專(zhuān)利名稱(chēng)：一種真皮成纖維樣細(xì)胞的培養(yǎng)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程學(xué)中獲得種子細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
種子細(xì)胞是組織工程研究的基礎(chǔ)，從自體組織中獲得成體干細(xì)胞用于組織構(gòu)建是目前研究的熱點(diǎn)。大量研究表明，骨髓、肌肉、脂肪等多種組織含有不同分化程度的多潛能細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后能在體內(nèi)外形成不同組織，并可修復(fù)組織和器官的缺損。
皮膚包含表皮層、真皮層及附屬器等多種結(jié)構(gòu)，表面積巨大，細(xì)胞資源豐富。自皮膚各層中獲得多潛能細(xì)胞的研究已取得一定進(jìn)展，如表皮干細(xì)胞、毛囊外根鞘細(xì)胞等。研究表明，這些細(xì)胞分布于表皮的不同層次中。對(duì)于皮膚的更深層次，如真皮乳頭層、網(wǎng)織層中是否含有間充質(zhì)干細(xì)胞目前尚無(wú)定論。通常認(rèn)為，真皮層普遍存在的成纖維樣細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，無(wú)多向分化潛能，僅參與損傷皮膚的疤痕修復(fù)，這種偏見(jiàn)阻礙了本領(lǐng)域更進(jìn)一步從皮膚獲得種子細(xì)胞的可能性，影響了利用皮膚這一具有豐富細(xì)胞資源的器官的前景。
有報(bào)道稱(chēng)從人出生后的皮膚組織中分離得到多潛能細(xì)胞，但所得到的多潛能細(xì)胞只能形成很少克隆，且未見(jiàn)到這2個(gè)克隆多向分化能力的直接證據(jù)(報(bào)道未出示相關(guān)照片)，不能有效篩選干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞。
因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種方法，通過(guò)這個(gè)方法能獲得來(lái)源于皮膚真皮層的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且所獲得的干細(xì)胞是普通的新鮮細(xì)胞群，能得到較多的克隆(集落)，以便于能準(zhǔn)確而充分地用作組織工程及器官再造技術(shù)的種子細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種獲得真皮成纖維樣細(xì)胞(Dermis derivedfibroblastic cells，DDFCs)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種真皮成纖維樣細(xì)胞及其用途。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種真皮成纖維樣細(xì)胞克隆的制備方法，所述的方法包括步驟(a)用膠原酶消化真皮層組織，得到真皮細(xì)胞；(b)將所述的真皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)液，在適合真皮細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下培養(yǎng)，并在接種后12-72小時(shí)進(jìn)行換液，從而去除非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁細(xì)胞；(c)繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞至匯合度(confluency)為60-99％(更佳地70-95％)，(d)對(duì)貼壁的真皮細(xì)胞進(jìn)行稀釋后，獲得真皮成纖維樣細(xì)胞克隆。
在另一優(yōu)選例中，在步驟a前將去除了皮下組織的皮膚用重量體積百分比為0.01-0.3％的中性蛋白酶消化后去除表皮。
在另一優(yōu)選例中，步驟a中所述的膠原酶為I型膠原酶，含量為0.05-0.3％(w/v)，優(yōu)選0.08-0.2％(w/v)，更優(yōu)選0.1％(w/v)。
在另一優(yōu)選例中，步驟b中在接種后24-48小時(shí)換液，以去除非貼壁細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，步驟b中的細(xì)胞以0.1-3×104/cm2的密度接種后再培養(yǎng)。
在另一優(yōu)選例中，步驟b中的培養(yǎng)液為含5-20％(w/v)胎牛血清的DMEM，優(yōu)選8-15％(w/v)胎牛血清，更優(yōu)選10％(w/v)胎牛血清。
在另一優(yōu)選例中，步驟d中將貼壁的真皮來(lái)源的細(xì)胞經(jīng)有限稀釋后接種于組織培養(yǎng)板(tissue culture dish)上。
在另一優(yōu)選例中，在步驟c和d之間，還包括步驟將貼壁的真皮層細(xì)胞以1000-4000個(gè)/cm2的密度接種，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
在另一優(yōu)選例中，步驟b、c、d中所述的培養(yǎng)板是組織培養(yǎng)板(例如購(gòu)自Falcon Labware，Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)的組織培養(yǎng)板。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，是提供了一種用上述的方法制得的真皮成纖維樣細(xì)胞克隆。
