專利名稱：乳品中結(jié)核分枝桿菌的pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種乳品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由人結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌所引起，這些病原統(tǒng)稱為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物(或群)。到目前為止，結(jié)核病除了感染人外，還能感染50多種哺乳動(dòng)物和20多種禽類。牛是最敏感的動(dòng)物，牛結(jié)核主要由牛分枝桿菌引起。牛與人類關(guān)系密切，人結(jié)核有10％以上是由牛分枝桿菌引起。因此發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)結(jié)核病的防治非常重視，美國(guó)是世界上第一個(gè)基本消除結(jié)核病的國(guó)家，歐洲的丹麥、比利時(shí)、德國(guó)等國(guó)家也已基本消滅了牛結(jié)核，英國(guó)和法國(guó)處在控制狀態(tài)。
20世紀(jì)80年代以來(lái)結(jié)核病在全球范圍內(nèi)的流行呈急劇回升之勢(shì)，每年約有1000萬(wàn)新發(fā)病人，300萬(wàn)死亡，是單因素所致的感染性疾病中病死率最高者之一。中國(guó)是世界上第二大結(jié)核病病情嚴(yán)重的國(guó)家。據(jù)衛(wèi)生部公布的數(shù)據(jù)，中國(guó)目前有肺結(jié)核病人約450萬(wàn)，其中傳染性肺結(jié)核病人約150萬(wàn)，結(jié)核病患者數(shù)量居世界第二位。中國(guó)每年約有145萬(wàn)新發(fā)病例，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)達(dá)13萬(wàn)，大大超過(guò)其他傳染病死亡人數(shù)的總和。感染過(guò)結(jié)核菌而未發(fā)病者，更多達(dá)5.5億人，占全國(guó)人口的45％。有關(guān)專家預(yù)計(jì)在今后10年，如果不采取適當(dāng)措施，預(yù)計(jì)全國(guó)將新增結(jié)核病患者2000萬(wàn)至3000萬(wàn)人。這將嚴(yán)重威脅廣大人民群眾的身體健康，給國(guó)家和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重制約中國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展。結(jié)核病是一個(gè)古老的人畜共患疾病，但社會(huì)的發(fā)展賦予其流行一些新的特點(diǎn)。隨著牛奶在居民正常飲食中的比重逐漸加大，人的結(jié)核病發(fā)病率也在上升，社會(huì)流行病學(xué)研究顯示二者呈明顯的流行病學(xué)相關(guān)性。
因此，加強(qiáng)食品安全是強(qiáng)化公共衛(wèi)生預(yù)防體系中首要的工作，但長(zhǎng)期以來(lái)中國(guó)乳制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系不健全?，F(xiàn)行原奶的標(biāo)準(zhǔn)非常低，目前中國(guó)的一級(jí)奶標(biāo)準(zhǔn)在多數(shù)國(guó)家都判定為不能作為液態(tài)奶的原料，乳品中結(jié)核菌檢測(cè)尚沒(méi)有行之有效的手段。
基因診斷技術(shù)與其他診斷方法相比具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)1，能從基因水平徹底揭示疾病病原2，能顯著縮短診斷的時(shí)間3，無(wú)需對(duì)組織、器官或細(xì)胞進(jìn)行選擇4，快速準(zhǔn)確、安全可靠，因此在臨床診斷領(lǐng)域已是一項(xiàng)應(yīng)用廣泛的成熟技術(shù)，但在乳品食品安全領(lǐng)域尚未應(yīng)用。
自SARS、禽流感疫情大面積爆發(fā)以來(lái)，PCR檢測(cè)技術(shù)迅速成為或正在成為各級(jí)疾病預(yù)防控制中心主要的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)之一。牛結(jié)核病的早期診斷具有重要的公共衛(wèi)生意義，它可加強(qiáng)食品安全、最大限度地減少人結(jié)核病的新發(fā)病例數(shù)量，提高社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。
