專利名稱：組成型大腸桿菌基因工程菌的發(fā)酵工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種組成型大腸桿菌基因工程菌的發(fā)酵方法。
背景技術：
自1932年Fleming發(fā)現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺類抗生素-青霉素G以來，其高效廣譜的抗菌效果使之在臨床中廣泛使用，在其使用過程中許多微生物對青霉素G產(chǎn)生了耐藥性，導致青霉素G對細菌的殺傷力越來越弱，且青霉素G在胃中不穩(wěn)定，為使β-內(nèi)酰胺類抗生素具有新的療效，可在保持其抗菌結構母核的前提下改變其側鏈使其成為對細菌敏感的具有療效不同作用時間不同的抗生素。
青霉素?；窯(AfPGA)能夠催化水解青霉素生成6-APA，還能催化青霉素擴環(huán)后重排酸7-ADCA的形成。6-APA和7-ADCA是抗生素工業(yè)上生產(chǎn)半合成青霉素類抗生素和頭孢霉素類抗生素的重要原料。該酶還能夠催化上述水解反應的逆反應，即在6-APA和7-ADCA母核上連接上去不同的側鏈，生成不同性質的半合成抗生素，因此，青霉素G酰化酶在青霉素工業(yè)上扮演極其重要的角色。
糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；?AfPGA)基因直到1994年(美國專利5695978)才被克隆，通過同源性比較，結果表明糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；富蛱幱谇嗝顾仵；富蜻M化過程的一個獨立分支上。與其他來源的PGA比較，AfPGA的酶學性質有如下特點1 AfPGA對底物具有更高親和力，對青霉素G的Km值比EcPGA(大腸桿菌PGA)低，比BmPGA(巨大芽孢桿菌PGA)低三個數(shù)量級，而其kcat值是所有PGA中最高的表現(xiàn)出很高的。2糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶是青霉素?；讣易逯形ㄒ辉谝患壗Y構中具有鏈內(nèi)二硫鍵的成員，酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均很高。3在手性分子識別能力上AfPGA比EcPGA(大腸桿菌PGA)具有更高得選擇性。4 AfPGA在有機溶劑中表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性，在雙水相催化抗生素母核氨基和苯乙酰胺縮合時其催化效率比EcPGA高出一個數(shù)量級。因此，AfPGA將會在半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)中具有很好的應用前景。
但是，目前在生產(chǎn)上應用的大腸桿菌基因工程菌幾乎都是誘導型表達系統(tǒng)，包括生產(chǎn)不同來源青霉素?；傅墓こ叹@類表達系統(tǒng)通過溫度誘導、化學誘導劑等誘導外源蛋白的表達，存在一些不利之處，例如添加價格昂貴的化學誘導劑加大了生產(chǎn)成本，誘導后短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的外源蛋白，容易形成包涵體。一般形成的外源蛋白中50％以上為沒有生物學活性的包涵體蛋白，有的甚至超過80％。形成包涵體蛋白后，需要后續(xù)煩瑣的復性步驟，部分蛋白才能恢復生物學活性，但是復性步驟工作量很大，進一步提高了外源蛋白的生產(chǎn)成本。
盡管組成型大腸桿菌基因工程菌可以克服上述種種缺點，可大大降低成本且防止外源蛋白形成包涵體，但是組成型大腸桿菌基因工程菌中含有質粒的細胞與失去質粒的細胞相比，過重的代謝負擔使得二者的比生長速率相差很大，極易導致培養(yǎng)過程中丟失質粒的細胞成為優(yōu)勢群體，質粒穩(wěn)定性下降，產(chǎn)量降低。由于組成型大腸桿菌基因工程菌發(fā)酵過程優(yōu)化比較困難，本領域人員一般認為組成型表達系統(tǒng)不適合用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
以下對誘導型和組成型兩類表達系統(tǒng)作進一步的對比分析誘導型表達系統(tǒng)①需要添加誘導劑，如IPTG或溫度誘導才能使外源蛋表達；②生長階段和生產(chǎn)階段分離，生長階段菌體不表達外源蛋白，代謝負擔小，在短時間內(nèi)達到高的菌濃，誘導后短時間內(nèi)快速表達外源蛋白，菌體迅速死亡；③含質粒的細胞與失去質粒的細胞之間，比生長速率差別較??；④質粒穩(wěn)定性易于控制；⑤葡萄糖攝取速率高，對葡萄糖濃度的變化不敏感；⑥發(fā)酵周期短。
組成型表達系統(tǒng)①無需誘導；②生長階段和生產(chǎn)階段偶聯(lián)，外源蛋白的表達貫穿于整個發(fā)酵過程，細胞代謝負擔重；③含質粒的細胞與失去質粒的細胞之間，比生長速率差別較大；④質粒穩(wěn)定性不易于控制；⑤葡萄糖攝取速率低，對葡萄糖濃度的變化非常敏感；⑥發(fā)酵周期長。
