專利名稱：低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗血清的制備方法，尤其涉及一種低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法。
背景技術(shù)：
煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ring spot virus，TRSV)為豇豆花葉病毒科(Comoviridae)線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)成員，病毒粒子為等徑二十面體，直徑約28nm?；蚪M含兩條線形正義ss RNA，RNA1編碼復(fù)制酶，RNA2編碼運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)和外殼蛋白(CP)。分布于日本、澳大利亞、新西蘭、丹麥、法國(guó)、德國(guó)、荷蘭、英國(guó)、美國(guó)等30多個(gè)國(guó)家。該病毒寄主范圍廣，可侵染54科246種植物，是果樹、蔬菜、花卉和經(jīng)濟(jì)作物的重要病害之一。引起多種植物病害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致絕產(chǎn)。
TRSV為我國(guó)進(jìn)境檢疫法規(guī)中明確規(guī)定的危險(xiǎn)性有害生物，寄主范圍廣、適生性強(qiáng)，進(jìn)口植物種子和苗木攜帶該病毒的風(fēng)險(xiǎn)性很大，伴隨著我國(guó)進(jìn)出境貿(mào)易的高速增長(zhǎng)，傳入我國(guó)定植并危害流行的可能性極大。
本試驗(yàn)以TRSV的提純病毒為試驗(yàn)材料，通過分子生物學(xué)方法，克隆TRSV病毒的外殼蛋白部分基因，將其在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，得到純化的重組蛋白，為制備特異性的抗血清奠定了基礎(chǔ)。純化的重組蛋白不含寄主植物成分，所制取的抗血清特異性強(qiáng)。對(duì)一些在寄主體內(nèi)含量較低或較難提純的病毒來講，用傳統(tǒng)的提純病毒制備抗血清十分困難，而用純化的重組蛋白制備抗血清的方法就顯得十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種在血清檢測(cè)中提純低濃度或較難提純的病毒用作檢測(cè)抗原的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法，它包含下列步驟a)將煙草環(huán)斑病毒毒源摩擦接種白肋煙，1-2周后，取除根外的帶毒株進(jìn)行病毒的提純；b)根據(jù)煙草環(huán)斑病毒的5個(gè)分離物的CP基因的保守序列設(shè)計(jì)引物；c)從所述接種煙草環(huán)斑病毒的白肋煙葉片中提取RNA；d)RT-PCR擴(kuò)增煙草環(huán)斑病毒的cDNA片段；e)PCR電泳回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，堿法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切后電泳分析原PCR產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序鑒定；f)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進(jìn)行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組質(zhì)粒；g)將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，挑取單克隆進(jìn)行目的基因的小量表達(dá)；h)挑取單克隆進(jìn)行目的基因的大量表達(dá)；i)將誘導(dǎo)前的樣品、誘導(dǎo)后的樣品和過柱后的樣品分別進(jìn)行純化并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定蛋白純度；j)以煙草環(huán)斑病毒抗血清為一抗，堿性磷酸酯酶標(biāo)記的A蛋白為二抗，用NBT-BCIP顯色，Western-Blot鑒定所提純的蛋白作為抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。
本發(fā)明由于提供了一種新的利用重組技術(shù)和原核表達(dá)技術(shù)對(duì)一些在寄主體內(nèi)含量較低或較難提純的病毒進(jìn)行克隆，制備的方法取得該病毒的抗原，從而使得利用常規(guī)血清學(xué)檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)出這些病毒抗原變?yōu)榭赡堋?br>

圖1是本發(fā)明低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法的TRSV的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖2是本發(fā)明低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法的酶切后測(cè)序結(jié)果比對(duì)結(jié)果；圖3是本發(fā)明低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法的表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析；圖4是本發(fā)明低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
實(shí)施例1TRSV的提純將TRSV毒源摩擦接種白肋煙，1～2周時(shí)間后，取帶毒全株(根除外)進(jìn)行病毒的提純。
選用TRSV接種的白肋煙1000g，按1g葉片加2ml 0.2M PBS(磷酸鹽緩沖液)(pH7.0，含0.1％巰基乙酸)，全部置組織搗碎機(jī)里搗碎，尼龍紗過濾，濾液加入同等體積的氯仿，懸浮攪拌15min后，9000r/min離心15min；上清液加質(zhì)量濃度為8％PEG(聚乙二醇)(分子量6000)，4％NaCl(氯化鈉)，置4℃冰箱懸浮攪拌4h，9000gr/min離心20min；沉淀以0.02M PBS懸浮，置4℃冰箱懸浮攪拌4h或過夜，9000r/min離心15min；將收集的上清液30000r/min離心3h；沉淀懸浮于去離子水中，9000gr/min離心20min，上清液即為病毒粗提液；將上述病毒粗提液經(jīng)25％甘油墊超速離心，即得提純病毒。
