專利名稱：Bim凋亡效應(yīng)的最小核心序列及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件(BCU)和以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR(BCU Based Pro-apoptoticRamification)，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及以BCU藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物的多核苷酸和多肽的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Bim是細(xì)胞線粒體凋亡途徑中的重要促凋亡蛋白，具有BH3 domain，歸屬BCL-2亞家族成員，不僅可以感應(yīng)傳遞細(xì)胞內(nèi)外的凋亡信號，而且可以直接拮抗BCL-2家族中凋亡抵抗分子，如Bcl-2，Bcl-xl等，從而啟動細(xì)胞凋亡程序，同時還可以與BCL-2家族中的多domain的促凋亡分子Bax、Bak等結(jié)合生成異聚體，從而攻擊線粒體的外膜，形成孔徑結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞致死因子，如Cytochrome C等的釋放從而直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡在機體生長發(fā)育、衰老及免疫等重要生命功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時，也直接影響到眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展和演變。Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件(BCU)的確立也為研究確定該家族蛋白在健康和疾病狀態(tài)下的作用提供了基礎(chǔ)。同時，Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件(BCU)及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物(BBPR)將構(gòu)成開發(fā)疾病診斷和/或治療藥物的重要基礎(chǔ)或設(shè)計藍(lán)本，因此分離其編碼DNA是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供分離Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU方法及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR多肽以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸。
本發(fā)明的再一個目的是提供含有編碼Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的重組載體。
最后本發(fā)明還提供上述Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR多肽的應(yīng)用。
本發(fā)明的發(fā)明人曾發(fā)現(xiàn)Bim家族中仍具有致凋亡效應(yīng)的最小異構(gòu)體Bimbeta5，本發(fā)明進(jìn)一步確定導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最小核心功能單位。具體方法是根據(jù)Bimbeta5的核酸序列(SEQ.ID.NO.1)設(shè)計一系列引物，通過不同的組合，表達(dá)生成bim的5’端方向或/和3’端方向的缺失的人工異構(gòu)體。再通過對這一系列的人工異構(gòu)體的致細(xì)胞凋亡效應(yīng)的檢測，從而得到在刪減突變中，最小核心功能單位BCU(SEQ.ID.NO.21)及具有不同致凋亡效應(yīng)的人工異構(gòu)體，也就是被定義為以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的一系列重要衍生物BBPR多肽。在研究分析組成BCU及BBRP多肽中的氨基酸重要屬性及潛在作用機制時，發(fā)現(xiàn)一些重要的結(jié)構(gòu)會直接影響B(tài)CU和BBRP的致凋亡效應(yīng)，因而，對其中一些重要氨基酸進(jìn)行突變或增減又形成了具有重要開發(fā)價值的以BCU為藍(lán)本的類似物和衍生物。
關(guān)于最小異構(gòu)體Bim bete5參見下述文獻(xiàn)Int J Biochem Cell Biol.2004 Aug；36(8)1554-61.
Over-expression of Bim alpha3，a novel isoform of human Bim，result in cell apoptosis.
Chen JZ，Ji CN，Gu SH，Li JX，Zhao EP，Huang Y，Huang L，Ying K，Xie Y，Mao YM.
State Key Laboratory of Genetic Engineering，School of Life Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai200433，PR China.