因此，出于降低生產(chǎn)成本以及提高活性蛋白比例方面的考慮，目前迫切需要開發(fā)一種利用組成型大腸桿菌基因工程菌DH5α/pKKFPGA大規(guī)模生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅姆椒ā?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在發(fā)酵過程中提高大腸桿菌中表達載體穩(wěn)定性的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用組成型大腸桿菌基因工程菌大規(guī)模生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；?AfPGA)的方法，所述的方法通過控制葡萄糖的濃度，從而大大提高了AfPGA的產(chǎn)量。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種在培養(yǎng)時提高大腸桿菌中表達載體穩(wěn)定性的方法，其中，所述的表達載體是質粒，并且在所述質粒的多克隆位點插入了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；副磉_盒，在培養(yǎng)過程中，控制葡萄糖的含量，使葡萄糖濃度為0.05-0.5g/L。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的含有表達載體的大腸桿菌為組成型基因工程菌。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達盒含有與組成型啟動子操作性相連的糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；富?。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，穩(wěn)定攜帶表達載體的大腸桿菌為菌體總量的50-99.9％；更優(yōu)選的，穩(wěn)定攜帶表達載體的大腸桿菌為菌體總量的70-99.9％；最優(yōu)選的，穩(wěn)定攜帶表達載體的大腸桿菌為菌體總量的85-99.9％。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的葡萄糖濃度為0.1-0.3g/L。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中銨離子濃度為0-0.05g/L。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中不含銨鹽。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達載體為不含lac Iq基因的組成型表達載體；在更優(yōu)選的例子中，所述的表達載體包括(但不限于)pKKCAI1、或pKK235。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種利用含有表達載體的大腸桿菌生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅姆椒?，其中，所述的表達載體是質粒，并且在所述質粒的多克隆位點插入了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶基因，所述方法包括在適宜培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基中，控制葡萄糖的含量，使葡萄糖濃度為0.05-0.5g/L。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法包括以下步驟(1)將菌濃為OD6001.5-3(更優(yōu)選的，菌濃為OD6002-2.5)的含有表達載體的大腸桿菌種子培養(yǎng)物以3-20％(更優(yōu)選的為6-14％，如10％)的接種量接入含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并且，所述的培養(yǎng)基中含有0.5-2g/L糊精，20-30g/l蛋白胨和/或酵母抽提物，5-10g/l磷酸鹽，1-3g/l硫酸鎂，0.2-0.6ml/l微量元素；(2)當發(fā)酵液菌濃達到OD6004-6時，流加葡萄糖，并控制發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為0.05-0.5g/L，持續(xù)15-30小時(更優(yōu)選的，為20-25小時)后停止流加；(3)繼續(xù)發(fā)酵15-30小時(更優(yōu)選的，為20-25小時)，結束發(fā)酵，收集糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶產(chǎn)物。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的磷酸鹽為KH2PO4、K2HPO4和/或Na2HPO4(或Na2HPO4·12H2O)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中含有KH2PO41g/L；K2HPO42.5g/L；Na2HPO4·12H2O 3.5g/L；NaCl 0.1g/L；蛋白胨15g/L；酵母抽提物11g/L；糊精1g/L；MgSO4·7H2O 2g/L；微量元素0.4ml/L。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，所述的葡萄糖濃度為0.1-0.3g/L。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中銨離子含量為0-0.1g/L。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中不含銨鹽。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達載體為不含lac Iq基因的組成型表達載體；在更優(yōu)選的例子中，所述的表達載體包括(但不限于)pKKCAI1、或pKK235。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)的溫度為20-40℃；更優(yōu)選的，培養(yǎng)的溫度為25-35℃；最優(yōu)選的，發(fā)酵的溫度為28℃。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了重組質粒pKKFPGA的質粒圖譜。
具體實施例方式