牛結(jié)核病可根據(jù)牛群的具體情況采用不同的方法診斷。目前，病牛群以臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷為主，可疑牛群和健康牛群以結(jié)核菌素檢驗(yàn)為主，配合應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室診斷。目前國(guó)內(nèi)外用于診斷牛結(jié)核病的檢測(cè)方法，大體上可分為三大類。第一類是細(xì)菌學(xué)檢查法，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等。結(jié)核菌需要的培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低，已不能滿足現(xiàn)代臨床診斷的需要。第二類是分子生物學(xué)方法，如PCR、基于TaqMan技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR、DNA圖譜等方法，這類方法靈敏度高，特異性好，但目前的常規(guī)PCR方法一般只能檢測(cè)到100mg的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Fabrizio Vitale等(1998年)，建立了活牛結(jié)核診斷的PCR檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)皮內(nèi)反應(yīng)陰性和皮內(nèi)反應(yīng)陽(yáng)性的動(dòng)物。巢式PCR擴(kuò)增獲得IS6110插入序列內(nèi)的182bp的靶序列，該片段克隆并測(cè)序，標(biāo)記以后用于斑點(diǎn)雜交分析。從100頭活牛的不同標(biāo)本來(lái)源(包括淋巴結(jié)吸出物、乳和鼻拭子)中提取結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群DNA并PCR檢測(cè)；從60頭皮內(nèi)反應(yīng)陽(yáng)性的動(dòng)物屠宰以后檢查，并從淋巴結(jié)、肺和乳房組織標(biāo)本中提取DNA作PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果全部陽(yáng)性。以PCR檢測(cè)屠宰動(dòng)物的組織標(biāo)本作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算的對(duì)乳液、淋巴結(jié)樣本的PCR檢測(cè)靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值都是100％，而鼻拭子標(biāo)本的分別是58，100，，00，and 28％。所有檢測(cè)樣本的PCR檢測(cè)靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別是74，100，100，and35％。對(duì)皮內(nèi)反應(yīng)陰性動(dòng)物的淋巴結(jié)吸出物、乳和鼻拭子的PCR檢測(cè)分析顯示，52％的皮內(nèi)反應(yīng)陰性結(jié)果是假陰性。
Srinand Sreevatsan等(2000年)開(kāi)發(fā)了多重PCR擴(kuò)增檢測(cè)平臺(tái)，同時(shí)檢測(cè)牛乳和鼻分泌物標(biāo)本中的牛分枝桿菌和流產(chǎn)布魯氏菌。該系統(tǒng)包括雙重?cái)U(kuò)增種特定的靶序列(流產(chǎn)布魯氏菌BCSP31K基因區(qū)和牛分枝桿菌hsp65基因的重復(fù)序列區(qū))，然后通過(guò)固相探針捕獲雜交擴(kuò)增產(chǎn)物的方法檢測(cè)。在針刺接種正常乳樣的試驗(yàn)中，檢測(cè)靈敏度對(duì)流產(chǎn)布魯氏菌是800CFU當(dāng)量/ml，對(duì)牛分枝桿菌是4CFU當(dāng)量/ml。
Malcolm James Taylor等在2001年首次報(bào)道了使用lightcycler實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)組織中牛分枝桿菌的技術(shù)。檢測(cè)了38頭有結(jié)核體征的病牛，采用核酸序列捕獲的抽提方法從淋巴結(jié)標(biāo)本中提取牛分枝桿菌DNA，產(chǎn)物檢測(cè)使用實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR，結(jié)果與培養(yǎng)和組織病理學(xué)分析的結(jié)果對(duì)照。常規(guī)PCR方法在大約9小時(shí)內(nèi)完成，在28頭培養(yǎng)陽(yáng)性的病牛中可以檢測(cè)出26頭(檢出率93％)，實(shí)時(shí)熒光PCR的方法在30min內(nèi)完成，可以檢測(cè)出28頭中的20頭(檢出率71％)。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)分枝桿菌復(fù)合群的特異性通過(guò)使用SYBR Green 1和一條結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異的Cy5標(biāo)記熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針來(lái)保證。