本發(fā)明通過功能分析確定了Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR多肽以及其片段、類似物和衍生物，同時也確定了編碼這些功能多肽的多核苷酸序列。這些重要序列的確立，為表達(dá)生產(chǎn)這些功能多肽提供了最直接的依據(jù)。
本發(fā)明在研究Bim的5’端方向或/和3’端方向的缺失的人工異構(gòu)體的致細(xì)胞凋亡效應(yīng)時，通過亞分子克隆的方法，將一系列的人工異構(gòu)體裝載在真核表達(dá)的載體pcDNA3.0上；并在目標(biāo)表達(dá)片斷前加上Kozark序列，引導(dǎo)目標(biāo)片斷在真核細(xì)胞內(nèi)得以充分表達(dá)。從而得到一系列的真核表達(dá)BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的重組載體。此外，應(yīng)用其他表達(dá)載體，如原核表達(dá)載體，病毒表達(dá)載體等等，都可以構(gòu)建表達(dá)BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的重組載體。直接用于研究生產(chǎn)BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR。
此外，本發(fā)明還提供了含有編碼Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明在構(gòu)建完成了一系列的真核表達(dá)BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR多核苷酸的真核表達(dá)的重組載體后，通過LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且通過抗生素篩選，得到編碼Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。此外，利用不同的宿主細(xì)胞，原核細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等，在不同的轉(zhuǎn)化載體的作用下，經(jīng)一定的篩選方法，也可以獲取的BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的方法。
用本發(fā)明的編碼BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸或變異體，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；在常規(guī)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。重組蛋白可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明還提供針對本發(fā)明的多肽-Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的抗體。
用多肽合成儀(PE公司產(chǎn)品)合成BCU或以BCU為藍(lán)本的具有最強致凋亡效應(yīng)的多肽；將該多肽分別與血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復(fù)合，方法參見Avrameas，et al.Immunochemi stry，1969；643。用4mg上述血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復(fù)合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR結(jié)合。
本發(fā)明還提供了針對本發(fā)明多肽——Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
本發(fā)明通過確定一系列BCU為藍(lán)本的BBRP多肽的功能差異性后，根據(jù)分析研究組成BCU及BBRP多肽中的氨基酸重要屬性和通過分子互作模擬技術(shù)研究重要氨基酸在細(xì)胞致凋亡效應(yīng)過程中潛在的作用機制，從而根據(jù)其中的重要結(jié)構(gòu)設(shè)計了以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
本發(fā)明還提供制備診斷治療與Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR異常相關(guān)的疾病藥物的方法，以及診斷用的試劑盒、基因芯片和檢測分析用的微陣列。
本發(fā)明編碼BCU及BBPR的多核苷酸可用于檢測BCU及BBPR的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下BCU及BBPR的異常表達(dá)。如編碼BCU及BBPR的DNA序列可用于對活檢標(biāo)本進(jìn)行雜交以判斷BCU及BBPR的表達(dá)狀況。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用BCU及BBPR特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測BCU及BBPR的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測BCU及BBPR基因的突變也可用于診斷BCU及BBPR相關(guān)的疾病。