所述的真皮成纖維樣細(xì)胞克隆，其細(xì)胞具有以下特性(i)所述的細(xì)胞不表達(dá)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin)；(ii)具有成骨、成軟骨和/或成脂肪分化能力。
所述的真皮成纖維樣細(xì)胞克隆中3-9％的克隆具有成骨、成脂肪及成軟骨三向分化能力，10-28％的克隆具有雙向分化能力，5-16％的克隆具有單向分化能力，45-80％的克隆不具有上述任何分化能力。
在另一優(yōu)選例中，所述的真皮成纖維樣細(xì)胞中3.5-8％的克隆具有成骨、成脂肪及成軟骨三向分化能力，12-25％的克隆具有雙向分化能力，8-15％的克隆具有單向分化能力，50-70％的克隆不具有上述任何分化能力；更優(yōu)選地，所述的真皮成纖維樣細(xì)胞中6.4％的克隆具有成骨、成脂肪及成軟骨三向分化能力，19.2％的克隆具有雙向分化能力，10.6％的克隆具有單向分化能力，63.8％的克隆不具有上述任何分化能力。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，是提供了用上述制備方法得到的真皮成纖維樣細(xì)胞的用途，它可以用作構(gòu)建組織工程化骨、軟骨或脂肪的種子細(xì)胞。
其中所述的真皮成纖維樣細(xì)胞可用于制備骨移植物、軟骨移植物、脂肪移植物、肌腱移植物、皮膚移植物或注射于體表用于除皺、美容；而所述的移植物可用于治療骨骼疾病、軟骨疾病、脂肪過(guò)少的疾病、肌腱疾病、皮膚疾病或皮膚抗衰老。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明提供的方法能獲得真皮成纖維樣細(xì)胞，能得到較多的克隆(集落)，可用作組織工程及器官再造技術(shù)的種子細(xì)胞。


圖1顯示了DDFCs體外生長(zhǎng)特征，其中A顯示了倒置顯微鏡觀察到的DDFCs貼壁3天后的情況(擴(kuò)大100倍)B顯示了DDFCs體外培養(yǎng)不表達(dá)NestinC顯示了細(xì)胞核PI襯染陽(yáng)性對(duì)照，表達(dá)Nestin(箭頭所示)(擴(kuò)大100倍)D顯示了DDFCs表達(dá)VimentinE顯示了陰性對(duì)照不表達(dá)VimentinF顯示了細(xì)胞核PI襯染陽(yáng)性對(duì)照，表達(dá)Vimentin(擴(kuò)大200倍)；圖2顯示了DDFCs體外生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)特征圖3顯示了常見(jiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)，其中A顯示了免疫熒光檢測(cè)結(jié)果B顯示了流式細(xì)胞(FACS)的檢測(cè)結(jié)果；圖4顯示了油紅染色的結(jié)果，其中左圖顯示了DDFCs成脂肪誘導(dǎo)3周的結(jié)果右圖顯示了未誘導(dǎo)的情況(擴(kuò)大100倍)
右上圖顯示了RT-PCR檢測(cè)PPAR及Leptin的情況；圖5顯示了DDFCs成骨誘導(dǎo)的情況，其中上圖顯示了成骨誘導(dǎo)后7天，BM Purple染色的情況右上圖顯示了RT-PCR檢測(cè)ALP及OCN的情況下圖顯示了成骨誘導(dǎo)4周，ARS染色顯示鈣化結(jié)節(jié)形成的情況(擴(kuò)大100倍)；圖6顯示了DDFCs成軟骨誘導(dǎo)的情況，其中上圖顯示了誘導(dǎo)組表達(dá)蛋白多糖基質(zhì)的情況(Safranin’O染色)及未誘導(dǎo)組無(wú)蛋白多糖基質(zhì)表達(dá)的情況下圖顯示了micromass培養(yǎng)后誘導(dǎo)組表達(dá)II型膠原、未誘導(dǎo)組無(wú)II型膠原表達(dá)的情況右上圖顯示了RT-PCR檢測(cè)Aggrecan及II型膠原基因表達(dá)的情況；圖7顯示了DDFCs克隆體外多向誘導(dǎo)的情況，其中A，O，C，分別代表成脂肪(Adipogenic)、成骨(Osteogenic)、成軟骨(Chondrogenic)三種分化方向，Neg為無(wú)上述分化能力的克?。粓D8顯示了典型的三向分化克隆，其中上圖表示Clone 96A14，中圖表示Clone 96A29，下圖表示Clone 96A33。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一種新的真皮干細(xì)胞的富集、培養(yǎng)方法，它通過(guò)早期換液、去除非帖壁細(xì)胞，低密度接種、傳代培養(yǎng)，然后在組織培養(yǎng)皿(tissue culture dishes)上，得到能夠克隆化生長(zhǎng)的細(xì)胞群，該細(xì)胞群可以全面反映所得到的真皮干細(xì)胞的分化能力和方向。
本文所稱(chēng)的真皮干細(xì)胞同真皮成纖維樣細(xì)胞可以互換使用。
細(xì)胞培養(yǎng)本發(fā)明的真皮成纖維樣細(xì)胞可以通過(guò)常規(guī)的方法獲得。一種優(yōu)選的方法是(a)用I型膠原酶消化真皮全層得到細(xì)胞；(b)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，換液，去除非貼壁細(xì)胞，得到貼壁的真皮層細(xì)胞；
(c)將貼壁的真皮來(lái)源的細(xì)胞有限稀釋后接種，得到真皮成纖維樣細(xì)胞克隆。
步驟a前可以用常規(guī)的方法去除皮下組織后去除表皮層，一種優(yōu)選的方法是用重量體積百分比為0.01-0.3％的中性蛋白酶消化后去除表皮。
