專(zhuān)利名稱：一種誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的物質(zhì)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及軟骨細(xì)胞或軟骨組織和/或兩者分泌的可溶性物質(zhì)制備方法及其誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的方法和用途。
背景技術(shù)：
先天畸形、外傷、感染、腫瘤或骨軟骨炎等疾病均可以導(dǎo)致軟骨的缺損或損傷。由于軟骨組織損傷后自我修復(fù)能力很低，因此，軟骨缺損或損傷的治療一直是修復(fù)重建外科面臨的巨大挑戰(zhàn)。目前臨床上常用的治療手段包括自體軟骨的游離或帶蒂移植(主要取自體肋軟骨)、異體軟骨的游離移植、自體或異體軟骨細(xì)胞注射移植、骨膜或軟骨膜移植及應(yīng)用人工假體等。但這些方法均存在明顯的缺點(diǎn)，如自體軟骨移植供體來(lái)源少、創(chuàng)傷大、移植后易吸收縮小，還可能出現(xiàn)各供區(qū)并發(fā)癥。異體和異種軟骨移植物不但具有免疫原性，而且存在傳播艾滋病、肝炎等病原體的危險(xiǎn)。雖然人工合成的軟骨組織代用品具有制作簡(jiǎn)單，使用方便等優(yōu)點(diǎn)，但是替代材料只具備充填、支持及維持美觀的作用，缺少軟骨生物學(xué)功能，不是真正意義上的結(jié)構(gòu)與功能重建，而且可能發(fā)生移植部位疼痛、人工代用品外露等問(wèn)題，無(wú)法滿足患者的治療要求。
組織工程技術(shù)的興起為軟骨缺損的完美修復(fù)帶來(lái)了新的希望。其基本原理是將有特定功能的細(xì)胞與一定形狀的可降解生物材料結(jié)合，通過(guò)體外培養(yǎng)構(gòu)建出有相應(yīng)功能的活體組織用于組織缺損的修復(fù)，或直接將細(xì)胞-材料復(fù)合物植入體內(nèi)組織缺損部位進(jìn)行修復(fù)。軟骨是最早應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建成功的組織，目前應(yīng)用軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞在體內(nèi)外已經(jīng)能夠成功地構(gòu)建出精確形狀的成熟軟骨組織。但獲取軟骨細(xì)胞同樣會(huì)面臨軟骨移植時(shí)存在的供區(qū)創(chuàng)傷大、供體來(lái)源不足及同種異體免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題，而且軟骨細(xì)胞體外大量擴(kuò)增極易發(fā)生老化與去分化，常規(guī)培養(yǎng)傳代3～4次后即喪失軟骨形成能力。這些問(wèn)題都是軟骨組織工程遲遲未能應(yīng)用于臨床軟骨缺損治療的根本原因。因此，探索新的軟骨組織工程種子細(xì)胞來(lái)源勢(shì)在必行。
干細(xì)胞(stem cells)包括間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)的軟骨分化潛能已被許多研究充分證實(shí)。干細(xì)胞來(lái)源廣泛(可以來(lái)自骨髓、骨膜、軟骨膜、脂肪、皮膚、血管周膜、胚胎中胚層未分化的間充質(zhì)細(xì)胞以及建系的胚胎干細(xì)胞等)，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，免疫原性低，而且自體來(lái)源的干細(xì)胞取材創(chuàng)傷小、供區(qū)廣泛又不必?fù)?dān)心免疫排斥反應(yīng)，因此，干細(xì)胞是目前軟骨組織構(gòu)建的最佳種子細(xì)胞來(lái)源。
在干細(xì)胞軟骨定向分化及組織工程化軟骨構(gòu)建的研究與應(yīng)用中，選擇何種軟骨定向誘導(dǎo)方案一直是研究的難點(diǎn)和關(guān)鍵問(wèn)題?，F(xiàn)行的干細(xì)胞體外軟骨定向誘導(dǎo)方案主要分為兩大類(lèi)一類(lèi)是通過(guò)添加外源性誘導(dǎo)因子或細(xì)胞外基質(zhì)成分促進(jìn)干細(xì)胞軟骨分化。這種方法的主要缺點(diǎn)是操作繁復(fù)，誘導(dǎo)效率低，更重要的是誘導(dǎo)過(guò)程中添加的因子種類(lèi)多、用量大、價(jià)格昂貴，不利于大規(guī)模臨床推廣應(yīng)用。另一類(lèi)誘導(dǎo)方法是將有軟骨誘導(dǎo)作用的某些蛋白或生長(zhǎng)因子的重組DNA通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入干細(xì)胞，誘導(dǎo)其向軟骨定向分化。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然提高了分化效率，降低了成本，但由于存在安全性(致瘤性、表達(dá)量的調(diào)控)、倫理性等問(wèn)題，距臨床應(yīng)用的要求仍有很大的差距。因此，如何建立一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、安全而又有效的誘導(dǎo)方法，已成為干細(xì)胞軟骨定向分化及組織工程化軟骨構(gòu)建的關(guān)鍵所在。
中國(guó)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?2155171.5)揭示將軟骨細(xì)胞與BMSCs按一定比例混勻，接種到生物支架材料后植入裸鼠皮下或進(jìn)行體外培養(yǎng)后，BMSCs向軟骨定向分化并在體內(nèi)外形成成熟的軟骨組織。然而，這種軟骨細(xì)胞/干細(xì)胞混合培養(yǎng)的誘導(dǎo)方法最大缺點(diǎn)在于，軟骨細(xì)胞必須直接參與干細(xì)胞的軟骨定向分化或組織工程化軟骨構(gòu)建，這就同樣面臨著應(yīng)用軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞所面臨的自體軟骨細(xì)胞來(lái)源不足、同種異體或異種軟骨細(xì)胞的免疫原性、疾病傳播等相關(guān)問(wèn)題。
因此本領(lǐng)域迫切需要解決這些問(wèn)題，使組織工程化軟骨構(gòu)建徹底擺脫軟骨細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題的限制，建立一種真正簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、安全、有效而又容易大規(guī)模推廣應(yīng)用的軟骨誘導(dǎo)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明的另一目的是提供將所述的誘導(dǎo)劑用于誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的方法。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種軟骨分化誘導(dǎo)劑，它具有以下特征(a)可誘導(dǎo)干細(xì)胞(如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞)分化形成軟骨細(xì)胞；(b)來(lái)自體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織的培養(yǎng)液。
所述誘導(dǎo)劑是用以下的制備方法獲得的將體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織所獲得的培養(yǎng)液進(jìn)行分離(如過(guò)濾或離心)，去除軟骨細(xì)胞和軟骨組織，從而獲得不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液。
在另一優(yōu)選例中，所述誘導(dǎo)劑是用以下的制備方法獲得的將體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織所獲得的培養(yǎng)液通過(guò)離心進(jìn)行分離，去除軟骨細(xì)胞和軟骨組織，從而獲得不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液。
在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)液是培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織1天-200天期間所獲得的培養(yǎng)液。
在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的時(shí)間為1天-100天，培養(yǎng)軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化軟骨的時(shí)間為3天-200天。
在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)液是在換液后24小時(shí)-150小時(shí)期間獲得的培養(yǎng)液。
在上述的誘導(dǎo)劑中，所述的軟骨組織包括軟骨細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合所形成的組織工程化軟骨移植物或組織工程化軟骨。
在另一優(yōu)選例中，所述的組織工程化軟骨為軟骨細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料形成的固態(tài)細(xì)胞-材料復(fù)合物，且軟骨細(xì)胞在復(fù)合物中的濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/cm3-1×108個(gè)細(xì)胞/cm3。
在上述的誘導(dǎo)劑中，所述的制備方法還包括步驟對(duì)獲得的不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液進(jìn)行濃縮和/或干燥，從而制成濃縮的或固態(tài)的誘導(dǎo)劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟從所述的不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液中分離出蛋白質(zhì)物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述的誘導(dǎo)劑包括軟骨細(xì)胞和/或軟骨組織培養(yǎng)過(guò)程中分泌的可溶性物質(zhì)(主要的有效成份)。