BCU及BBPR突變的形式包括與正常野生型BCU及BBPR DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明涉及分離的多肽Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR，該多肽是人源的，它包含具有下列氨基酸序列(SEQ IDNo.2，No.11-20)的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。較佳地，該多肽是具有氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明中，Bim beta 5核酸序列和對應(yīng)的蛋白質(zhì)如圖1所示。其中，Bim beta 5的序列為SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列為SEQ.ID.NO.2。
按Bimbeta5的經(jīng)典讀碼框，該序列只能表達(dá)9個氨基酸的短肽；方框中的序列代表新定義的開放讀碼框，表達(dá)26個氨基酸的多肽，其中包含有BH3 domain。
本發(fā)明中，所述Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件(BCU)的序列和引物如下表1構(gòu)建Bim beta 5人工異構(gòu)體的引物序列

表2 Bim beta 5人工異構(gòu)體引物配對及其氨基酸序列
圖表說明上圖中描述了在BCU定義過程中，為了確定Bim分子最小核心功能區(qū)域，根據(jù)Bimbeta5構(gòu)建了一系列人工異構(gòu)體的引物和氨基酸序列；同時，對序列中的氨基酸屬性進(jìn)行分析，非極性或疏水性的氨基酸有M/I/W/A/L/F/N/A；極性不帶電荷的氨基酸有Q/G/Y；極性帶正電荷的氨基酸有R/K；藍(lán)色代表極性帶負(fù)電荷的氨基酸有E/D；方框內(nèi)氨基酸序列為被定義的BCU序列SEQ.ID.No.21。
本發(fā)明中，根據(jù)Bim beta5(β5)cDNA構(gòu)建的兩種表達(dá)模式的質(zhì)粒凋亡功能的流式細(xì)胞儀檢測圖如圖2所示。
根據(jù)bimbeta5的cDNA序列構(gòu)建不同讀碼框架的目標(biāo)表達(dá)質(zhì)粒，pcDNA3.0-bimβ5-1(a)和pcDNA3.0-bimβ5-2(b)，轉(zhuǎn)化HEK293細(xì)胞系，并用流式細(xì)胞儀檢測其凋亡情況。結(jié)果顯示根據(jù)實驗對照(c)，pcDNA3.0-bimβ5-1和pcDNA3.0-bimβ5-2具有近乎相同的促凋亡能力。
pcDNA3.0-bimβ5-1和pcDNA3.0-bimβ5-2轉(zhuǎn)化細(xì)胞裂解液的Western blot檢測，見圖3所示。
結(jié)果顯示，pcDNA3.0-bimβ5-1和pcDNA3.0-bimβ5-2在細(xì)胞中表達(dá)分子量相同的蛋白，說明兩種質(zhì)粒的表達(dá)框架相同，都為新定義的由第二個ATG起始的讀碼框架。
Bimβ5不同人工異構(gòu)體流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果柱型圖見圖4所示。
將Bimβ5的一系列人工異構(gòu)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，孵育24h后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測獲得的細(xì)胞凋亡結(jié)果圖。如圖4所示，BCU結(jié)構(gòu)的完整性及特定保護(hù)基團(tuán)在其凋亡效應(yīng)中的重要作用，為設(shè)計以BCU為基礎(chǔ)的潛在藥物分子模型奠定重要基礎(chǔ)。
利用計算機分子模擬技術(shù)解析BCU在凋亡過程中潛在的作用機制，見圖5所示。
Bim致凋亡效應(yīng)的研究背景表明，Bim潛在的作用機制在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中，而Bim分子直接參予凋亡過程中線粒體攻擊的重要角色，能促進(jìn)凋亡分子Bax、Bak等結(jié)合生成同源二聚體或異源二聚體，形成特定的模式結(jié)構(gòu)，攻擊線粒體的外膜，導(dǎo)致線粒體功能結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性；引發(fā)細(xì)胞致死分子如細(xì)胞色素C等的釋放，觸發(fā)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，從而細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過程。
通過FLM研究分析BCU及BBRP系列的致細(xì)胞凋亡活性顯示，具有最強的凋亡效應(yīng)的衍生物為Bimβ5A3時，為了進(jìn)一步分析該衍生物的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，結(jié)合了已有的研究背景，應(yīng)用大型分子互作儀技術(shù)，模擬再現(xiàn)Bimβ5A3與Bcl-2家族中致凋亡效應(yīng)分子Bak/Bax的潛在作用機制圖5(A)中，模擬了單體Bimβ5A3與單體Bak的作用；如圖所示，Bimβ5A3中的3’端的F12和Y16可通過極性作用，與Bak中的疏水氨基酸F93，M96，I114和L1118形成的疏水槽形成基本穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。此外，Bimβ5A3中帶正電荷的氨基酸R19能可與Bak中的帶負(fù)電荷的E120形成鹽橋結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)能進(jìn)一步穩(wěn)定疏水基團(tuán)之間的簇集作用。因而，在分子互作的模擬實驗中，單體Bimβ5A3可與單體Bak形成相互作用的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。