步驟b中可以用常規(guī)的方法培養(yǎng)細(xì)胞，一種優(yōu)選的方法是用含5-20％(w/v)胎牛血清(FCS)DMEM培養(yǎng)液，所述的培養(yǎng)液中還可以含有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，(如，F(xiàn)GF)。
可以用常規(guī)的方法去除非貼壁細(xì)胞，一種優(yōu)選的方法是在接種后24-48小時(shí)換液，每3天換液一次。
所得的貼壁細(xì)胞1000-4000個(gè)/cm2的密度接種、傳代培養(yǎng)，優(yōu)選3000個(gè)/cm2的密度，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后以0.25％胰酶(含lmM EDTA)消化、并持續(xù)傳代。
真皮成纖維樣細(xì)胞本發(fā)明提供的真皮成纖維樣細(xì)胞是用上述的方法培養(yǎng)獲得的，所述的真皮成纖維樣細(xì)胞，不表達(dá)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin)，可以用作構(gòu)建組織工程化骨、軟骨或脂肪的種子細(xì)胞；可以用于制備骨移植物、軟骨移植物、脂肪移植物、肌腱移植物或皮膚移植物；可以用于治療骨骼疾病、軟骨疾病、脂肪過(guò)少的疾病、肌腱疾病或皮膚疾病，治療中可直接注入所述的真皮成纖維樣細(xì)胞，或含有上述真皮成纖維樣細(xì)胞的組合物。
所述的骨移植物、軟骨移植物、脂肪移植物、肌腱移植物或皮膚移植物包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；和(b)用上述的培養(yǎng)方法所獲得的真皮成纖維樣細(xì)胞。所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料包括(但并不限于)(i)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚對(duì)二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(ii)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細(xì)胞基質(zhì)；
(iii)可注射性材料，如Pluronic(一種市售的聚環(huán)氧乙丙烯商品)、藻酸鈣凝膠等；(iv)上述材料的混合物或復(fù)合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料，以及固體材料與可注射性材料的復(fù)合材料。
真皮成纖維樣細(xì)胞克隆(集落)可以用常規(guī)的方法克隆真皮成纖維樣細(xì)胞，一種優(yōu)選的方法是將細(xì)胞有限稀釋后接種于組織培養(yǎng)板(tissue culture dish)上，所得到的細(xì)胞克隆中3-9％的克隆具有成骨、成脂肪及成軟骨三向分化能力，10-28％的克隆具有雙向分化能力，5-16％的克隆具有單向分化能力，45-80％的克隆不具有上述任何分化能力。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明提供的作為種子細(xì)胞的真皮成纖維樣細(xì)胞取材廣泛，資源豐富；2、本發(fā)明的克隆方法獲得的真皮成纖維樣細(xì)胞集落多，可充分反映其各種特性，便于準(zhǔn)確利用；3、方法重復(fù)性高，成本低廉。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)RNAzol(Biotecx Lab.Inc.，Houston，TX)抽提得到細(xì)胞總RNA后，以其為模版合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Biotech公司，具體步驟參見(jiàn)其說(shuō)明書(shū)。cDNA經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)擴(kuò)增，詳見(jiàn)Gronthos等人的文獻(xiàn)(Gronthos S.，Zannettino A.C.，Hay S.J.，et al.Molecular and cellular characterisation of highly purifiedstromal stem cells derived from human bone marrow.J.Cell Science 2003；116(9)1827-1835.)。反應(yīng)產(chǎn)物于1％Agarose凝膠中電泳，經(jīng)溴乙啶顯色后觀察。β-actin作為內(nèi)參照，引物購(gòu)自上海寶生物工程公司。
表1PCR引物序列

實(shí)施例1培養(yǎng)獲得真皮成纖維樣細(xì)胞1.取包皮環(huán)切術(shù)剩余之皮膚，PBS充分振洗后去除皮下組織，并剪至2×2mm2大??；2.0.1％(w/v)的中性蛋白酶4℃消化過(guò)夜后揭去表皮層，繼以0.1％(w/v)的I型膠原酶，37℃恒溫振蕩消化4h；3.收集所得細(xì)胞以1×103/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，以含10％FCS高糖DMEM培養(yǎng)液37℃恒溫培養(yǎng)(5％二氧化碳)；4.接種后24-48小時(shí)換液，以去除非貼壁細(xì)胞，每3天換液一次，直至細(xì)胞長(zhǎng)至85％融合后傳代或進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。