在上述的誘導(dǎo)劑中，所述的軟骨細(xì)胞是人或動(dòng)物的軟骨細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的軟骨細(xì)胞可來(lái)源于關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨、耳軟骨、氣管軟骨等各種軟骨組織。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種上述誘導(dǎo)劑的用途，就是將它用作體外誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)劑。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，是提供了一種誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的方法，它包括步驟在適合培養(yǎng)的條件下，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)干細(xì)胞或干細(xì)胞-生物可降解材料的復(fù)合物，所述的復(fù)合物包括干細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的生物可降解材料，且干細(xì)胞在復(fù)合物中的濃度為1×105個(gè)細(xì)胞/克-1×108個(gè)細(xì)胞/克，培養(yǎng)時(shí)間為7天-180天，從而誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。
其中，在所述培養(yǎng)液中含有本發(fā)明提供的軟骨分化誘導(dǎo)劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的誘導(dǎo)劑為液態(tài)或固態(tài)形式。
在另一優(yōu)選例中，干細(xì)胞是人或動(dòng)物的干細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的干細(xì)胞包括各種間充質(zhì)干細(xì)胞(如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、真皮多潛能干細(xì)胞等)和胚胎干細(xì)胞。更佳地，所述的干細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述誘導(dǎo)劑的含量為0.1-1.0ml/ml培養(yǎng)液，其中誘導(dǎo)劑按未濃縮的軟骨培養(yǎng)液體積計(jì)算。
在另一優(yōu)選例中，所述的可降解材料為藥學(xué)上可接受的、生物相容性良好的可降解材料，可選自下組聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其組合。
在本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了一種用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有0.1-1.0ml/ml本發(fā)明提供的軟骨分化誘導(dǎo)劑(按未濃縮的軟骨培養(yǎng)液體積計(jì)算)。此外，所述的培養(yǎng)基還具有其他本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基組分，例如胎牛血清、L-谷氨酰胺、維生素C、青霉素、鏈霉素等。一種制備本發(fā)明培養(yǎng)基的方法包括步驟在各種市售的或用常規(guī)方法配制的培養(yǎng)基中加入0.1-1.0ml/ml本發(fā)明的軟骨分化誘導(dǎo)劑。
在本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了一種用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)裝置，它包括以下組件一容器，所述容器內(nèi)盛有培養(yǎng)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液；一隔離裝置，所述隔離裝置將所述容器分割成2個(gè)或多個(gè)隔離的培養(yǎng)單元，并且所述的隔離裝置不能透過(guò)細(xì)胞或細(xì)胞碎片但可以透過(guò)直徑小于0.4微米的大分子物質(zhì)；
一適合培養(yǎng)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液，所述的培養(yǎng)液流動(dòng)于各培養(yǎng)液?jiǎn)卧?；其中，在至少一個(gè)培養(yǎng)單元中含有不低于105個(gè)軟骨細(xì)胞或軟骨組織，并且在至少一個(gè)培養(yǎng)單元中含有不低于105個(gè)干細(xì)胞或干細(xì)胞與生物可降解材料復(fù)合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的隔離裝置是孔徑為0.4-2.0微米的過(guò)濾板。
在另一優(yōu)選例中，所述的軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞來(lái)自同一個(gè)體或同種異體或不同物種。
本發(fā)明提供的誘導(dǎo)劑能有效地在體外模擬軟骨誘導(dǎo)微環(huán)境，其制備過(guò)程對(duì)軟骨細(xì)胞的種屬來(lái)源和取材部位沒(méi)有特別限制，使本發(fā)明所需的軟骨細(xì)胞來(lái)源充足，容易獲取且不必?fù)?dān)心免疫原性等問(wèn)題。使用本發(fā)明提供的誘導(dǎo)劑能有效地誘導(dǎo)干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物向軟骨定向分化或形成組織工程化軟骨組織，該體外軟骨誘導(dǎo)方法操作簡(jiǎn)便，誘導(dǎo)效果確切可靠，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用。


圖1顯示了體外培養(yǎng)8周時(shí)hBMSC-PGA復(fù)合物的大體標(biāo)本；左為誘導(dǎo)組，右為對(duì)照組。
圖2顯示了體外培養(yǎng)8周時(shí)hBMSC-PGA復(fù)合物的HE染色結(jié)果；左為誘導(dǎo)組，右為對(duì)照組。
圖3顯示了體外培養(yǎng)8周時(shí)hBMSC-PGA復(fù)合物的Safranin-O染色結(jié)果；左為誘導(dǎo)組，右為對(duì)照組。
圖4顯示了體外培養(yǎng)8周時(shí)hBMSC-PGA復(fù)合物的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果；左為誘導(dǎo)組，右為對(duì)照組。
圖5顯示了體外培養(yǎng)8周時(shí)hBMSC-PGA復(fù)合物的II型膠原免疫組化染色結(jié)果；左為誘導(dǎo)組，右為對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞可以不直接參與干細(xì)胞的軟骨定向分化或組織工程化軟骨的形成，這樣軟骨細(xì)胞就不會(huì)影響干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨的免疫原性，其來(lái)源也沒(méi)有嚴(yán)格的限制；進(jìn)一步地還發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織的培養(yǎng)液，由于含有軟骨細(xì)胞分泌的可溶性物質(zhì)，可作用于干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物，誘導(dǎo)它們向軟骨定向分化并形成組織工程化軟骨。
具體地，將軟骨細(xì)胞或軟骨組織與干細(xì)胞或干細(xì)胞-材料復(fù)合物置于同一個(gè)培養(yǎng)裝置中，兩者之間通過(guò)一個(gè)過(guò)濾板隔離而不互相接觸，通過(guò)隔離共培養(yǎng)的方式將干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物誘導(dǎo)為軟骨組織；或者應(yīng)用除去了細(xì)胞和細(xì)胞碎片的軟骨細(xì)胞或軟骨組織的培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)因素，或以這些培養(yǎng)液中提取的可溶性物質(zhì)作為誘導(dǎo)因子，同樣成功地將干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物誘導(dǎo)為軟骨組織。
據(jù)此本發(fā)明人建立了一種真正簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、安全、有效而又容易大規(guī)模臨床推廣應(yīng)用的軟骨誘導(dǎo)方案，擺脫了干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨過(guò)程中對(duì)軟骨細(xì)胞來(lái)源的限制，完成了本發(fā)明。
術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)“軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)”指將存在于人或動(dòng)物軟骨組織中的軟骨細(xì)胞通過(guò)酶消化的方法選取出來(lái)并進(jìn)行體外培養(yǎng)的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“接種”指將細(xì)胞均勻分布于三維支架材料上的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建”指體外分離培養(yǎng)種子細(xì)胞，并將細(xì)胞與生物材料混合，通過(guò)體外培養(yǎng)和/或體內(nèi)植入，使細(xì)胞-材料復(fù)合物形成組織工程化組織的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“組織工程化軟骨”指將軟骨細(xì)胞或具有軟骨分化潛能的干細(xì)胞接種于生物可降解材料，通過(guò)體外培養(yǎng)和/或體內(nèi)植入，生物材料部分或全部降解后所形成的軟骨樣組織。