圖5(B)中，模擬了單體Bimβ5A3與單體Bax的作用；Bimβ5A3的N端的極性氨基酸Q3和R6/R7能夠與Bax中α3andα4螺旋之間的環(huán)裝片斷中帶負(fù)電荷或極性不帶電荷的氨基酸相互作用(如Bax中的D84和D86)。這些相互作用包括氫鍵和鹽橋作用。如圖所示，Bimβ5A3N端的Q3能與Bax中的D86形成氫鍵作用，而R7能與Bax中的D84形成鹽橋作用。這些相互作用穩(wěn)定了單體Bimβ5A3與單體Bax的相互作用。
圖5(C)、(D)、(E)中，在單體Bim 5A3能與單體Bak/Bax相互作用的模擬結(jié)構(gòu)，應(yīng)用分子互作儀的MD激發(fā)，進(jìn)一步模擬Bimβ5A3與二聚體Bak-Bak，Bax-Bax，Bak-Bax的存在的相互作用穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。
如圖5(C)所示，Bim 5A3的C端疏水結(jié)構(gòu)與Bak相互作用模式與圖A相同，在Bim 5A3的N端，Q3 and R7能與另一個單體Bax的Q101，N106 and Y110通過氫鍵作用，形成網(wǎng)格化的作用結(jié)構(gòu)。
如圖5(D)所示，在單體Bimβ5A3與兩個Bax相互作用模擬結(jié)構(gòu)中，Bimβ5A3的N端與單體Bax的作用與圖5(B)中的作用模式相同；而在Bimβ5A3的C端中的L5，F(xiàn)12和Y16能與另一個單體Bax中的L76，M79，I80，V83，V95和Y115通過疏水作用形成簇集結(jié)構(gòu)，這對于穩(wěn)定Bimβ5A3與Bax相互作用有著至關(guān)重要的作用。
圖5(E)模擬了單體Bimβ5A3介導(dǎo)的Bak/Bax異二聚體的相互作用模型，單體Bimβ5A3的C端與Bak的相互作用與圖5(A)中的作用模式相同，然而在Bimβ5A3的N端的作用卻有些不同，除了R6與Bax的D86形成氫鍵外，側(cè)鏈中Q3還能與Bax的N-H骨架形成氫鍵結(jié)構(gòu)。
綜上所述，以BCU為重要基礎(chǔ)的人工異構(gòu)體Bimβ5A3具有潛在的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)分子Bak/Bax同源二聚體或異源二聚體的作用能力，這在細(xì)胞凋亡過程中具有決定性的作用，這個效應(yīng)的實現(xiàn)，將直接導(dǎo)致細(xì)胞線粒體外膜的不穩(wěn)定性，引起細(xì)胞色素C的釋放，引發(fā)細(xì)胞凋亡過程中的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而從模擬效果圖，可以揭示BCU在這個過程中所起到的重要作用。


圖1為Bim beta5核酸序列和對應(yīng)的蛋白質(zhì)圖示。
圖2為根據(jù)Bim beta5(β5)cDNA構(gòu)建的兩種表達(dá)模式的質(zhì)粒凋亡功能的流式細(xì)胞儀檢測圖。其中，(a)為pcDNA 3.0-Bimβ-1，(b)為pcDNA 3.0-Bimβ-2，(c)為實驗對照。
圖3為pcDNA3.0-bimβ5-1和pcDNA3.0-bimβ5-2轉(zhuǎn)化細(xì)胞裂解液的Western blot檢測。
圖4為Bimβ5不同人工異構(gòu)體流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果柱型圖。
圖5為利用計算機分子模擬技術(shù)解析BCU在凋亡過程中潛在的作用機制。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1bimβ5的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α，細(xì)菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cyclereaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5’和3’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆{AY305716}的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進(jìn)行雙向測定。結(jié)果表明，{AY305716}克隆所含的全長cDNA為349bp，從第27bp至137bp有一個111bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(zhì)。編碼的蛋白質(zhì)命名為bimβ5。
實施例2含BCU的系列克隆的構(gòu)建用bimβ5為模板，以表1，2列舉的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)的條件在50μl的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應(yīng)25個周期94oC 30sec；55oC 30sec；72oC 2min。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化。產(chǎn)物及pcDNA質(zhì)粒(Invitrogen公司)用HindIII-Bim H1消化，酶切產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，r然后連接，轉(zhuǎn)化DH5α，得到基于pcDNA的系列含BCU的表達(dá)克隆。用T7啟動子同源引物測序確定序列正確性。