實(shí)施例2檢測(cè)一、實(shí)施例1中所得真皮層細(xì)胞以3200個(gè)/cm2的密度接種細(xì)胞培養(yǎng)板中，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后以0.25％胰酶(含1mM EDTA)消化、并持續(xù)傳代至第15代(約97天)；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的觀測(cè)采用MTT法(3-[4，5-dimethylthia-zolyl-2]-2，5-diphenyltetrazolium bromide)，連續(xù)測(cè)定第3天至第12天的平均MTT值，根據(jù)其生長(zhǎng)曲線，評(píng)估出每代DDFCs生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增殖期的時(shí)間(約5-7天)，計(jì)算出最低倍增時(shí)間。具體如下公式倍增時(shí)間＝生長(zhǎng)時(shí)間/倍增次數(shù)；倍增次數(shù)＝(logN1-NO)/log2。
二、免疫熒光檢測(cè)蓋玻片培養(yǎng)的真皮層細(xì)胞及各種對(duì)照組細(xì)胞均在完全貼壁、生長(zhǎng)良好后終止培養(yǎng)，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。所采用的一抗為鼠抗人Vimentin及Nestin(購(gòu)自Santa Cruze，美國(guó))單克隆抗體，經(jīng)丙酮固定、綿羊血清封閉，單克隆抗體(1∶200)4℃過(guò)夜孵育、羊抗鼠二抗(IgG-FITC)反應(yīng)、PI襯染后甘油封片，熒光顯微鏡觀察。
三、FACS檢測(cè)為檢測(cè)常見(jiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，真皮層被收集后進(jìn)行了FACS檢測(cè)，具體步驟參見(jiàn)Zuk等人的文獻(xiàn)(Zuk P.A.，Zhu M.，Mizuno H.，et al.Multilineage cells from human adipose tissueimplications forcell-based therapies.Tisssue Eng.2001；7(2)211-228.)。所用的抗體包括鼠抗人IgGCD13-FITC，CD14-FITC，CD29-FITC，CD34-FITC，CD44-FITC，CD45-FITC，CD54-FITC，CD58-FITC，CD133-FITC，CD166-FITC，CD49d-PE，CD105-PE，CD106-PE(購(gòu)自Santa Cruze，美國(guó))；鼠抗人IgMStro-1及其二抗(購(gòu)自Santa Cruze，美國(guó))。標(biāo)記后的細(xì)胞同時(shí)經(jīng)過(guò)直接的熒光顯微鏡下觀測(cè)及流式細(xì)胞儀(購(gòu)自BD公司，美國(guó))檢測(cè)。
結(jié)果一、真皮成纖維樣細(xì)胞的體外生長(zhǎng)特征經(jīng)膠原酶消化后的真皮層細(xì)胞培養(yǎng)后24小時(shí)見(jiàn)細(xì)胞貼壁。經(jīng)早期換液，去除活力不佳的細(xì)胞以及非貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。3至5天后，鏡下出現(xiàn)大量成纖維樣細(xì)胞(圖1A)。免疫熒光染色顯示這種貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞不表達(dá)Nestin(圖1B-C)，但表達(dá)中胚層來(lái)源的標(biāo)志物Vimentin(圖1D-F)。結(jié)果顯示這種真皮細(xì)胞具有與成纖維細(xì)胞具有相似的外形特征，且能快速貼壁生長(zhǎng)，為真皮成纖維樣細(xì)胞(Dermis-derived Fibroblastic Cells，DDFCs)。
二、真皮成纖維樣細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征DDFCs在體外以接近1∶3的比例傳代至第15代時(shí)，仍然保持旺盛的擴(kuò)增能。傳代過(guò)程中DDFCs的平均倍增時(shí)間未出現(xiàn)明顯的變化，均保持在4天左右，不同代數(shù)的細(xì)胞MTT曲線表現(xiàn)出較為接近的特征(結(jié)果未顯示)，說(shuō)明DDFCs在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征無(wú)明顯變化。計(jì)數(shù)每代細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，并轉(zhuǎn)化成累積倍增數(shù)(Cumulative PopulationDoubling)顯示每次傳代后細(xì)胞分裂了1.7次；更重要的是在傳代的后期，尤其是傳代次數(shù)超過(guò)10次以后，細(xì)胞每代的倍增率仍然維持在相近的水平，未出現(xiàn)下降或減緩的趨勢(shì)。(見(jiàn)圖2)結(jié)果顯示DDFCs在體外能夠長(zhǎng)期傳代、擴(kuò)增，其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征無(wú)明顯變化。
三、真皮成纖維樣細(xì)胞的表面標(biāo)志物的檢測(cè)免疫熒光檢測(cè)顯示DDFCs表達(dá)Stro-1、CD29、CD49d及CD105，但不表達(dá)CD34、CD106、CD133及CD166(圖3A)。