Janin Stratmann等(2002年)首次報(bào)道了噬菌體顯示技術(shù)在微生物診斷中的應(yīng)用。將噬菌體顯示技術(shù)和多肽媒介的免疫磁珠分離相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種從自然感染副結(jié)核病的奶牛群的乳樣本中選擇性分離副結(jié)核分枝桿菌屬鳥(niǎo)型分枝桿菌種的技術(shù)。從編碼隨機(jī)12-mer多肽的商業(yè)化噬菌體多肽文庫(kù)中分離出9個(gè)特異性結(jié)合副結(jié)核分枝桿菌屬的重組噬菌體。從這9種噬菌體中再篩選出對(duì)副結(jié)核分枝桿菌屬結(jié)合能力強(qiáng)、特異性高的噬菌體Fmp3，F(xiàn)mp3核苷測(cè)序，由核苷序列推導(dǎo)的多肽序列為NYVIHDVPRHPA，化學(xué)合成多肽，其氨基端通過(guò)6碳氨基酸分子連接生物素殘基，該多肽序列記為AMP3。免疫磁珠表面覆蓋FMP3或AMP3之后可以從乳液中捕獲副結(jié)核分枝桿菌分子，以插入序列ISMav2為擴(kuò)增靶序列的PCR結(jié)果顯示這種方法在人工針刺模擬的臨床乳樣本中檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到10個(gè)菌/ml。
第三類是免疫學(xué)方法，如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、ELISA等方法。到目前為止，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的牛結(jié)核病診斷方法只有結(jié)核菌素(PPD)變態(tài)反應(yīng)。但該方法存在很多弊端，除物理和化學(xué)的因素外，更多的是非典型分枝桿菌的干擾，常造成非特異性反應(yīng)的發(fā)生。這是因?yàn)镻PD雖稱為純化蛋白衍生物，但其實(shí)際上是包含有多種抗原成分的混合物，不能鑒別TB感染，鳥(niǎo)型分枝桿菌致敏及BCG免疫產(chǎn)生的DTH應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，提供一種靈敏度更高，便于早期檢測(cè)乳品中結(jié)核分枝桿菌的方法。
本發(fā)明提供了一種乳品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明方法的建立基于TaqMan技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，檢測(cè)的靶序列為引起人和動(dòng)物結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(包括四種結(jié)核分枝桿菌)所特有，特異性引物和特異性探針對(duì)包括土地、不產(chǎn)色、施氏、次要分枝桿菌在內(nèi)的20多種非致病性分枝桿菌和包括禽型、胞內(nèi)、蟾蜍、堪薩斯在內(nèi)的十多種致病性分枝桿菌沒(méi)有S型實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線，其擴(kuò)增曲線為一條水平線?；赥aqMan技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光(real-time)PCR檢測(cè)，關(guān)鍵是在普通PCR的一對(duì)特異性引物基礎(chǔ)上增加了一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針，該探針同樣與病原體核酸特異性結(jié)合，而且結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域的中間。由于熒光PCR本身先進(jìn)的熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和強(qiáng)大的信息處理能力，檢測(cè)靈敏度較常規(guī)PCR電泳檢測(cè)方法有突破性提高，常規(guī)PCR方法一般能檢測(cè)到100ng的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，而熒光PCR能檢測(cè)到0.1ng的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；而且熒光PCR通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，比較標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)標(biāo)本的Ct值，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體核酸的定量。