實施例3含BCU的bim beta 5的表達(dá)產(chǎn)物和生物學(xué)活性檢測如圖2，3所示，利用Bimβ5的cDNA構(gòu)建兩種不同讀碼框架的表達(dá)質(zhì)粒在流式細(xì)胞儀上的檢測和western blot檢測以Bimβ5轉(zhuǎn)載T-vectors為模板，利用兩對特別引物(5’cccaagcttaccatggggcaggctgaacctgcaga 3’；5’cggaattcctatttctctaa cctccttgcatagta3’and 5’cccaagcttaccatgggcccagagatatggatcgc 3’；5’cggaattcctatttctctaacctccttgcatagta 3’)進(jìn)行擴(kuò)增構(gòu)建帶有Hind III and EcoRI酶切位點的。Bimβ5的編碼核酸片斷，并將兩種不同類型的片斷裝入pcDNA3.0真核表達(dá)質(zhì)粒中構(gòu)建Bimβ5-1和Bimβ5-2。(Bimβ5-1為Bimβ5的全長cDNA，為經(jīng)典讀框，其預(yù)測表達(dá)產(chǎn)物為9個氨基酸的短肽；Bimβ5-2為Bimβ5的全長cDNA的片斷，由第二個起始密碼開始，并在起始密碼前加上Kozak序列，其預(yù)測表達(dá)產(chǎn)物為36個氨基酸，并帶有BH3 domain)。將測序驗證正確的pcDNA3.0-目標(biāo)基因質(zhì)粒及對照質(zhì)粒pcDNA3.0 DNA用Invitrogen lipofectAMINE真核轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
當(dāng)細(xì)胞孵育24小時后，用Becton Dickinson公司的Cycle test plus DNA reagent kit在流式細(xì)胞計數(shù)儀上檢測細(xì)胞凋亡變化情況。(1收集的細(xì)胞500g離心5min，去上清。每管加入胰蛋白酶緩沖液250μl，小心混勻，在室溫下反應(yīng)10min。2加200μl的一蛋白酶抑制劑/Rnase混合緩沖液，小心混勻，在室溫下反應(yīng)10min。3加200μl的propidium iodide染色液200μl 4℃避光反應(yīng)10min。4樣本用50um孔徑的尼龍膜過濾，轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞計數(shù)儀加樣管做細(xì)胞周期檢測。)同時，將用預(yù)冷的真核細(xì)胞裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，蛋白酶抑制劑混合物)重懸浮經(jīng)轉(zhuǎn)染孵育24小時的細(xì)胞。HEK293細(xì)胞懸浮液用預(yù)冷的1ml無菌一次性針筒反復(fù)抽放進(jìn)行勻漿。勻漿產(chǎn)物4℃，12000rpm離心10min，取上清。
在介質(zhì)中加入100μl的2×蛋白SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，煮沸后用12％的SDS-PAGE電泳后分離。電泳結(jié)束后，取下凝膠。準(zhǔn)備6張濾紙和一張Protran BA83 Cellμlosenitrate膜，將它們裁為與凝膠同等大小。Protran BA83 Cellμlosenitrate膜于甲醇中浸泡數(shù)秒種，之后浸入電轉(zhuǎn)移緩沖液中。按海綿、3張濾紙、Protran BA83 Cellμlosenitrate膜、凝膠、3張濾紙、海綿的次序依次將電轉(zhuǎn)移夾層裝好。將電泳夾層放入電轉(zhuǎn)移槽，有ProtranBA83 Cellμlosenitrate膜的一邊為陽極，凝膠一邊為陰極，倒入電轉(zhuǎn)移緩沖液。將整個裝置置于冰中，恒壓100V，電轉(zhuǎn)移2h。
電泳結(jié)束后，取下Protran BA83 Cellμlosenitrate膜，用PBST略為漂洗之后，用Roche公司BM Chromogenic Western Blotting試劑盒中的Blocking Buffer封閉1h，其間溫和振蕩。封閉結(jié)束后用PBST漂洗3次，加入用Roche公司Blocking Buffer稀釋的Clontech公司的Livecolor多克隆抗體，溫和振蕩過夜。用PBST漂洗3次，加入用Roche公司Blocking Buffer稀釋的Santa Cruz HRP-羊抗兔二抗，溫和振蕩2h。用PBST漂洗3次，加入DAB底物溶液顯色，直到Protran BA83 Cellμlosenitrate膜上出現(xiàn)明顯條帶后用終止反應(yīng)。
實施結(jié)果見圖例圖1，圖2，圖3實施例4含BCU的系列表達(dá)質(zhì)粒在293細(xì)胞系的凋亡活性研究利用表1，表2中引物及引物配對構(gòu)建Bimβ5序列的人工異構(gòu)體的亞克隆，將測序驗證正確的pcDNA3.0-目標(biāo)基因質(zhì)粒及對照質(zhì)粒pcDNA3.0 DNA用Invitrogen lipofectAMINE真核轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞孵育24小時后，用Becton Dickinson公司的Cycle test plusDNA reagent kit在流式細(xì)胞計數(shù)儀上檢測細(xì)胞凋亡變化情況。(具體過程同上)結(jié)果如圖4所示。