流式細(xì)胞儀分析顯示，常見(jiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物Stro-1、CD29、CD105等都有不同程度的表達(dá)；造血干細(xì)胞的標(biāo)志物CD34、CD133低表達(dá)；另外，DDFCs高表達(dá)CD49d但低表達(dá)CD106的特征又與脂肪干細(xì)胞較相似(圖3B)。
其中Stro-1(12.26％)，CD29(24.42％)，CD49d(37.3％)，CD105(22.08％)CD34(3.04％)，CD106(1.1％)，CD133(0.12％)，CD166(1.31％)。
實(shí)施例3真皮成纖維樣細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)及檢測(cè)實(shí)施例1中，體外培養(yǎng)近融合時(shí)，加入成脂肪誘導(dǎo)液，其中含DMEM培養(yǎng)液，10％FCS，0.5mM異丁基甲基黃嘌呤(isobutyl-methylxanthine)，1μM地塞米松(dexamethasone)，10μM胰島素(insulin)，200μM吲哚美辛(indomethacin)，每3天換液一次。誘導(dǎo)3周后，經(jīng)4％多聚甲醛固定后進(jìn)行油紅(Oil red)染色。為檢測(cè)脂肪相關(guān)基因PPAR-γ2及Leptin的表達(dá)，細(xì)胞總RNA被抽提后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。
結(jié)果DDFCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后3周，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小空泡，油紅染色呈紅色，未誘導(dǎo)組無(wú)油紅著色的細(xì)胞(圖4)；RT-PCR檢測(cè)顯示誘導(dǎo)后2周的細(xì)胞表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性基因PPAR及Leptin(圖4右上圖)，DDFCs經(jīng)脂肪誘導(dǎo)后表達(dá)PPAR及Leptin，未誘導(dǎo)組均無(wú)明顯表達(dá)。
結(jié)果顯示，DDFCs具有向脂肪細(xì)胞分化的能力。
實(shí)施例4真皮成纖維樣細(xì)胞成骨誘導(dǎo)及檢測(cè)實(shí)施例1中，體外培養(yǎng)近融合時(shí)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)，其中誘導(dǎo)條件為DMEM，10％FCS，10mM β-磷酸甘油，10nM維生素D3，0.1μM地塞米松(Dexamethasone)。3周后，經(jīng)0.4％多聚甲醛固定，加入BM Purple(購(gòu)自Roache公司)染色溶液，以檢測(cè)堿性磷酸酶活性(ALP)；以茜素紅(Alizarn Red-Tris-HCL，40Mm，pH4.1)染色鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成；用RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志ALP，OCN的mRNA表達(dá)。
結(jié)果DDFCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)1周后，即可見(jiàn)較多ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞，明顯高于未誘導(dǎo)組；誘導(dǎo)4周后，光鏡下可見(jiàn)局部區(qū)域形成不透光的結(jié)節(jié)，ARS染色呈紅色，說(shuō)明此處有鈣鹽的沉積，而未經(jīng)誘導(dǎo)的DDFCs無(wú)鈣化結(jié)節(jié)形成(圖5)；RT-PCR檢測(cè)顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞ALP及骨鈣蛋白(OCN)的表達(dá)均升高(圖5右上圖)。結(jié)果顯示，DDFCs具有向成骨細(xì)胞分化的能力。
實(shí)施例5真皮成纖維樣細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)及檢測(cè)實(shí)施例1中，體外培養(yǎng)近融合時(shí)，成軟骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)條件為DMEM，10％FCS，10ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)，100ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，0.1μM地塞米松(Dexamethasone)。3周后，4％多聚甲醛固定，Safranin’O染色，鏡下觀察蛋白多糖類(lèi)基質(zhì)。細(xì)胞微團(tuán)塊(micromass)經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)3周后，以4％多聚甲醛固定，進(jìn)行II型膠原的免疫組織化學(xué)檢測(cè)(ABC法)。所用抗體為鼠抗人II型膠原單克隆抗體(購(gòu)自Sigma公司)。用RT-PCR方法檢測(cè)軟骨相關(guān)基因Aggrecan和Collagen II的表達(dá)。