本發(fā)明的乳品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如下1、材料和方法1.1菌株凍干粉卡介苗由上海市疾病預(yù)防控制中心提供，-20℃保存，按國(guó)家凍干皮內(nèi)注射用卡介苗制造及檢定規(guī)程規(guī)定凍干菌苗菌數(shù)應(yīng)在100萬(wàn)/mg以上，本發(fā)明使用的卡介苗每安瓿瓶5人份，含卡介菌0.2-0.3mg，菌數(shù)應(yīng)在20萬(wàn)以上?？ń槊缂?ml雙蒸水溶解，溶解以后的菌液作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000的稀釋。
1.2模擬臨床乳樣本為檢測(cè)樣本采用50ul梯度濃度的稀釋菌液混入450ul乳液中，乳液使用市售超高溫滅菌純牛奶，各檢測(cè)樣本為溶液A500ul乳液中包含50ul的1∶10稀釋的卡介苗菌液，50ul菌液含菌數(shù)1000以上，終濃度1000個(gè)菌/0.5ml以上，溶液B500ul乳液，卡介苗終濃度100個(gè)菌/0.5ml以上，溶液C500ul乳液，卡介苗終濃度10個(gè)菌/0.5ml以上，溶液D500ul乳液，卡介苗終濃度1個(gè)菌/0.5ml以上。
1.3引物、探針設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中分枝桿菌編碼16sRNA基因和23sRNA基因之間ITS(internaltranscribed spacer)序列，使用OMIGA軟件作序列比較后，使用OLIGO6.0，PRIMER5.0，BEACON軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和特異性探針，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群所特有。引物、探針由上海生工公司合成。
1.4菌株DNA提取對(duì)于不同梯度濃度的卡介苗稀釋菌液，50ul稀釋菌液直接加本發(fā)明人生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌(TB)DNA提取液，100℃15分鐘，13000rpm 2分鐘，即可用來(lái)作PCR擴(kuò)增。因?yàn)橄♂尵撼煞趾?jiǎn)單，直接用TB提取液裂解TB細(xì)胞并收獲，可以相當(dāng)真實(shí)地反映稀釋菌液中的含菌數(shù)量。
對(duì)牛奶中卡介苗(牛分枝桿菌)的DNA提取，選用本發(fā)明人開(kāi)發(fā)的固相柱法提取試劑，其結(jié)構(gòu)包括有Silica材料固定在管底的內(nèi)制備管以及套在內(nèi)制備管上的外離心管。因?yàn)榕Ｈ榈陌橹⑷榈鞍椎榷喾N復(fù)雜成分，普通提取試劑不適于這種復(fù)雜樣本的處理。基于Silica材料的固相提取技術(shù)的主要原理是樣本在高離溶液中裂解釋放核酸，然后結(jié)合到Silica材料上，經(jīng)過(guò)清洗去除細(xì)胞碎片、蛋白或血紅素(臨床樣本中)等雜質(zhì)，然后在低離子強(qiáng)度下核酸從Silica材料上解離釋放到洗脫液中，具體操作步驟是(1)在1980ul LB裂解緩沖液中加入20μl Poly(A)多聚腺嘌呤，混勻后使用。
(2)在裝有500μl樣本的1.5ml離心管中加入500μl預(yù)混有Poly(A)的LB，振蕩混勻，72℃保溫裂解25min。
(3)在上述保溫后的溶液中加入200μl異丙醇，振蕩混勻后轉(zhuǎn)移600ul溶液到柱式制備/離心管中，10,000rpm離心1min后棄濾液。
(4)將剩余的600ul溶液轉(zhuǎn)移到柱式制備/離心管中，10,000rpm離心1min后棄濾液。
(5)在制備管中加入WB洗脫緩沖液500μl，10,000rpm離心1min后棄管底部離心濾液。
(6)13,000rpm離心1min以徹底去除殘余的WB洗脫緩沖液，然后將制備管放置在一新的潔凈離心管中，加入預(yù)先預(yù)熱到72℃的EB 50μl，室溫放置2min。
(7)10,000rpm離心1min收集管底的離心濾液，即為從樣本中分離的核酸洗脫溶液，若為DNA需保存在-20℃、RNA則保存在-70℃冰箱。
1.5實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)在50ul的反應(yīng)體系中，加入7ul提取產(chǎn)物作模板，加混有引物的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)緩沖液30ul，加MgCl25ul，加熒光探針5ul，加混有UNG酶的Taq酶3ul，UNG酶可有效消除PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。在BioRad公司的icycler熒光PCR擴(kuò)增儀的反應(yīng)條件為50℃2min；94℃5min；93℃30sec，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。