本發(fā)明利用組成型大腸桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；福l(fā)現(xiàn)一種增強組成型大腸桿菌質粒穩(wěn)定性的方法，即通過控制培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度，維持大腸桿菌工程菌較高的質粒穩(wěn)定性，使得含有質粒的大腸桿菌細胞(能夠表達外源蛋白)在發(fā)酵液內(nèi)保持優(yōu)勢群體，從而大大提高了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅陌l(fā)酵單位。基于此完成了本發(fā)明。
如本發(fā)明所用，“組成型大腸桿菌工程菌”指構成表達系統(tǒng)的宿主菌和表達質粒均不含lac Iq基因，不產(chǎn)生阻遏蛋白，不需要IPTG誘導或溫度誘導就可以持續(xù)地表達外源蛋白；其不同于“誘導型大腸桿菌工程菌”。
如本發(fā)明所用，“發(fā)酵”即指培養(yǎng)所述攜帶表達載體(所述載體中含有糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；富?的大腸桿菌，使其生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；?。更特別的，“發(fā)酵”為一種較大規(guī)模的生產(chǎn)過程，如發(fā)酵規(guī)模為0.5-10000升，更特別的，發(fā)酵規(guī)模為0.5-1000升，如發(fā)酵規(guī)?？梢允?升、2升、5升、10升、100升、1000升等。
目前，已知DNA序列，將該目的DNA序列引入到各種已知DNA分子(如載體)和細胞中是本領域中的常規(guī)技術，一般人員只要根據(jù)本發(fā)明的提示，都可以方便的進行操作。此外，將各種形式的突變引入到各種DNA分子中也是本領域熟知的技術。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞也是本領域技術人員熟知的常規(guī)技術。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達目的多肽。
用于生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅慕M成型大腸桿菌可用于生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶的組成型大腸桿菌中，含有至少一個表達載體，所述的表達載體為質粒，并且所述質粒的多克隆位點插入了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶基因，質粒不含有l(wèi)ac Iq基因(不產(chǎn)生阻遏蛋白CI)。
在本發(fā)明中，對用于表達糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅谋磉_載體(質粒)沒有限制，可以是任何適于轉化進入不含lac Iq基因的宿主菌并且表達糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅慕M成型表達載體，包括但不限于pKKCAI1，也可以是pKK235等不含lac Iq基因的組成型表達載體。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，使用一種組成型大腸桿菌基因工程菌DH5α/pKKFPGA(購自中國科學院上海生命科學研究院，或可參考楊志建等，糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶在大腸桿菌中組成型表達及分離純化，生物工程學報，2004，20(5)101-106)。也可采用常規(guī)的技術，將糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；富?GenBank號GI18072028，或可參考美國專利5695978)克隆入pKKCAI1載體的Nco I、HindIII酶切位點，構建重組表達質粒pKKFPGA，其結構如圖1；再通過常規(guī)方法，將質粒pKKFPGA轉化宿主菌DH5α。
用于生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅慕M成型大腸桿菌的培養(yǎng)在培養(yǎng)所述的攜帶表達載體(所述載體中含有糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；富?的大腸桿菌時，采用適合其生長的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基中含有大腸桿菌生長所必須的碳源、氮源、無機鹽、微量元素。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，采用的氮源為蛋白胨和/或酵母抽提物；采用的無機鹽為磷酸鹽、硫酸鹽(如硫酸鎂)，如KH2PO4、K2HPO4和/或Na2HPO4(或Na2HPO4·12H2O)；采用的碳源為糊精、葡萄糖。