結(jié)果DDFCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后2周，細(xì)胞出現(xiàn)局部聚集生長(zhǎng)，Safranin’O染色呈陽(yáng)性(圖6上)；RT-PCR檢測(cè)顯示誘導(dǎo)分化的細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞相關(guān)基因Aggrecan及II型膠原，明顯高于未誘導(dǎo)組(圖6右上圖)；DDFCs經(jīng)微團(tuán)塊培養(yǎng)3周，可形成乳白色軟骨樣組織，免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示胞外基質(zhì)中存在II型膠原(圖6)。
結(jié)果顯示，DDFCs同樣具有向軟骨細(xì)胞分化的能力。
實(shí)施例6單細(xì)胞克隆的培養(yǎng)、多向誘導(dǎo)及檢測(cè)實(shí)施例1所得的真皮來(lái)源的細(xì)胞經(jīng)有限稀釋后接種至96孔板內(nèi)(tissueculture dish)(2個(gè)/孔)，接種后24小時(shí)標(biāo)記出單個(gè)細(xì)胞存在的孔，3周后將所有單細(xì)胞形成的克隆(＞32細(xì)胞)通過(guò)胰酶消化，傳代至24孔板內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)增。其后，細(xì)胞被相繼轉(zhuǎn)移至6孔板及常規(guī)培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)與擴(kuò)增，并分別進(jìn)行成骨、成脂肪及成軟骨誘導(dǎo)、分化和檢測(cè)，計(jì)算三向、雙向及單向分化克隆的數(shù)量與比例。
結(jié)果DDFCs經(jīng)有限稀釋并在體外培養(yǎng)3周后，部分單個(gè)細(xì)胞增殖形成克隆(大于32個(gè)細(xì)胞)，其中僅有50％左右的克隆能在傳代后繼續(xù)生長(zhǎng)擴(kuò)增，共獲47個(gè)克隆。對(duì)每個(gè)克隆分別進(jìn)行三向誘導(dǎo)分化并進(jìn)行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。(見(jiàn)圖7)結(jié)果顯示所有克隆中，能同時(shí)向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞方向分化的僅3個(gè)克隆，占6.4％；部分克隆僅向2個(gè)方向分化，其中，成脂肪-成骨雙向分化克隆占12.8％，成骨-成軟骨雙向分化克隆占6.4％，未發(fā)現(xiàn)典型的成脂肪-成軟骨雙向分化克?。簧贁?shù)克隆僅檢測(cè)出單一方向的分化能力(成骨單向分化者占8.5％，成脂肪單向分化者占2.1％)；大部分克隆(約占63.8％)未表現(xiàn)出任何明顯的成骨、成軟骨或成脂肪的分化能力。
圖8顯示3個(gè)典型的三向分化克隆同一克隆來(lái)源的細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)成脂肪、成軟骨及成骨誘導(dǎo)，其特征發(fā)生明顯改變。成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞產(chǎn)生脂滴，形成典型的脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)；經(jīng)微團(tuán)塊培養(yǎng)和成軟骨誘導(dǎo)后，產(chǎn)生乳白色質(zhì)韌團(tuán)塊，鏡下可見(jiàn)明顯軟骨陷窩(箭頭所示)及II型膠原表達(dá)；同樣，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞ALP染色呈陽(yáng)性，并出現(xiàn)較多的鈣化物質(zhì)。經(jīng)油紅染色、II型膠原染色、茜素紅染色及ALP染色證實(shí)誘導(dǎo)后分別產(chǎn)生了脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞。
討論創(chuàng)傷后的組織修復(fù)都有一個(gè)共同的物質(zhì)基礎(chǔ)不斷增生的細(xì)胞及新合成的細(xì)胞外基質(zhì)。對(duì)于一種主要由終末分化細(xì)胞構(gòu)成的組織，其細(xì)胞的分裂增生能力有限，因而其自我修復(fù)能力較差，關(guān)節(jié)軟骨便是其中的典型。相反，長(zhǎng)干骨中由于存在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，在損傷時(shí)干細(xì)胞便能迅速擴(kuò)增并分化為成骨細(xì)胞，合成新的類(lèi)骨基質(zhì)并進(jìn)而形成新的骨組織。真皮組織具有較快的創(chuàng)傷后愈合能力，盡管其機(jī)理目前尚未充分了解，但至少終末分化細(xì)胞不是其快速自我修復(fù)的原因。
