié)結(jié)果見圖1。 實(shí)施例5本發(fā)明中藥川木通的鑒定方法 采用實(shí)施例2制備的試劑盒進(jìn)行以下鑒定試驗(yàn)
方法同實(shí)施例2，其中，③鑒別性PCR:以反應(yīng)體系為25^1計(jì)算，PCR體系中
試劑的用量為
10xPCR反應(yīng)緩沖液 2^1 25mM的MgCl2 1.5^1 2.5mM的dNTP 1.0^1 上游引物、下游引物各 0.5^1 TaqDNA聚合酶 1個(gè)單位
供試DNA模板 l.Opl 去離子水 加到25^1。
實(shí)施例6本發(fā)明中藥川木通的鑒定方法
采用實(shí)施例3制備的試劑盒進(jìn)行以下鑒定試驗(yàn)，試驗(yàn)方法同實(shí)施例2，其中，③ 鑒別性PCR:以反應(yīng)體系為25jU計(jì)算，PCR體系中試劑的用量為 10xPCR反應(yīng)緩沖液 3^1 25mM的MgCl2 3.0fU 2.5mM的dNTP 2.5pl 上游引物、下游引物各 1.5^1 TaqDNA聚合酶 1個(gè)單位
供試DNA模板 2.0fil 去離子水 加到25fil。
實(shí)施例5和實(shí)施例6均可以進(jìn)行正常的PCR反應(yīng)獲得清晰的條帶。
權(quán)利要求
1、一種中藥川木通聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，其特征在于鑒定引物DNA序列為上游引物5′-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3′，下游引物5′-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3′。
2、 一種使用權(quán)利要求l所述的鑒定引物對中藥川木通進(jìn)行鑒定的方法，它包括如下鑒定步驟① 提取藥材DNA，提取后采用紫外分光光度法測定DNA濃度后稀釋到 80-100ng/jil;② 模板DNA質(zhì)量的鑒定采用瓊脂糖電泳分析法結(jié)合紫外分光光度法進(jìn)行檢測， 提取得到的DNA樣品用2%的瓊脂糖電泳分析鑒定；③ 鑒別性PCR:以反應(yīng)體系為25^1計(jì)算，PCR體系中試劑的用量為 10xPCR反應(yīng)緩沖液 2-3^U25mM的MgCh 1.5-3.0^1 2.5mM的dNTP 1.0-2.5fi1 上游引物、下游引物各 0.5-1.5jU TaqDNA聚合酶 1個(gè)單位供試DNA模板 1.0-2.0^1 去離子水 加到25pl; PCR循環(huán)在PCR儀上，94。C預(yù)變性5min，然后按下列參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán) 變性94。C: 30-45 s復(fù)性50-55 。C: 30-45s 延伸72。C: 30-45 s，循環(huán)結(jié)束后72'C保持5-10min;⑤電泳檢測取出PCR反應(yīng)液5fi1與10x加樣緩沖液0.5^1混合，用含0.005%的溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果；如PCR反應(yīng)體積不為25nl，反應(yīng)物品的用量以25^1反應(yīng)劑量的比例為參考點(diǎn)，相應(yīng)的增加或減少；若擴(kuò)增有條帶，則供試品為川木通；若無擴(kuò)增條帶，則供試品不為川木通。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用鑒定引物對中藥川木通進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于所述的鑒別性PCR，以反應(yīng)體系為25pl計(jì)算，PCR體系中試劑的用量為 10xPCR反應(yīng)緩沖液 2.5nl25mM的MgCh 2.0jil2.5mM的dNTP 1.5jil上游引物、下游引物各 l.O^ilTaqDNA聚合酶 1個(gè)單位供試DNA模板 l.Ofil去離子水加到 25^1。
4、 權(quán)利要求1所述的鑒定引物在制備中藥川木通聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒中的應(yīng)用。
5、 一種用于鑒定中藥川木通真?zhèn)蔚脑噭┖?，其特征在于含?quán)利要求1所述的 鑒定引物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于鑒定中藥川木通真?zhèn)蔚脑噭┖?，其特征在于?包括下列部分-a 、鑒定引物鑒定引物DNA序列為上游引物 5-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物5-TGCCCAGCCTCAACAGTGT誦3'; b、陽性對照品川木通DNA模板。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于鑒定中藥川木通真?zhèn)蔚脑噭┖?，其特征在于還 包括下列部分lOxPCR反應(yīng)緩沖液、25mM的MgCl2、 2.5mM的dNTP、 TaqDNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥川木通聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，鑒定引物DNA序列為上游引物5′-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3′，下游引物5′-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3′。本發(fā)明還提供了采用該鑒定引物對中藥川木通進(jìn)行鑒定的方法及鑒定中藥川木通真?zhèn)蔚脑噭┖?。本發(fā)明解決了川木通的正品鑒別難題。發(fā)明人在對川木通的鑒別中，設(shè)計(jì)了鑒別川木通的一對高特異性引物，該鑒定引物在給定的PCR條件下，只能特異性的鑒別川木通，而對川木通的混淆品不能擴(kuò)增出片段。當(dāng)供試樣品用本鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測有無擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)，即可準(zhǔn)確的判定藥材的真?zhèn)巍?br> 文檔編號C12Q1/68GK101182569SQ20061002242
公開日2008年5月21日 申請日期2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日
發(fā)明者萬德光, 國錦琳 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)