本發(fā)明對采用的微量元素沒有限制，可以是目前本領域常用于配制培養(yǎng)基的微量元素。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，本發(fā)明人通過在起始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加少量糊精和適當時候流加葡萄糖溶液(優(yōu)選稀葡萄糖溶液)，控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度在0.05-0.5g/L(更優(yōu)選的，控制葡萄糖濃度在0.1-0.3g/L；最優(yōu)選的，葡萄糖的濃度為0.1g/L左右)，很好地解決了組成型大腸桿菌基因工程菌質粒穩(wěn)定性問題，大大提高了DH5α/pKKFPGA糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅膯挝惑w積發(fā)酵單位(U/L)。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，起始培養(yǎng)基包括前面所述的氮源(蛋白胨、酵母抽提物)、碳源(少量的糊精)、磷酸鹽、微量元素、硫酸鎂。以少量的糊精維持發(fā)酵前期極低的葡萄糖水平(發(fā)酵前期菌體量很少，流加葡萄糖無法維持極低的葡萄糖水平，利用少量糊精達到此目的)，適當?shù)臅r候開始葡萄糖稀溶液的連續(xù)流加，通過低濃度葡萄糖的流加控制殘?zhí)菨舛染S持在0.1g/L左右。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，維持起始培養(yǎng)基中不含或含有極微量(＜0.05g/L)的銨離子，銨離子可以促進細胞淀粉酶的分泌，導致糊精水解加快，不利于維持極低濃度葡萄糖水平，所以在起始培養(yǎng)基中不添加銨鹽。
采用本發(fā)明的方法，培養(yǎng)過程中大腸桿菌中質粒的穩(wěn)定性大大提高。在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，穩(wěn)定攜帶表達載體的大腸桿菌為菌體總量的50-99.9％；更優(yōu)選的，穩(wěn)定攜帶表達載體的大腸桿菌為菌體總量的70-99.9％；最優(yōu)選的，穩(wěn)定攜帶表達載體的大腸桿菌為菌體總量的85-99.9％。由于穩(wěn)定攜帶表達載體的大腸桿菌的數(shù)量大大提高，從而促進了外源蛋白糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶單位體積發(fā)酵單位(U/L)的大大提高。
生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅倪^程控制在本發(fā)明中，提高產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；赴l(fā)酵單位的關鍵步驟在于縮小含質粒細胞(如DH5α/pKKFPGA)和丟失質粒的細胞(如DH5α)比生長速率的差異，從而維持較高的質粒穩(wěn)定性，在此基礎上促進外源蛋白的表達，提高生產(chǎn)產(chǎn)量。具體的，本發(fā)明人從以下方面對生產(chǎn)條件進行了優(yōu)化(1)種子質量控制在本發(fā)明的優(yōu)選例中，從甘油管以1-5％(優(yōu)選2-4％，比如可以是3％)的量將攜帶表達載體(所述載體中含有糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；富?的大腸桿菌接入LB培養(yǎng)基中，于32-40℃(優(yōu)選35-38℃；比如37℃)培養(yǎng)至OD6001.5-3(優(yōu)選OD6002-2.5)，得到種子培養(yǎng)液，然后以3-20％(優(yōu)選6-14％，如以10％的接種量)的量接入發(fā)酵罐中。
種子培養(yǎng)液的菌濃控制至關重要，菌濃過高的狀態(tài)下接種入發(fā)酵罐，往往會導致發(fā)酵前期起始培養(yǎng)基中淀粉酶活性過高，糊精水解速度加快，引起葡萄糖濃度過高，從而促進丟失質粒細胞的生長，質粒穩(wěn)定性下降。因此，本發(fā)明人將種子培養(yǎng)液的菌濃控制在OD6001.5-3(優(yōu)選OD6002-2.5)。
(2)起始發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的控制在起始培養(yǎng)基中，控制葡萄糖的濃度在0.05-0.5g/L(更優(yōu)選的，控制葡萄糖濃度在0.1-0.3g/L；最優(yōu)選的，葡萄糖的濃度為0.1g/L左右)。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，采用稀葡萄糖溶液進行流加，所述的稀葡萄糖溶液中葡萄糖的濃度為80g/L。
發(fā)酵開始的時候，菌體的量很少，通過流加葡萄糖一般不易控制葡萄糖濃度。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，本發(fā)明人利用在起始培養(yǎng)基中添加適量的糊精實現(xiàn)低糖濃度的目的。糊精量過低，盡管穩(wěn)定性很高，但不利于外源蛋白的表達；糊精量過高，會導致發(fā)酵液中葡萄糖積累，濃度超過最佳殘?zhí)菨舛取Ｒ虼?，本發(fā)明人將糊精的用量控制在0.2-3g/L(更優(yōu)選的，糊精的用量為0.5-2g/L)。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，通過加入0.2-3g/L糊精，可以使得在發(fā)酵初期的殘?zhí)菨舛染S持在0.1g/L左右，取得很好的發(fā)酵效果。
(3)葡萄糖流加時機控制在本發(fā)明的優(yōu)選例中，在起始培養(yǎng)基中通過加入少量的糊精來維持低的葡萄糖濃度，之后再流加葡萄糖稀溶液。但是，葡萄糖流加過早，將導致發(fā)酵液中葡萄糖積累，殘?zhí)菨舛瘸^預期值；葡萄糖流加過遲將影響菌體生長，延長發(fā)酵周期，最終降低產(chǎn)量。
因此，本發(fā)明人將流加葡萄糖的時機控制在發(fā)酵10-18小時(更優(yōu)選的，為12-15小時)的時候，或者菌濃為OD6004-6的時候。