Toma等人的研究發(fā)現(xiàn)，真皮內(nèi)存在的一種具有向神經(jīng)外胚層及部分中胚層細(xì)胞分化的多潛能細(xì)胞。通過(guò)胰酶消化，并輔以機(jī)械分離，可得到真皮內(nèi)的非貼壁細(xì)胞(Skin derived procusors，SKPs)。這種細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的標(biāo)志物Nestin，并能向神經(jīng)細(xì)胞分化。這種分化甚至在未給予特殊誘導(dǎo)條件便能產(chǎn)生經(jīng)含B-27的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的人SKPs能同時(shí)表達(dá)Nestin及beta3-tubulin，后者是神經(jīng)來(lái)源細(xì)胞的一種標(biāo)志物。將SKPs注射入雞胚胎的神經(jīng)嵴內(nèi)，發(fā)現(xiàn)SKPs能像神經(jīng)嵴細(xì)胞一樣向外周遷徙。這些特征提示SKPs可能就是一種源于真皮層的與神經(jīng)外胚層相關(guān)的干細(xì)胞。本發(fā)明的DDFCs是由膠原酶消化真皮全層所得到的細(xì)胞，與SKPs相反，這些細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)且呈Nestin陰性，表達(dá)中胚層間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記，提示DDFCs與SKPs應(yīng)該屬于兩種不同類(lèi)型的細(xì)胞。
本發(fā)明人從47個(gè)DDFCs單細(xì)胞克隆分析發(fā)現(xiàn)并不是所有的克隆均具有三向分化潛能，僅6.4％(3/47)的克隆具有成骨、成脂肪及成軟骨三向分化能力。除此之外，便是具有部分分化能力的克隆19.2％(9/47)的克隆具有雙向分化能力，10.6％(5/47)的克隆具有單向分化能力。另外還有63.8％的克隆(30/47)不具有上述任何分化能力(至少在體外培養(yǎng)過(guò)程中未檢測(cè)到明顯的分化傾向)。即使考慮到干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)的自發(fā)分化現(xiàn)象，發(fā)明人對(duì)真皮細(xì)胞的克隆分析結(jié)果仍提示，真皮中確實(shí)存在至少可以同時(shí)向三種中胚層細(xì)胞分化的多潛能細(xì)胞。
那么，真皮中的這些多向分化潛能細(xì)胞到底來(lái)自何處，主要有以下幾種可能1)血液循環(huán)中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。幾乎所有的DDFCs均表達(dá)Vimentin，同時(shí)表達(dá)Stro-1，CD13，CD29，CD44，CD54，CD58，CD105等常見(jiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物，不表達(dá)CD34，CD133等造血干細(xì)胞的標(biāo)志物，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有很大的相似之處。但是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞本身含量極低，每105個(gè)細(xì)胞中可能只有1個(gè)干細(xì)胞，而外周血循環(huán)中的含量將更低。DDFCs在體外可有近1％的克隆形成能力，其中近6％的克隆具有多向分化潛能。因此，血液循環(huán)中的骨髓的間充質(zhì)細(xì)胞是真皮內(nèi)干細(xì)胞來(lái)源的可能性極小。2)皮下脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。Zuk等人的研究表明，皮下脂肪層含有間充質(zhì)干細(xì)胞，表達(dá)CD49d，但不表達(dá)CD106，具有很強(qiáng)的成脂肪能力及一定的成骨及成軟骨的能力。但是，真皮來(lái)源的DDFCs與脂肪來(lái)源的細(xì)胞也有著明顯的不同。首先，用于分離DDFCs的真皮組織均認(rèn)真去除了皮下組織，組織學(xué)檢查未見(jiàn)明顯的脂肪結(jié)構(gòu)，RT-PCR檢測(cè)時(shí)亦無(wú)PPAR的表達(dá)，因此從來(lái)源上基本排除了脂肪組織的污染。其次，DDFCs成脂肪能力明顯低于脂肪來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞；最后，部分細(xì)胞表面標(biāo)記，如CD105及CD49d的表達(dá)兩者有較明顯的差別。因此，DDFCs來(lái)源于脂肪組織間充質(zhì)細(xì)胞的可能性很小。3)毛囊乳頭層的真皮細(xì)胞。Jahoda等人的研究表明，毛囊乳頭細(xì)胞(follicle dermal papilla cells，DP cells)具有明顯的雙向分化能力，即成骨及成脂肪的能力。DDFCs的克隆中12.8％具有成骨-成脂肪的雙向分化能力，似乎暗示其與DP cells具有相同的起源。但是，嚙齒類(lèi)動(dòng)物的觸須毛囊結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，DP cells的含量因而較多；而人的包皮組織毛囊很少，甚至在顯微鏡下也很難找到毛囊結(jié)構(gòu)。同時(shí)，DDFCs的克隆中有6％的細(xì)胞具有三向分化能力，DP cells不具備此特性，因此，DDFCs來(lái)源于毛囊乳頭層的可能性也不大。4)原本存在于真皮組織的間充質(zhì)干細(xì)胞。人體內(nèi)大多數(shù)的組織內(nèi)都有與其生長(zhǎng)相關(guān)的組織干細(xì)胞。真皮組織位于人的體表，經(jīng)常受到機(jī)械、物理化學(xué)的傷害，需要不斷進(jìn)行自我修復(fù)，其組織中存在一定量的組織干細(xì)胞，具有一定的合理性，以此本發(fā)明人推斷DDFCs是一群原本存在于真皮組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞。