術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”指具有自我更新能力及多向或定向分化潛能的細(xì)胞群體，它們主要存在于人或動(dòng)物的特定組織或胚胎組織中，也可以通過(guò)建立細(xì)胞系而獲得。
術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)”指提供特殊的生化環(huán)境，將具有多向或定向分化能力的干細(xì)胞等細(xì)胞群體轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N功能特性不同的細(xì)胞群體的過(guò)程。
軟骨細(xì)胞本發(fā)明中軟骨細(xì)胞的來(lái)源沒(méi)有特別限制，可以是人或動(dòng)物的軟骨細(xì)胞，可來(lái)源于關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨、耳軟骨、氣管軟骨等各種軟骨組織。一種優(yōu)選的來(lái)源是來(lái)自人或動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨。
分離獲得軟骨細(xì)胞的方法是文獻(xiàn)多次報(bào)道的公認(rèn)方法。一種優(yōu)選的方法是全麻或局麻下無(wú)菌切取軟骨組織，經(jīng)磷酸緩沖液(PBS)清洗后，加入5-10倍軟骨體積的膠原酶溶液(濃度一般在0.5-3mg/ml，以PBS或培養(yǎng)液配制)，37℃恒溫振蕩消化4-20小時(shí)(依軟骨組織的來(lái)源及消化進(jìn)展程度而定)，過(guò)濾收集軟骨細(xì)胞懸液，離心、洗滌、臺(tái)盼藍(lán)染色、顯微鏡下計(jì)數(shù)，原代軟骨細(xì)胞活力一般應(yīng)在80％以上。
軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代方法和培養(yǎng)液也是本領(lǐng)域中熟知的。一種優(yōu)選的方法是將軟骨細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于)1)F-12培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基+5％-20％胎牛血清；2)F-12培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基+5％-20％自體(或異體)人血清；3)F-12/DMEM培養(yǎng)基(1∶1)+2％-20％胎牛血清或人血清。一類(lèi)特別優(yōu)選的軟骨細(xì)胞是體外分離培養(yǎng)的原代-第3代的軟骨細(xì)胞。此時(shí)的軟骨細(xì)胞功能和活力均良好，具有很強(qiáng)的軟骨形成能力，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色證明有II型膠原表達(dá)，RT-PCR及原位雜交檢測(cè)證明有II型膠原及蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表達(dá)。
軟骨組織本發(fā)明所稱的軟骨組織包括軟骨細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合所形成的組織工程化軟骨移植物或組織工程化軟骨。
軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨的方法是本領(lǐng)域中熟知的。一類(lèi)優(yōu)選的方法是將原代-第3代的軟骨細(xì)胞接種到可降解生物材料形成軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物，再進(jìn)行體外培養(yǎng)，使細(xì)胞充分與材料接觸并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)材料被逐漸降解，最終形成軟骨組織。軟骨細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的細(xì)胞接種濃度通常約為1×107/ml至7×107/ml或更高。生物材料的種類(lèi)和來(lái)源沒(méi)有特別限制，一類(lèi)優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復(fù)合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原及其多聚物和混合物等。制備細(xì)胞-材料復(fù)合物時(shí)，以培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，然后與固體性材料混合，其中混合時(shí)培養(yǎng)液與固體性材料的比例也沒(méi)有特別限制，但是以該固體材料所能夠吸附培養(yǎng)液的最大量為準(zhǔn)。當(dāng)支架材料為特殊三維形狀時(shí)，如耳廓或鼻背形，按實(shí)際體積的大小來(lái)進(jìn)行計(jì)算。
軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨的體外培養(yǎng)方法沒(méi)有特別限制，一類(lèi)優(yōu)選的培養(yǎng)方法是置于培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管或生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中可以對(duì)組織工程化軟骨施加各種物理的或化學(xué)的刺激。軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨的體外培養(yǎng)時(shí)間沒(méi)有特別的限制，優(yōu)選的體外培養(yǎng)時(shí)間為3天-6個(gè)月，軟骨組織形成的時(shí)間為1周-8周。
可用于構(gòu)建本發(fā)明組織工程化軟骨的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、聚對(duì)二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽以及各種脫細(xì)胞基質(zhì)等；(c)上述材料的共聚物或復(fù)合型材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料，以及固體材料與可注射性材料的復(fù)合材料。
優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復(fù)合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原等。本發(fā)明中的材料可預(yù)制成各種精確的大小與形狀，以適應(yīng)不同大小和形狀的軟骨組織構(gòu)建。當(dāng)材料為固體型材料時(shí)，可以直接將材料預(yù)制成需要的大小與形狀，也可以通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助及快速成型技術(shù)定制的模型對(duì)材料進(jìn)行精確的塑性。
1誘導(dǎo)劑-誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的物質(zhì)本發(fā)明所稱的誘導(dǎo)劑來(lái)自體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織的培養(yǎng)液，并且可誘導(dǎo)干細(xì)胞(如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞)分化形成軟骨細(xì)胞。
所述的誘導(dǎo)劑是軟骨細(xì)胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(zhì)；或是培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織時(shí)得到的培養(yǎng)液；或是從上述培養(yǎng)液中分離純化得到的，來(lái)自軟骨細(xì)胞和/或軟骨組織分泌的部分或全部可溶性物質(zhì)。這些可溶性物質(zhì)中有些成份是已知的(如胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等)，有些是未知的，但所有來(lái)自軟骨細(xì)胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(zhì)(部分或全部)，只要可用于干細(xì)胞的軟骨定向誘導(dǎo)分化，均屬于本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
制備本發(fā)明所述的誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑，一種優(yōu)選的方法是直接收集培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織時(shí)的培養(yǎng)液；另一優(yōu)選的方法是通過(guò)蛋白質(zhì)濃縮純化的方法從上述培養(yǎng)液中提純出軟骨細(xì)胞和/或軟骨組織分泌的部分或全部可溶性物質(zhì)。
軟骨細(xì)胞或軟骨組織的體外培養(yǎng)時(shí)間沒(méi)有特別限制，當(dāng)培養(yǎng)物為軟骨細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選的體外培養(yǎng)時(shí)間為1天-90天，優(yōu)選的收集培養(yǎng)液時(shí)間為換液后的24小時(shí)-120小時(shí)。當(dāng)培養(yǎng)物為軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化軟骨時(shí)，優(yōu)選的體外培養(yǎng)時(shí)間為3天-180天，優(yōu)選的收集培養(yǎng)液時(shí)間為換液后的24小時(shí)-96小時(shí)。