在本發(fā)明方法中所述裂解緩沖液和洗脫緩沖液均是常規(guī)使用的緩沖液，可以市售得到。
2、結(jié)果2.1卡介苗稀釋菌液的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果5人份卡介苗加1ml雙蒸水溶解，溶解以后的菌液再作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000的稀釋；各梯度濃度隨機(jī)取50ul菌液3支，記為樣本1、樣本2和樣本3，加50ulTB DNA提取液提取，在BioRad公司的icycler熒光PCR擴(kuò)增儀上反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果(Ct值)見(jiàn)表1，熒光閾值25。
表1 卡介苗稀釋菌液熒光PCR檢測(cè)結(jié)果(Ct值)

2.2模擬臨床乳樣本的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果模擬臨床乳樣本按前述方法配制，包括溶液A，溶液B，溶液C和溶液D四種卡介苗菌梯度濃度的樣本，各濃度樣本都作3份檢測(cè)，記為樣本1、2、3。使用固相柱法試劑提取分枝桿菌DNA，在BioRad公司的icycler熒光PCR擴(kuò)增儀上反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果(Ct值)見(jiàn)表2，卡介苗稀釋菌液與模擬臨床乳樣本的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)在同一次試驗(yàn)中完成，熒光閾值25。
表2 模擬臨床乳樣本熒光PCR檢測(cè)結(jié)果(Ct值)


從表2看出，即使是溶液D(500ul乳液中包含50ul的1∶10000稀釋的卡介苗菌液，50ul菌液含菌數(shù)1以上，終濃度1個(gè)菌/0.5ml以上)，固相柱法提取之后，三個(gè)樣本中僅有一個(gè)沒(méi)有檢測(cè)到。以后，為了反復(fù)驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)。1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000稀釋的卡介苗菌液，理論上分別與溶液A、溶液B、溶液C、溶液D的含菌量相同，但實(shí)際上兩者檢測(cè)樣本不同，卡介苗菌加雙蒸水稀釋的菌液簡(jiǎn)單而且不存在抑制PCR擴(kuò)增成分，模擬臨床乳樣本復(fù)雜并存在抑制PCR擴(kuò)增成分；檢測(cè)方法也不同，用于處理臨床乳樣本的固相柱法試劑在使用的過(guò)程中，由于多次洗脫引起的DNA損失以及硅基質(zhì)吸附的DNA不能完全洗脫引起的損失降低了最終的DNA收獲效率，因此反映在兩者的濃度比較上，模擬臨床乳樣本的Ct值要滯后于卡介苗稀釋菌液的Ct值。
2.3模擬臨床乳樣本的重復(fù)試驗(yàn)完成兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。第一次，對(duì)菌濃度低的溶液C、溶液D重復(fù)實(shí)驗(yàn)，熒光PCR擴(kuò)增前5個(gè)樣本為溶液C的擴(kuò)增體系，Ct值分別為31.0、31.2、31.5、31.2、31.7，后5個(gè)樣本為溶液D的擴(kuò)增體系，Ct值分別為34.5、33.7、34.0、34.1、35.0。
第二次，對(duì)溶液A、溶液B、溶液C和溶液D重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各濃度作4個(gè)檢測(cè)樣本，分別記為樣本1、2、3、4，在熒光PCR擴(kuò)增時(shí)每個(gè)樣本作1個(gè)復(fù)管，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，8個(gè)溶液D的檢測(cè)樣本全部檢測(cè)到，靈敏度達(dá)到100％。
表3 第二次重復(fù)試驗(yàn)的熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果(Ct值)


分析表3結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在較高濃度的溶液A、B、C，各實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性很好，Ct值接近，而在很低濃度的溶液D，由于本身含菌量很少，Ct值之間有一定差異，上表結(jié)果與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，相同濃度的樣本之間Ct值接近，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好。