(4)葡萄糖流加速率控制在本發(fā)明的優(yōu)選例中，葡萄糖流加速率控制在0.8-1g/Lh，以這樣的速率進行恒速補料的時候，殘?zhí)蔷S持在0.1g/L左右，比生長速率維持在0.06-0.08/h，菌濃每小時增加1 OD600左右。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，為避免葡萄糖濃度振蕩，采取連續(xù)流加的方式。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，葡萄糖的流加總量控制在20g/L左右，或按照氮源的1.2倍左右流加。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，葡萄糖的流加時間控制在20-25小時。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，流加停止后，繼續(xù)發(fā)酵15-30小時(優(yōu)選20-25小時)，結束發(fā)酵，收集糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；府a(chǎn)物。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，采用大腸桿菌基因工程菌DH5α/pKKFPGA菌株生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；?，發(fā)酵末期質粒穩(wěn)定性保持在80％以上，糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；窤fPGA的發(fā)酵單位在5升發(fā)酵罐上達到23000U/L以上，比采用傳統(tǒng)的方法發(fā)酵的產(chǎn)量提高10倍以上。
(5)培養(yǎng)溫度的控制在本發(fā)明中，培養(yǎng)所述的攜帶表達載體(所述載體中含有糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶基因)的大腸桿菌的溫度為20-40℃；更優(yōu)選的，其培養(yǎng)溫度為25-35℃，比如可以是28℃。較低的溫度有利于糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶鏈內(nèi)二硫鍵形成以及酶蛋白前體的跨膜轉運。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)通過在組成型大腸桿菌培養(yǎng)過程中控制葡萄糖濃度、銨離子濃度等，優(yōu)化各項條件，大大提高了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅谋磉_量。采用本發(fā)明的方法，糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶的單位體積發(fā)酵單位超過20000U/L，比采用傳統(tǒng)的方法發(fā)酵的產(chǎn)量提高10倍以上。
(2)與以往采用誘導型大腸桿菌生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶相比，采用本發(fā)明的方法，大大降低了成本，并且大大減少了外源蛋白形成包涵體的量，生產(chǎn)出的糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；妇哂懈叩纳锘钚裕瑹o需進一步的復性等煩瑣操作。因而本發(fā)明克服了以往本領域人員認為組成型表達系統(tǒng)不適合用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的技術偏見。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1 DH5α/pKKFPGA的2.5L規(guī)模的發(fā)酵種子制備從甘油管以3％的接種量將DH5α/pKKFPGA菌株接入含30ml LB培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃，220rpm，培養(yǎng)8h，菌濃達到OD6002.3，得到種子培養(yǎng)物。
發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成如下(每升)KH2PO41g；K2HPO42.5g；Na2HPO4·12H2O3.5g；NaCl 0.05g；蛋白胨10g；酵母抽提物(yeast extract)7.5g；糊精2g；MgSO4·7H2O 2g；微量元素0.4ml。
種子培養(yǎng)物以10％的接種量接入含1L發(fā)酵起始培養(yǎng)基的2.5L發(fā)酵罐，溫度維持在28℃，溶氧保持在40％以上，發(fā)酵至14小時開始恒速流加濃度為0.08g/ml葡萄糖稀溶液，流加速率11ml/h(即0.88g/h)，總共流加250ml，約23h全部補完，殘?zhí)菨舛染S持在0.07-0.14g/L之間。
發(fā)酵至72小時時，糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶AfPGA的發(fā)酵單位達到23000U/L。
實施例2 DH5α/pKKFPGA的5L規(guī)模的發(fā)酵種子制備從甘油管以3％的接種量將DH5α/pKKFPGA菌株接入含30ml LB培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃，220rpm，培養(yǎng)9.5h，菌濃達到OD6002.3，得到種子培養(yǎng)物。
發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成如下(每升)KH2PO41g；K2HPO42.5g；Na2HPO4·12H2O3.5g；NaCl 0.1g；蛋白胨15g；酵母抽提物11g；糊精1g；MgSO4·7H2O 2g；微量元素0.4ml。