誘導(dǎo)劑的制備方法將體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織所獲得的培養(yǎng)液進(jìn)行分離(如過(guò)濾或離心)，去除軟骨細(xì)胞和軟骨組織，從而獲得不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液。
一種優(yōu)選的方法是將體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織所獲得的培養(yǎng)液通過(guò)離心進(jìn)行分離，去除軟骨細(xì)胞和軟骨組織，從而獲得不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的濾液。
所述的培養(yǎng)液是培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織1-200天期間所獲得的培養(yǎng)液；更優(yōu)選地，培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的時(shí)間為1天-90天，培養(yǎng)軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化軟骨的時(shí)間為3天-180天。
所述的培養(yǎng)液是在換液后24小時(shí)-150小時(shí)期間獲得的培養(yǎng)液；更優(yōu)選地，當(dāng)培養(yǎng)物為軟骨細(xì)胞時(shí)，收集培養(yǎng)液時(shí)間為換液后的24小時(shí)-120小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)物為軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化軟骨時(shí)，收集培養(yǎng)液時(shí)間為換液后的24小時(shí)-96小時(shí)。
另一個(gè)優(yōu)選的方法是對(duì)獲得的不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液進(jìn)行濃縮和/或干燥，從而制成濃縮的或固態(tài)的誘導(dǎo)劑；或是從所述的不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液中提取純化出軟骨細(xì)胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(zhì)。
干細(xì)胞干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、體外擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域中熟知的。干細(xì)胞的來(lái)源沒(méi)有特別限制，包括人或動(dòng)物的各種間充質(zhì)干細(xì)胞(如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、真皮多潛能干細(xì)胞等)和胚胎干細(xì)胞。一種優(yōu)選的干細(xì)胞是人或動(dòng)物的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSC)，可以通過(guò)骨髓密度梯度離心或全骨髓貼壁培養(yǎng)方法獲得。
生物可降解材料可用于本發(fā)明的組織工程化軟骨的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、聚對(duì)二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽以及各種脫細(xì)胞基質(zhì)等；(c)上述材料的共聚物或復(fù)合型材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料，以及固體材料與可注射性材料的復(fù)合材料。
優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復(fù)合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原等。本發(fā)明中的材料可預(yù)制成各種精確的大小與形狀，以適應(yīng)不同大小和形狀的軟骨組織構(gòu)建。當(dāng)材料為固體型材料時(shí)，可以直接將材料預(yù)制成需要的大小與形狀，也可以通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助及快速成型技術(shù)定制的模型對(duì)材料進(jìn)行精確的塑性。
干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的制備方法也是本領(lǐng)域中熟知的。一種優(yōu)選的制備方法是將干細(xì)胞直接接種到可降解生物材料上。干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的細(xì)胞接種濃度通常約為1×107/ml至7×107/ml或更高。生物材料的種類(lèi)和來(lái)源沒(méi)有特別限制，一類(lèi)優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復(fù)合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原及其多聚物和混合物等。制備細(xì)胞-材料復(fù)合物時(shí)，以培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，然后與固體性材料混合，其中混合時(shí)培養(yǎng)液與固體性材料的比例也沒(méi)有特別限制，但是以該固體材料所能夠吸附培養(yǎng)液的最大量為準(zhǔn)。
干細(xì)胞軟骨定向誘導(dǎo)誘導(dǎo)干細(xì)胞或干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物向軟骨定向分化的方法的主要步驟包括(1)將干細(xì)胞離心形成干細(xì)胞團(tuán)或與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合形成干細(xì)胞-材料復(fù)合物；(2)以軟骨細(xì)胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(zhì)作為誘導(dǎo)因素，誘導(dǎo)干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物向軟骨定向分化。
誘導(dǎo)因素的施加方式?jīng)]有特別限制，以軟骨細(xì)胞或軟骨組織作為誘導(dǎo)因素時(shí)，優(yōu)選的施加誘導(dǎo)因素方式是通過(guò)隔離共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物向軟骨定向分化；以軟骨細(xì)胞或軟骨組織的培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)因素時(shí)，優(yōu)選的施加誘導(dǎo)因素方式是將這些培養(yǎng)液直接作為誘導(dǎo)干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物向軟骨定向分化的培養(yǎng)液；以軟骨細(xì)胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(zhì)部分或全部提取物作為誘導(dǎo)因素時(shí)，優(yōu)選的施加誘導(dǎo)因素方式是將提取物加入到干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)其向軟骨定向分化。
體外誘導(dǎo)的開(kāi)始時(shí)間及持續(xù)時(shí)間也沒(méi)有特別限制，優(yōu)選的開(kāi)始誘導(dǎo)時(shí)間為干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物構(gòu)建完成即刻至28天，優(yōu)選的體外誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為7天-180天。
誘導(dǎo)培養(yǎng)裝置一種常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)裝置是在常用的培養(yǎng)裝置內(nèi)(培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管及生物反應(yīng)器等)加入用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)基，其中含有胎牛血清、L-谷氨酰胺，維生素C，青、鏈霉素等常規(guī)的培養(yǎng)成分(劑量和濃度可參考具體實(shí)施例和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道)和0.1-1.0ml/ml軟骨細(xì)胞或軟骨組織的培養(yǎng)液；或在上述常規(guī)培養(yǎng)成份的基礎(chǔ)上加入一定量的軟骨細(xì)胞或軟骨組織培養(yǎng)液的濃縮液或其可溶性物質(zhì)提取物。