上述結(jié)果表明本發(fā)明方法在臨床應(yīng)用之后，可以在絲毫不影響牛群正常生產(chǎn)的前提下，達(dá)到牛結(jié)核病監(jiān)測(cè)和早期檢測(cè)的目的，符合現(xiàn)代乳業(yè)的奶牛及奶制品安全生產(chǎn)的需要。
本發(fā)明方法靈敏度高，特異性好，還具有以下特點(diǎn)第一，操作簡(jiǎn)單、快速，分枝桿菌DNA提取和實(shí)時(shí)熒光PCR過(guò)程在3-4個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，符合現(xiàn)代臨床診斷技術(shù)的需要。第二，取樣方便，取奶牛乳液進(jìn)行檢測(cè)，未對(duì)奶牛造成侵入性傷害或應(yīng)激反應(yīng)。第三，應(yīng)用廣泛，除用于牛結(jié)核病診斷外，檢測(cè)乳中結(jié)核分枝桿菌具有重要的食品安全意義，由于具備早期診斷的特點(diǎn)，有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式例1 臨床牛乳樣本的熒光PCR檢測(cè)結(jié)果將10例臨床牛乳結(jié)核陽(yáng)性標(biāo)本采用固相柱法試劑提取分枝桿菌DNA，在BioRad公司的icycler熒光PCR擴(kuò)增儀上反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果詳見(jiàn)表4，熒光閾值為25。
表4 臨床樣本熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果(Ct值)

從表4看出，10例臨床陽(yáng)性樣本中有1例沒(méi)有被檢出，但這1例未檢出樣本可能是因?yàn)闃颖局芯鷶?shù)比較少，如同模擬臨床乳樣本低濃度一樣，處理臨床乳樣本的固相柱法試劑在使用的過(guò)程中，由于多次洗脫引起的DNA損失以及硅基質(zhì)吸附的DNA，不能完成洗脫引起的損失降低了最終的DNA收獲效率，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
例2 臨床牛乳陽(yáng)性樣本的熒光PCR檢測(cè)特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用乙肝病毒DNA，沙門(mén)氏菌DNA，志賀氏菌DNA，大腸桿菌DNA以及人乳頭瘤病毒DNA等各種臨床陽(yáng)性標(biāo)本提取物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)(濃度皆大于104copies/μL)，均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，與陰性對(duì)照結(jié)果相同，僅臨床牛乳陽(yáng)性標(biāo)本DNA有擴(kuò)增信號(hào)。
表5.臨床陽(yáng)性樣本的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

例3 臨床牛乳結(jié)核陽(yáng)性樣本采用不同PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)的結(jié)果采用臨床牛乳結(jié)核陽(yáng)性標(biāo)本通過(guò)對(duì)該檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化(包括反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化)，并在不同熒光PCR擴(kuò)增儀(PE5700、PE7000、Lightcyler、iCycle、SLAN等熒光PCR擴(kuò)增儀)上擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果的Ct值見(jiàn)表6。
表6.臨床陽(yáng)性樣本的不同PCR擴(kuò)增儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Ct值)

。
權(quán)利要求
1.一種乳品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法其特征在于該方法包括下列步驟(1)材料和方法菌株凍干粉卡介苗由上海市疾病預(yù)防控制中心提供，-20℃保存，按國(guó)家凍干皮內(nèi)注射用卡介苗制造及檢定規(guī)程規(guī)定凍干菌苗菌數(shù)應(yīng)在100萬(wàn)/mg以上，本發(fā)明使用的卡介苗每安瓿瓶5人份，含卡介菌0.2-0.3mg，菌數(shù)應(yīng)在20萬(wàn)以上，卡介苗加1ml雙蒸水溶解，溶解以后的菌液作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000的稀釋；模擬臨床乳樣本為檢測(cè)樣本采用50ul梯度濃度的稀釋菌液混入450ul乳液中，乳液使用市售超高溫滅菌純牛奶，各檢測(cè)樣本為溶液A500ul乳液中包含50ul的1∶10稀釋的卡介苗菌液，50ul菌液含菌數(shù)1000以上，終濃度1000個(gè)菌/0.5ml以上，溶液B500ul乳液，卡介苗終濃度100個(gè)菌/0.5ml以上，溶液C500ul乳液，卡介苗終濃度10個(gè)菌/0.5ml以上，溶液D500ul乳液，卡介苗終濃度1個(gè)菌/0.5ml以上；引物、探針設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中分枝桿菌編碼16sRNA基因和23sRNA基因之間ITS(internaltranscribed