種子培養(yǎng)物以10％的接種量接入含2L發(fā)酵起始培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐，溫度維持在28℃，溶氧保持在40％以上，當OD600達到5.0的時候流加0.11g/ml的葡萄糖溶液，流加速率20ml/h(即2.2g/h)，總共流加800ml，35h補完，殘?zhí)菨舛染S持在0.06-0.15g/L之間。
發(fā)酵至65小時時，糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶AfPGA的發(fā)酵單位達到21500U/L。
實施例3利用DH5α/pKK235生產(chǎn)糞產(chǎn)堿青霉素酰化酶將AfPGA基因插入質粒pKK235(參見Li Y，Jiang WH，Yang等，Overproduction and purification of glutaryl 7-amino cephalosporanic acid acylase.Protein Expression and purification，1998，12(2)233-238)的Nco I、HindIII酶切位點，構成帶有AfPGA基因的組成型表達載體，轉入宿主菌DH5α。
將上述構建好的菌株以實施例1的發(fā)酵工藝方法在2.5L發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵至70小時時，糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶AfPGA的發(fā)酵單位達到19500U/L。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種在培養(yǎng)時提高大腸桿菌中表達載體穩(wěn)定性的方法，其中，所述的表達載體是質粒，并且在所述質粒的多克隆位點插入了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；副磉_盒，其特征在于，在培養(yǎng)過程中，控制葡萄糖的含量，使葡萄糖濃度為0.05-0.5g/L。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖濃度為0.1-0.3g/L。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)過程中，銨離子濃度為0-0.05g/L。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的質粒選自pKKCAI1、或pKK235。
5.一種利用含有表達載體的大腸桿菌生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；傅姆椒?，其中，所述的表達載體是質粒，并且在所述質粒的多克隆位點插入了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；富颍涮卣髟谟?，所述方法包括在適宜培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基中，控制葡萄糖的含量，使葡萄糖濃度為0.05-0.5g/L。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將菌濃為OD6001.5-3的含有表達載體的大腸桿菌種子培養(yǎng)物以3-20％的接種量接入含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并且，所述的培養(yǎng)基中含有0.5-2g/L糊精，20-30g/l蛋白胨和/或酵母抽提物，5-10g/l磷酸鹽，1-3g/l硫酸鎂，0.2-0.6ml/l微量元素；(2)當發(fā)酵液菌濃達到OD6004-6時，流加葡萄糖，并控制發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為0.05-0.5g/L，持續(xù)15-30小時后停止流加；(3)繼續(xù)發(fā)酵15-30小時，結束發(fā)酵，收集糞產(chǎn)堿桿菌青霉素?；府a(chǎn)物。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的葡萄糖濃度為0.1-0.3g/L。
8.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基中銨離子含量為0-0.1g/L。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的質粒選自pKKCAI1、或pKK235。
10.如權利要求5所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)的溫度為20-40℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在培養(yǎng)時提高大腸桿菌中表達載體穩(wěn)定性的方法，其中所述的表達載體是質粒，并且在所述質粒的多克隆位點插入了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶基因。本發(fā)明還公開一種利用含有表達載體的大腸桿菌生產(chǎn)糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶的方法。本發(fā)明通過在培養(yǎng)過程中控制葡萄糖濃度、銨離子濃度等，優(yōu)化各項條件，大大提高了糞產(chǎn)堿桿菌青霉素酰化酶的表達量。
文檔編號C12N9/84GK1821386SQ20061002446
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月8日 優(yōu)先權日2006年3月8日
發(fā)明者張嗣良, 儲炬, 茍斌全, 莊英萍, 黃華, 李震, 王永紅 申請人:上海國佳生化工程技術研究中心有限公司, 華東理工大學