另一種優(yōu)選的培養(yǎng)裝置是使其在原位直接產(chǎn)生誘導(dǎo)物質(zhì)，即通過(guò)隔離共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物向軟骨分化；所述的隔離共培養(yǎng)是指將軟骨細(xì)胞或軟骨組織與干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物置于同一培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)，兩者之間通過(guò)一個(gè)隔離裝置隔離使其互不接觸而培養(yǎng)液可以相互流動(dòng)，軟骨細(xì)胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(zhì)可以通過(guò)擴(kuò)散的方式發(fā)揮誘導(dǎo)作用。所述的裝置包括容器，所述容器內(nèi)盛有培養(yǎng)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液；隔離裝置，所述隔離裝置將所述容器分割成2個(gè)或多個(gè)隔離的培養(yǎng)單元，并且所述的隔離裝置不能透過(guò)細(xì)胞或細(xì)胞碎片但可以透過(guò)直徑小于0.4微米的大分子物質(zhì)；和適合培養(yǎng)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液，所述的培養(yǎng)液流動(dòng)于各培養(yǎng)液?jiǎn)卧?br> 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明提供的誘導(dǎo)方法能有效地誘導(dǎo)干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物向軟骨定向分化或形成組織工程化軟骨組織，這些誘導(dǎo)產(chǎn)物可以用于各種軟骨組織工程相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，也可以用于修復(fù)病人的各種軟骨缺損或軟骨損傷。
(2)以軟骨細(xì)胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(zhì)作為誘導(dǎo)因素，有效地在體外模擬了軟骨誘導(dǎo)微環(huán)境，并避免了以往報(bào)道的誘導(dǎo)方法的諸多不足，如應(yīng)用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)時(shí)因子用量大、種類(lèi)多、價(jià)格昂貴且誘導(dǎo)效果不穩(wěn)定及通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)時(shí)的安全性等。
(3)本發(fā)明的誘導(dǎo)劑制備過(guò)程中雖然應(yīng)用了軟骨細(xì)胞，但軟骨細(xì)胞不直接參與干細(xì)胞的軟骨分化與軟骨形成，對(duì)軟骨細(xì)胞的種屬來(lái)源和取材部位沒(méi)有特別限制，因此，發(fā)明中所需的軟骨細(xì)胞來(lái)源充足，容易獲取且不必?fù)?dān)心免疫原性等問(wèn)題。
(4)軟骨定向誘導(dǎo)劑制備方法簡(jiǎn)單易學(xué)，成本低廉，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用，還可以開(kāi)發(fā)出產(chǎn)業(yè)化的產(chǎn)品。
(5)體外軟骨誘導(dǎo)方法操作簡(jiǎn)便，誘導(dǎo)效果確切可靠，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照文獻(xiàn)報(bào)道的常規(guī)條件，例如實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
實(shí)施例1制備誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑I一、分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物幼豬5頭，體重約10kg，雌雄不限。
實(shí)驗(yàn)方法1.動(dòng)物以氯氨酮10～20mg/kg、阿托品0.5～1mg肌注麻醉誘導(dǎo)及抑制腺體分泌，耳緣靜脈緩慢靜推水合氯醛(10％)1ml/kg或戊巴比妥鈉(2.5％)1ml/kg麻醉；2.常規(guī)消毒鋪巾，無(wú)菌切取膝關(guān)節(jié)軟骨組織，剪成2mm×3mm大小碎片，磷酸鹽緩沖液沖洗兩遍；3.按改良的Klagsbrun法，加入5倍體積的1mg/mlII型膠原酶(Worthington，F(xiàn)reehold，NJ，USA)，置于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化8-12小時(shí)，過(guò)濾，離心；4.沉淀細(xì)胞用PBS洗滌2次，以含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C 50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢查軟骨細(xì)胞活力，一般活力＞85％；5.根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果以2.5×104個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種于培養(yǎng)皿；6.在37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后更換培養(yǎng)液，以后隔日換液；7.當(dāng)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80％以上的融合狀態(tài)時(shí)，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA(PBS配制)消化，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按2.5×104個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種于培養(yǎng)皿，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，隔日換液；8.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)再次達(dá)到80％以上的融合狀態(tài)時(shí)，按上述相同的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直到傳代培養(yǎng)至第3-4代。
二、收集培養(yǎng)過(guò)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液收集體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞過(guò)程中得到的培養(yǎng)液，制得誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑I，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2制備誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑II
一、軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物構(gòu)建(1)聚羥基乙酸(PGA)三維支架制備無(wú)紡PGA纖維購(gòu)自Albany公司(Albany，NY，USA)，真空保存。纖維直徑13-15μm，將PGA纖維精確稱量為20mg/塊，用特制的模具分別壓制成直徑13mm、厚2mm的圓柱體小塊，待形狀固定后，將材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分鐘。PBS沖洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基浸泡10分鐘，吸干后準(zhǔn)備接種細(xì)胞。
(2)軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物構(gòu)建1.單層培養(yǎng)的第一代軟骨細(xì)胞達(dá)到90％匯合時(shí)，應(yīng)用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)；2.2000rpm離心8min使細(xì)胞沉淀，棄去上清液，振蕩分散細(xì)胞；3.按5×107個(gè)細(xì)胞/cm3的密度將軟骨細(xì)胞懸液均勻地接種到支架材料上，每塊支架材料接種細(xì)胞總量約1.5×107個(gè)；4.接種完成后，將細(xì)胞-材料復(fù)合物置于37℃、5％CO2、飽和濕度的環(huán)境中靜態(tài)培養(yǎng)4-5小時(shí)，待細(xì)胞與PGA纖維充分粘附后，補(bǔ)足培養(yǎng)液；5.培養(yǎng)24小時(shí)后首次更換培養(yǎng)液，以后每隔36-48小時(shí)更換培養(yǎng)液，體外持續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月。
二、收集培養(yǎng)過(guò)軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物的培養(yǎng)液收集體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物過(guò)程中得到的培養(yǎng)液，制得誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑II，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3制備誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑III濃縮純化實(shí)施例1和2所獲得的誘導(dǎo)劑I和II，制得誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑III。主要的濃縮純化方法和步驟包括(1)冷凍干燥法濃縮誘導(dǎo)劑I和II將實(shí)施例1和2所獲得的誘導(dǎo)劑I和II轉(zhuǎn)移到玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空冷凍干燥24小時(shí)-48小時(shí)，初步濃縮誘導(dǎo)劑I和II。
(2)鹽析法濃縮沉淀蛋白質(zhì)在上述冷凍干燥法得到的初步濃縮液中加入足量(一般要加入原濃縮液體積2倍以上)的飽和硫酸銨溶液并充分?jǐn)嚢?，直至絮狀的沉淀物不再增加，將混合液體轉(zhuǎn)移至離心管，在3500轉(zhuǎn)/分、4℃條件下離心5分鐘，吸棄上層澄清液體，下層絮狀沉淀物保留繼續(xù)進(jìn)行下一步的純化與濃縮。