spacer)序列，使用OMIGA軟件作序列比較后，使用OLIGO6.0，PRIMER5.0，BEACON軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和特異性探針，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群所特有，引物、探針由上海生工公司合成；菌株DNA提取對(duì)于不同梯度濃度的卡介苗稀釋菌液，50ul稀釋菌液直接加自產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌DNA提取液，100℃15分鐘，13000rpm 2分鐘，即可用來(lái)作PCR擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)在50ul的反應(yīng)體系中，加入7ul提取產(chǎn)物作模板，加混有引物的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)緩沖液30ul，加MgCl25ul，加熒光探針5ul，加混有UNG酶的Taq酶3ul，UNG酶可有效消除PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，在BioRad公司的icycler熒光PCR擴(kuò)增儀的反應(yīng)條件為50℃2min；94℃5min； 93℃30sec，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于其中所述步驟(1)中的菌株提取方法包括下列步驟(1)在1980ul裂解緩沖液中加入20μl多聚腺嘌呤，混勻后使用；(2)在裝有500μl樣本的1.5ml離心管中加入500μl預(yù)混有多聚腺嘌呤的裂解緩沖液，振蕩混勻，72℃保溫裂解25min；(3)在上述保溫后的溶液中加入200μl異丙醇，振蕩混勻后轉(zhuǎn)移600ul溶液到柱式制備/離心管中，10,000rpm離心1min后棄濾液；(4)將剩余的600ul溶液轉(zhuǎn)移到柱式制備/離心管中，10,000rpm離心1min后棄濾液；(5)在制備管中加入洗脫緩沖液500μl，10,000rpm離心1min后棄管底部離心濾液；(6)13,000rpm離心1min以徹底去除殘余的洗脫緩沖液，然后將制備管放置在一新的潔凈離心管中，加入預(yù)先預(yù)熱到72℃的洗沖緩沖液50μl，室溫放置2min；(7)10,000rpm離心1min收集管底的離心濾液，即為從樣本中分離的核酸洗脫溶液，若為DNA需保存在-20℃、RNA則保存在-70℃冰箱。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)乳品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的方法，為乳品生產(chǎn)中結(jié)核菌檢測(cè)提供了有效手段，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，用于奶牛結(jié)核的早期診斷克服了以往牛結(jié)核PCR檢測(cè)取樣難的缺陷。以乳液中加卡介苗作為模擬臨床檢測(cè)樣本，對(duì)DNA提取方法進(jìn)行改進(jìn)，利用基于TaqMan技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，選擇分枝桿菌編碼16sRNA基因和23sRNA基因之間ITS序列作為擴(kuò)增靶序列。本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)達(dá)到每毫升乳液檢測(cè)10個(gè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度。本發(fā)明方法在乳品安全檢測(cè)、公共衛(wèi)生預(yù)防體系中的人畜共患結(jié)核病防治、奶牛結(jié)核病診斷等領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK101029335SQ20061002423
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2006年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日
發(fā)明者杜明韜, 戴文浦 申請(qǐng)人:上海海登姆生物科技有限公司