DDFCs具有向骨、軟骨、脂肪等細(xì)胞分化的潛能，同時(shí)具有在體外長(zhǎng)期傳代擴(kuò)增的能力，而皮膚是人體最大、最表淺的器官，來(lái)源豐富，取材方便，如果能利用它進(jìn)行組織缺損的修復(fù)，它將比骨髓基質(zhì)干細(xì)胞更具優(yōu)勢(shì)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>上海國(guó)睿生命科技有限公司<120>一種真皮成纖維樣細(xì)胞的培養(yǎng)和用途<130>061053<160>12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1ggtcagcggg aaggacttta 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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gccagagttc cttcccttaa 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>12atcatgtttg agaccttcaa 20
權(quán)利要求
1.一種真皮成纖維樣細(xì)胞克隆的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a)用膠原酶消化真皮層組織，得到真皮細(xì)胞；(b)將所述的真皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)液，在適合真皮細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下培養(yǎng)，并在接種后12-72小時(shí)進(jìn)行換液，從而去除非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁細(xì)胞；(c)繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞至匯合度為60-99％；(d)對(duì)貼壁的真皮細(xì)胞進(jìn)行稀釋后，獲得真皮成纖維樣細(xì)胞克隆。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟b中在接種后24-48小時(shí)換液，以去除非貼壁細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟d中將貼壁的真皮來(lái)源的細(xì)胞經(jīng)有限稀釋后接種于組織培養(yǎng)板上。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟c和d之間，還包括步驟將貼壁的真皮層細(xì)胞以1000-4000個(gè)/cm2的密度接種，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
5.一種如權(quán)利要求1所述的方法制得的真皮成纖維樣細(xì)胞克隆。
6.如權(quán)利要求5所述的真皮成纖維樣細(xì)胞克隆，其特征在于，所述的細(xì)胞具有以下特性(i)所述的細(xì)胞不表達(dá)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白；(ii)具有成骨、成軟骨和/或成脂肪分化能力。
7.如權(quán)利要求5所述的真皮成纖維樣細(xì)胞克隆，其特征在于，所述的真皮成纖維樣細(xì)胞克隆中3-9％的克隆具有成骨、成脂肪及成軟骨三向分化能力，10-28％的克隆具有雙向分化能力，5-16％的克隆具有單向分化能力，45-80％的克隆不具有上述任何分化能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法得到的真皮成纖維樣細(xì)胞的用途，其特征在于，用作構(gòu)建組織工程化骨、軟骨或脂肪的種子細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法得到的真皮成纖維樣細(xì)胞的用途，其特征在于，用于制備骨移植物、軟骨移植物、脂肪移植物、肌腱移植物、皮膚移植物或注射于體表用于除皺、美容。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述的移植物用于治療骨骼疾病、軟骨疾病、脂肪過(guò)少的疾病、肌腱疾病、皮膚疾病或皮膚抗衰老。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種真皮成纖維樣細(xì)胞的培養(yǎng)方法，并且公開(kāi)了所獲得的真皮成纖維樣細(xì)胞具有向成骨、成軟骨和成脂肪分化的能力。本發(fā)明還提供了一種獲得該細(xì)胞集落的方法，能獲得多種細(xì)胞克隆。本發(fā)明提供的真皮成纖維樣細(xì)胞可以作為構(gòu)建組織工程化骨、軟骨、脂肪的種子細(xì)胞活用于除皺、皮膚抗衰老及美容領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101033462SQ200610024569
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日
發(fā)明者陳付國(guó), 張文杰, 劉偉, 崔磊, 畢丹, 陳凡凡, 尹爍, 王佳鳴, 魏嫻, 楊光輝, 周廣東, 劉德莉, 曹誼林 申請(qǐng)人:上海國(guó)睿生命科技有限公司