(3)透析法除鹽純化蛋白質(zhì)將鹽析法得到的絮狀沉淀物轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，置于3000毫升去離子水中在4℃恒溫室內(nèi)透析24小時(shí)-48小時(shí)，透析期間每隔4小時(shí)更換一次去離子水，除去沉淀物中的大部分鹽離子及小分子物質(zhì)。
(4)冷凍干燥制得誘導(dǎo)劑III將透析后得到的產(chǎn)物再次進(jìn)行冷凍干燥，根據(jù)需要可以制備成高蛋白濃度的濃縮液或凍干粉，即為誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的誘導(dǎo)劑III，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)的分離、培養(yǎng)與hBMSC-材料復(fù)合物構(gòu)建骨髓來(lái)源骨髓取自捐獻(xiàn)者的髂骨，供體年齡5-20歲，無(wú)惡性腫瘤、傳染性疾病及血液系統(tǒng)疾病。
(1)hBMSCs的獲取與培養(yǎng)取材部位局麻，常規(guī)消毒鋪巾，16號(hào)穿刺針于髂前上脊穿刺，抽取骨髓5～8ml，置于肝素化的離心管中。
將抽取的骨髓先后用5ml和1ml一次注射器反復(fù)抽吸數(shù)次，轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，加入少量的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，混勻，3000rpm離心10分鐘，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，注意不要攪動(dòng)下方的沉淀物，重新振蕩混勻，在另一15ml離心管內(nèi)加入新鮮配制的Percoll分離液(Pharmacia公司)，分離液表面輕輕加入上述的骨髓細(xì)胞懸液(體積為分離液的一半)，900g離心30分鐘，此時(shí)離心管內(nèi)液體分為四層第一層主要是血清和少量的培養(yǎng)液，第二層為有核細(xì)胞層，第三層為Percoll分離液，第四層主要是沉淀下來(lái)的紅細(xì)胞。輕輕吸取第二層的有核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，加入適量的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗滌離心二次，沉淀細(xì)胞以含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml的DMEM(Gibco，Gland Island，NY，USA)培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。取少量細(xì)胞懸液用4％乙酸等體積稀釋破壞殘存的紅細(xì)胞，常規(guī)計(jì)數(shù)有核細(xì)胞。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，按2.5×105/cm2的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿。
將接種好的培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48小時(shí)后首次換液，此時(shí)在低倍鏡下可清楚地見(jiàn)到多個(gè)克隆形成。吸除舊培養(yǎng)液，PBS洗滌2-3次，加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)，隔日更換三分之二量的培養(yǎng)液，一般7-9天后可達(dá)到融合狀態(tài)，可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)吸除培養(yǎng)液，以少量PBS洗滌一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA及0.25％胰蛋白酶的PBS)，鏡下見(jiàn)大部分細(xì)胞胞質(zhì)回縮、形態(tài)變圓后，輕輕吸除消化液，加入適量的含血清的DMEM條件培養(yǎng)液中止消化，收集細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)，以1.5×104/cm2細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)。隔日更換三分之二量的培養(yǎng)液，一般4-5天后又可達(dá)到融合狀態(tài)，可繼續(xù)傳代培養(yǎng)或直接用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)例中應(yīng)用的是體外培養(yǎng)第2-3代的細(xì)胞。
(2)PGA三維支架的制作將無(wú)紡PGA纖維(來(lái)源同前)精確稱量為5mg/塊，用特制的模具分別壓制成直徑5mm、厚1.5mm的圓柱體小塊，待形狀固定后，將材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分鐘。PBS沖洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基浸泡10分鐘，吸干后準(zhǔn)備接種細(xì)胞。
(3)hBMSC-材料復(fù)合物構(gòu)建單層培養(yǎng)第2～3代的hBMSCs達(dá)到90％匯合時(shí)，以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。1500rpm離心5min使細(xì)胞沉淀，棄去上清液，振蕩分散細(xì)胞，按5×107個(gè)細(xì)胞/cm3的密度將hBMSCs懸液均勻接種到材料支架上。每塊支架材料接種細(xì)胞總量約2×106-3×106個(gè)細(xì)胞。接種完成后，將細(xì)胞-材料復(fù)合物置于37℃、5％CO2、飽和濕度的環(huán)境中靜態(tài)培養(yǎng)4-5小時(shí)，待細(xì)胞與PGA纖維充分粘附后，補(bǔ)足培養(yǎng)液。培養(yǎng)24小時(shí)后首次更換培養(yǎng)液，以后每36-48小時(shí)換液一次。
實(shí)施例5hBMSC-材料復(fù)合物的誘導(dǎo)培養(yǎng)(1)隔離共培養(yǎng)將接種72小時(shí)后的實(shí)施例4所得的hBMSC-PGA復(fù)合物與實(shí)施例2中所得的軟骨細(xì)胞-PGA復(fù)合物置于同一培養(yǎng)孔內(nèi)共培養(yǎng)，但兩者之間通過(guò)一個(gè)孔徑0.4um的Transwell insert(購(gòu)自Falcon公司)隔離使其互不接觸，軟骨細(xì)胞-PGA復(fù)合物分泌的可溶性物質(zhì)可以通過(guò)擴(kuò)散的方式作用于hBMSC-PGA復(fù)合物。其中含有1到3個(gè)軟骨細(xì)胞-PGA復(fù)合物，含有1到3個(gè)hBMSC-PGA復(fù)合物。為保證營(yíng)養(yǎng)和軟骨細(xì)胞-PGA復(fù)合物分泌的可溶性物質(zhì)濃度，共培養(yǎng)體系每隔36-48小時(shí)半量換液。
(2)以實(shí)施例1所得的誘導(dǎo)劑I作為誘導(dǎo)因素先收集體外培養(yǎng)2天-20天的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，即誘導(dǎo)劑I，離心去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)成份，然后作為條件誘導(dǎo)液，直接用于hBMSC-PGA復(fù)合物的誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)劑I在誘導(dǎo)培養(yǎng)液中的含量為0.7-0.9ml/ml。為保證培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)條件，可以添加10％的胎牛血清，并每24-36小時(shí)全量換液。所有構(gòu)建的復(fù)合物在體外培養(yǎng)或誘導(dǎo)培養(yǎng)4-12周后取材，分別從大體外觀、重量、體積、蛋白多糖含量、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)等方面對(duì)誘導(dǎo)后的hBMSC-PGA復(fù)合物進(jìn)行軟骨特異性相關(guān)的評(píng)價(jià)。
(3)以實(shí)施例2所得的誘導(dǎo)劑II作為誘導(dǎo)因素先收集體外培養(yǎng)3天-28天的軟骨細(xì)胞-PGA復(fù)合物的培養(yǎng)液，即誘導(dǎo)劑II，離心去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)成份，然后作為條件誘導(dǎo)液，直接用于hBMSC-PGA復(fù)合物的誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)劑II在誘導(dǎo)培養(yǎng)液中的含量為0.6-0.8ml/ml。為保證培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)條件，可以添加10％的胎牛血清，并每24-36小時(shí)全量換液。所有構(gòu)建的復(fù)合物在體外培養(yǎng)或誘導(dǎo)培養(yǎng)4-12周后取材，分別從大體外觀、重量、體積、蛋白多糖含量、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)等方面對(duì)誘導(dǎo)后的hBMSC-PGA復(fù)合物進(jìn)行軟骨特異性相關(guān)的評(píng)價(jià)。
(4)以實(shí)施例3所得的誘導(dǎo)劑III作為誘導(dǎo)因素將實(shí)施例3所得的誘導(dǎo)劑III(蛋白濃縮液或凍干粉)直接添加到hBMSC-PGA復(fù)合物的培養(yǎng)液中，使誘導(dǎo)劑III可以直接作用于hBMSC-PGA復(fù)合物。誘導(dǎo)劑III的加入量可根據(jù)其總蛋白含量進(jìn)行計(jì)算，本實(shí)例誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)劑III的含量為2-4毫克/ml。所有構(gòu)建的復(fù)合物在體外培養(yǎng)或誘導(dǎo)培養(yǎng)4-12周后取材，分別從大體外觀、重量、體積、蛋白多糖含量、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)等方面對(duì)誘導(dǎo)后的hBMSC-PGA復(fù)合物進(jìn)行軟骨特異性相關(guān)的評(píng)價(jià)。