實施例5BCU重要衍生物與bax/bak相互作用的計算機模型分析利用大型計算機分子互作儀，模擬BCU重要衍生物Bimβ5A3與bax/bak單聚體，同源二聚體和異源二聚體相互作用過程及結(jié)構(gòu)模式，以此在分子模擬層面解釋BCU在細(xì)胞線粒體凋亡途徑中，通過聚合bax和bak，介導(dǎo)線粒體表膜的不穩(wěn)定性，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡的重要過程。實施過程，如圖5所示。
序列表SEQ.ID.No.1Bim beta 5核酸序列ATG AGG CAG GCT GAA CCT GCA GAT ATG CGC CCA GAG ATA TGG ATCGCC CAA GAG TTG CGG CGT ATC GGA GAC GAG TTT AAC GCT TAC TAT GCA AGG AGG TTA GAGAAA TAGSEQ.ID.No.2Bim beta 5氨基酸序列MRQAEPADMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYARRLEKSEQ.ID.No.3-10構(gòu)建Bimβ5人工異構(gòu)體的引物序列

SEQ.ID.No.11-20 Bim beta 5人工異構(gòu)體氨基酸序列

SEQ.ID.NO.21 Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCUMAQELRRIGDEFNAYYARR。
權(quán)利要求
1.一種Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件，記為BCU，其特征在于從Bim beta5的核酸序列SEQ.ID.NO1分離獲得，其序列為SEQ.ID.NO21。
2.一種以權(quán)利要求1所述BCU為藍(lán)本構(gòu)建的衍生物BBPR多肽。
3.一種編碼如權(quán)利要求2所述的衍生物物BBPR多肽的多核苷酸序列。
4.一種含有編碼如權(quán)利要求1所述的Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的衍生物BBPR的多核苷酸的重組載體。
5.一種如權(quán)利要求4所述的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于具體步驟如下通過亞分子克隆的方法，將一系列的人工異構(gòu)體裝載在真核表達(dá)的載體上；并在目標(biāo)表達(dá)片斷前加上Kozark序列，引導(dǎo)目標(biāo)片斷在真核細(xì)胞內(nèi)得以充分表達(dá)，從而得到一系列的真核表達(dá)BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的衍生物BBPR的多核苷酸的重組載體。
6.一種含有編碼如權(quán)利要求1所述的Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。
7.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述的Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的衍生物BBPR的方法，其特征在于具體步驟如下用編碼BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的衍生物BBPR的多核苷酸或變異體，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；在常規(guī)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
8.一種針對如權(quán)利要求1所述的Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的抗體。
9.一種針對如權(quán)利要求1所述的Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件BCU及以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的重要衍生物BBPR的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Bim家族致凋亡效應(yīng)最小核心部件和以該部件為藍(lán)本構(gòu)建的衍生物，以及編碼此多肽的多核苷酸序列，還涉及以該部件為藍(lán)本構(gòu)建的衍生物多核苷酸和多肽的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的最小核心部件BCU以及以BCU為藍(lán)本的衍生物BBPR多肽以及其片斷、類似物和衍生物從Bim beta5的核苷酸序列中分離得到，該核心部件BCU和以BCU為藍(lán)本構(gòu)建的衍生物BBPR可用于制備與診斷和治療相關(guān)疾病的藥物和檢測芯片等。
文檔編號C12N5/10GK1807449SQ200610023668
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日
發(fā)明者劉凌峰, 陳金中, 季朝能, 顧少華, 謝毅, 毛裕民 申請人:復(fù)旦大學(xué)