為充分證實(shí)軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞-PGA復(fù)合物分泌可溶性因子的軟骨定向誘導(dǎo)作用，本實(shí)例中還特別設(shè)立了幾個(gè)對(duì)照組進(jìn)行證明。主要包括(1)單純應(yīng)用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)hBMSC-PGA復(fù)合物對(duì)照組；(2)以hBMSCs替代上述誘導(dǎo)方法中的軟骨細(xì)胞，應(yīng)用hBMSCs自身分泌的可溶性因子作為誘導(dǎo)因素的對(duì)照組。(3)以人皮膚成纖維細(xì)胞替代軟骨細(xì)胞，應(yīng)用人皮膚成纖維細(xì)胞分泌的可溶性因子作為誘導(dǎo)因素的對(duì)照組。
結(jié)果根據(jù)本實(shí)例的研究結(jié)果，這些對(duì)照組中的hBMSC-PGA復(fù)合物均未形成明顯的軟骨組織，也未檢測(cè)到軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)。
以下代表性地列舉了實(shí)施例5(1)所示的以軟骨細(xì)胞-PGA復(fù)合物分泌的可溶性因子作為誘導(dǎo)因素，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)8周時(shí)的誘導(dǎo)結(jié)果(誘導(dǎo)組)以及與其相對(duì)應(yīng)的以人皮膚成纖維細(xì)胞-PGA復(fù)合物分泌的可溶性因子作為對(duì)照誘導(dǎo)因素(對(duì)照組)的培養(yǎng)結(jié)果。
(a)體外培養(yǎng)8周時(shí)hBMSC-PG A復(fù)合物大體觀察體外培養(yǎng)8周時(shí)，見(jiàn)圖1。
結(jié)果顯示誘導(dǎo)組hBMSC-PGA復(fù)合物能夠保持原有的大小和形狀，呈半透明的乳白色，外觀類(lèi)似軟骨組織，質(zhì)地柔韌并有一定彈性；對(duì)照組hBMSC-PGA復(fù)合物體積明顯縮小，呈不透明的暗黃色，質(zhì)地柔軟無(wú)彈性。
(b)體外培養(yǎng)8周時(shí)hBMSC-PGA復(fù)合物組織學(xué)及免疫組化檢查HE染色體外培養(yǎng)8周時(shí)，見(jiàn)圖2。
結(jié)果顯示誘導(dǎo)組復(fù)合物可見(jiàn)大量典型的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)著色深，PGA纖維已大部分降解，均質(zhì)的軟骨樣組織已基本形成；對(duì)照組復(fù)合物主要為纖維性組織，未見(jiàn)典型的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)。
Safranin-O染色體外培養(yǎng)8周時(shí)，見(jiàn)圖3。
結(jié)果顯示誘導(dǎo)組復(fù)合物Safranin-O染色呈陽(yáng)性，可見(jiàn)大量染成紅色的細(xì)胞外基質(zhì)分布于軟骨陷窩周?chē)?，表明誘導(dǎo)組有大量的軟骨特異性基質(zhì)沉積；
對(duì)照組復(fù)合物未見(jiàn)明顯的紅染基質(zhì)，表明無(wú)明顯的軟骨基質(zhì)沉積。
甲苯胺藍(lán)染色體外培養(yǎng)8周時(shí)，見(jiàn)圖4。
結(jié)果顯示誘導(dǎo)組復(fù)合物甲苯胺藍(lán)染色呈陽(yáng)性，可見(jiàn)大量染成藍(lán)色的細(xì)胞外基質(zhì)分布于軟骨陷窩周?chē)砻髡T導(dǎo)組有大量的軟骨特異性蛋白多糖沉積；對(duì)照組復(fù)合物未見(jiàn)明顯的藍(lán)染基質(zhì)，表明無(wú)明顯的蛋白多糖沉積。
II型膠原免疫組化體外培養(yǎng)8周時(shí)，見(jiàn)圖5。
結(jié)果顯示誘導(dǎo)組復(fù)合物II型膠原免疫組化呈陽(yáng)性，可見(jiàn)大量染成棕黃色的細(xì)胞外基質(zhì)分布于軟骨陷窩周?chē)?，表明誘導(dǎo)組有大量的軟骨特異性II型膠原沉積；對(duì)照組復(fù)合物未見(jiàn)明顯的棕黃基質(zhì)，表明無(wú)明顯的II型膠原沉積。
結(jié)果表明，以軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化軟骨分泌的可溶性因子作為誘導(dǎo)因素，能夠有效地誘導(dǎo)hBMSC-PGA復(fù)合物向軟骨定向分化并最終形成成熟的軟骨樣組織。從附圖中還可以看出，應(yīng)用本發(fā)明所提供的物質(zhì)和方法誘導(dǎo)hBMSC-PGA復(fù)合物形成的組織工程化軟骨具有接近正常軟骨的外觀和組織學(xué)特征，并能分泌大量的軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)和特征性蛋白，誘導(dǎo)效果好。而在應(yīng)用hBMSCs或人皮膚成纖維細(xì)胞替代軟骨細(xì)胞作用的相應(yīng)對(duì)照組中，干細(xì)胞-材料復(fù)合物均明顯縮小，且未形成軟骨特征性的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，也未檢測(cè)到軟骨特異性的細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)。這表明本發(fā)明提供的誘導(dǎo)方法所具有的軟骨定向誘導(dǎo)作用，是軟骨細(xì)胞或軟骨組織所特有的性質(zhì)。當(dāng)然，這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例6-8hBMSC-材料復(fù)合物的誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)施例5(2)-5(4)所示的以實(shí)施例1-3所制得的誘導(dǎo)劑I-III作為誘導(dǎo)因素，誘導(dǎo)hBMSC-材料復(fù)合物軟骨定向分化的誘導(dǎo)結(jié)果(誘導(dǎo)組)以及與其相對(duì)應(yīng)的以人皮膚成纖維細(xì)胞-PGA復(fù)合物作為對(duì)照誘導(dǎo)因素(對(duì)照組)的培養(yǎng)結(jié)果，與實(shí)施例5(1)的結(jié)果相似，表明以培養(yǎng)軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化軟骨的培養(yǎng)液，以及由該培養(yǎng)液濃縮提純的可溶性物質(zhì)作為誘導(dǎo)因素，同樣能夠有效地誘導(dǎo)hBMSC-PGA復(fù)合物向軟骨定向分化并最終形成成熟的軟骨樣組織。
討論發(fā)明人在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)微環(huán)境能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨定向分化并在關(guān)節(jié)軟骨缺損表面形成軟骨組織。根據(jù)這一科學(xué)現(xiàn)象，本發(fā)明人提出假設(shè)軟骨細(xì)胞能夠提供一種軟骨微環(huán)境誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨定向分化。為證實(shí)這一設(shè)想，我們將軟骨細(xì)胞與BMSCs按一定比例混勻，并以此混合細(xì)胞作為種子細(xì)胞，接種到可降解生物支架材料后植入裸鼠皮下或進(jìn)行體外培養(yǎng)，使軟骨細(xì)胞與BMSCs充分接觸并為其提供軟骨微環(huán)境。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)只需少量的軟骨細(xì)胞就能誘導(dǎo)多量的BMSCs向軟骨定向分化并在體內(nèi)外形成成熟的軟骨組織，表明軟骨細(xì)胞能作為一個(gè)良好的綜合誘導(dǎo)因素，為BMSCs向軟骨定向分化提供誘導(dǎo)因子或誘導(dǎo)微環(huán)境。
本發(fā)明所提供的干細(xì)胞軟骨定向誘導(dǎo)物質(zhì)和方法，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的研究和論證，充分證實(shí)了其有效性和實(shí)用性。例如，我們以軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化軟骨作為誘導(dǎo)因素，通過(guò)隔離共培養(yǎng)的方式(軟骨細(xì)胞不再與干細(xì)胞相互接觸，不直接參與干細(xì)胞的軟骨定向分化及組織工程化軟骨形成)，成功地將干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物誘導(dǎo)為軟骨組織。在進(jìn)一步的研究中，我們應(yīng)用軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨的培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)因素，或以這些培養(yǎng)液中提取的蛋白成份作為誘導(dǎo)因素，同樣成功地將干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物誘導(dǎo)為軟骨組織。
本發(fā)明所提供的干細(xì)胞軟骨定向誘導(dǎo)的物質(zhì)和方法，誘導(dǎo)效果穩(wěn)定而特異，這為干細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨并應(yīng)用于臨床軟骨缺損的修復(fù)提供了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)和技術(shù)條件，其所涉及的方法、試劑及誘導(dǎo)產(chǎn)物有希望成為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)或進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為組織工程化軟骨產(chǎn)品。
本發(fā)明為應(yīng)用干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨提供了一個(gè)確實(shí)可行的技術(shù)體系，并提供了其中關(guān)鍵的誘導(dǎo)物質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明提供的誘導(dǎo)方法能有效地誘導(dǎo)干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物向軟骨定向分化或形成組織工程化軟骨組織，這些誘導(dǎo)產(chǎn)物可以用于各種軟骨組織工程相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，也可以用于修復(fù)病人的各種軟骨缺損或軟骨損傷，具有廣闊的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。而且，以軟骨細(xì)胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(zhì)作為誘導(dǎo)因素，有效地在體外模擬了軟骨誘導(dǎo)微環(huán)境，并避免了以往報(bào)道的誘導(dǎo)方法的諸多不足，如應(yīng)用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)時(shí)因子用量大、種類(lèi)多、價(jià)格昂貴且誘導(dǎo)效果不穩(wěn)定；通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)時(shí)的安全性等。
更重要的是，在這一技術(shù)體系中，軟骨細(xì)胞不直接參與干細(xì)胞的軟骨定向分化及組織工程化軟骨形成，而是通過(guò)軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化軟骨分泌的可溶性物質(zhì)作用于干細(xì)胞團(tuán)或干細(xì)胞-材料復(fù)合物，誘導(dǎo)它們向軟骨定向分化并形成組織工程化軟骨，對(duì)軟骨細(xì)胞的種屬來(lái)源和取材部位沒(méi)有特別限制。也就是說(shuō)，本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)方法中，軟骨細(xì)胞不會(huì)影響干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨的免疫原性，其來(lái)源可以是自體、同種異體甚至其它種屬，因此，本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)方法既簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)而又安全、有效，因?yàn)閯?dòng)物來(lái)源的軟骨細(xì)胞很容易得到，只要大量收集這些軟骨細(xì)胞或軟骨組織的培養(yǎng)液，從中提純出由軟骨細(xì)胞或組織工程化軟骨所分泌的可溶性物質(zhì)，即可大規(guī)模地應(yīng)用于干細(xì)胞的軟骨定向分化或組織工程化軟骨構(gòu)建。
此外，本發(fā)明所提供的干細(xì)胞軟骨定向誘導(dǎo)方法操作簡(jiǎn)單易學(xué)，所提供的試劑制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，誘導(dǎo)效果確切可靠，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用。而且本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)方法和試劑也為應(yīng)用干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨并應(yīng)用于臨床軟骨缺損修復(fù)提供了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)和技術(shù)平臺(tái)，其所涉及的方法、試劑及誘導(dǎo)產(chǎn)物很有希望發(fā)展成為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)或進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為組織工程化軟骨相關(guān)產(chǎn)品。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種軟骨分化誘導(dǎo)劑，其特征在于，它具有以下特征(a)可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞；(b)來(lái)自體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織的培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述誘導(dǎo)劑是用以下的制備方法獲得的將體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞或軟骨組織所獲得的培養(yǎng)液進(jìn)行分離，去除軟骨細(xì)胞和軟骨組織，從而獲得不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述的軟骨組織包括軟骨細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合所形成的組織工程化軟骨移植物或組織工程化軟骨。
4.如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述的制備方法還包括步驟對(duì)獲得的不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的溶液進(jìn)行濃縮和/或干燥，從而制成濃縮的或固態(tài)的誘導(dǎo)劑。
5.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述的誘導(dǎo)劑包括軟骨細(xì)胞和/或軟骨組織培養(yǎng)過(guò)程中分泌的可溶性物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述的軟骨細(xì)胞是人或動(dòng)物的軟骨細(xì)胞。
7.一種如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑的用途，其特征在于，用作體外誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)劑。
8.一種誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的方法，其特征在于，包括步驟在適合培養(yǎng)的條件下，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)干細(xì)胞或干細(xì)胞-生物可降解材料的復(fù)合物，所述的復(fù)合物包括干細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的生物可降解材料，且干細(xì)胞在復(fù)合物中的濃度為1×105個(gè)細(xì)胞/克-1×108個(gè)細(xì)胞/克，培養(yǎng)時(shí)間為7天-180天，從而誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。其中，在所述培養(yǎng)液中含有權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑。
9.一種用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，它含有0.1-1.0ml/ml權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑，按未濃縮的軟骨培養(yǎng)液體積計(jì)算。
10.一種用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)裝置，其特征在于，它包括以下組件一容器，所述容器內(nèi)盛有培養(yǎng)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液；一隔離裝置，所述隔離裝置將所述容器分割成2個(gè)或多個(gè)隔離的培養(yǎng)單元，并且所述的隔離裝置不能透過(guò)細(xì)胞或細(xì)胞碎片但可以透過(guò)直徑小于0.4微米的大分子物質(zhì)；一適合培養(yǎng)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液，所述的培養(yǎng)液流動(dòng)于各培養(yǎng)液?jiǎn)卧?；其中，在至少一個(gè)培養(yǎng)單元中含有不低于105個(gè)軟骨細(xì)胞或軟骨組織，并且在至少一個(gè)培養(yǎng)單元中含有不低于105個(gè)干細(xì)胞或干細(xì)胞與生物可降解材料復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的物質(zhì)和方法，它可以有效地將干細(xì)胞誘導(dǎo)為軟骨表型的細(xì)胞或誘導(dǎo)干細(xì)胞－可降解材料復(fù)合物形成組織工程化軟骨。本發(fā)明使組織工程化軟骨構(gòu)建擺脫了軟骨細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題的限制，并且建立了一種真正簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、安全、有效而又容易大規(guī)模推廣應(yīng)用的軟骨誘導(dǎo)方法。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101029303SQ20061002420
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2006年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日
發(fā)明者周廣東, 曹誼林, 劉霞, 劉偉, 崔磊 申請(qǐng)人:上海國(guó)睿生命科技有限公司