實(shí)施例2引物設(shè)計(jì)根據(jù)最新報(bào)道的TRSV 5個(gè)分離物的CP基因(GeneBank登錄號(hào)AF462263、AF461164、AY787756、NC-005096、L09205)的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物TRSV-F5’-CGCGAATTCATGTGTGCTGTGACAGTTGTTCC-3’(下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))和TRSV-R5’-ATCCTCGAGTCCGCTTATAGTGCCAGACCA-3’(下劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn))。
實(shí)施例3病毒RNA提取取0.1g TRSV接種的白肋煙葉片置于液氮中研磨成粉末，加入1000mlTRIZOL(總RNA提取試劑)，迅速轉(zhuǎn)至1.5ml的離心管中，加200μl氯仿，振蕩2min，4℃ 11000r/min離心10min。取上清加入500ml異丙醇，-20℃沉淀10min，4℃12000r/min離心15min，沉淀用75％的乙醇洗一次，4℃7500r/min離心5min，沉淀溶于3μl ddH2O中，即為提取的RNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4RT-PCRcDNA第一鏈合成在20μL體系中進(jìn)行，內(nèi)含3μL模板RNA、1μL AMV(一種反轉(zhuǎn)錄酶)(30U/μL)、1μL RNase(RNA酶)抑制劑(30U/μL)、1μL下游引物(20μmol/L)、2μL dNTP(脫氧核苷三磷酸)(10mmol/L)和5μL5×AMV緩沖液。42℃水浴60min后，分別取2μL合成好的cDNA用于PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min后進(jìn)行94℃變性30sec、55℃復(fù)性30sec、72℃延伸2min的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72℃延伸10min后保存于4℃。
實(shí)施例5PCR產(chǎn)物的克隆和酶切鑒定PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖進(jìn)行電泳，與預(yù)期大小相符的條帶經(jīng)DNA(脫氧核糖核酸)回收試劑盒回收后，進(jìn)行T-A克隆，所用載體為pMD18-T(質(zhì)粒名稱)。并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入500ul LB(LB培養(yǎng)基)，37℃，100rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))45min，取200ul涂布至Amp(氨芐青霉素)板(100ug/ml)，37℃倒置培養(yǎng)過夜，至克隆長(zhǎng)出。挑取白色菌落，堿法小量提取質(zhì)粒，酶切后電泳分析插入片段的大小，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
實(shí)施例6原核表達(dá)載體的構(gòu)建與預(yù)期大小相符的條帶經(jīng)DNA回收試劑盒回收后以EcoR I和Xho I雙酶切后得到744bp(堿基對(duì))的目的基因片段，與經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切的質(zhì)粒pET28a連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選得到重組質(zhì)粒。
實(shí)施例7融合蛋白的小量表達(dá)將構(gòu)建好的pET28a重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(為特定大腸桿菌名稱)。挑取單克隆，加入3ml Kan抗性/LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm，培養(yǎng)過夜。取100μl菌液，加入5ml Kan抗性/LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm，培養(yǎng)3hr，至OD(光密度值)600為0.6。加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至菌液中，終濃度為0.4mM，30℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。取0.8ml菌液離心后棄上清，沉淀備用。SDS-PAGE的濃度為12％，電泳鑒定表明，目的基因已經(jīng)表達(dá)。再按照上述方法進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)10ml，然后收菌。將菌體用3mlPBS重懸，超生10min，功率為200瓦。10000g離心20分鐘，分別回收上清和沉淀。
實(shí)施例8目的基因的大量表達(dá)挑取單克隆，加入20ml Kan(卡那霉素)抗性/LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm，培養(yǎng)過夜。將20ml菌液，加入到1000ml Kan抗性/LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm，培養(yǎng)3hr，至OD 600為0.6。加IPTG至菌液中，終濃度為0.4mM，30℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。10000g，4℃離心10min，棄上清，沉淀備用。
實(shí)施例9表達(dá)蛋白的純化和SDS-PAGE鑒定蛋白純度將誘導(dǎo)前的樣品、誘導(dǎo)后的樣品(包括上清和沉淀)和過柱后的樣品各取20ul分別加入20ul 2×蛋白loading buffer(上樣緩沖液)，將1次洗滌液分別取20ul并加入20ul 2×蛋白loading buffer混勻，蛋白洗脫液各取10ul，加入10ul 2×蛋白loading buffer混勻后，100℃煮5分鐘，12000g離心15分鐘，留取上清做SDS-PAGE。凝膠濃度為12％。
實(shí)施例10Western-Blot鑒定以TRSV抗血清(agdia公司)為一抗，堿性磷酸酯酶標(biāo)記的A蛋白為二抗。最后用NBT/BCIP顯色。分離包涵體，溶解后進(jìn)行SDS-PAGE。按照Hager等的方法對(duì)凝膠染色后，從中切下目標(biāo)條帶，按1∶1的比例(W/V)加入0.85％的生理鹽水，于冰浴中研磨，12000g離心10分鐘，上清經(jīng)0.85％生理鹽水透析過夜，-20℃保存。
實(shí)施例11TRSV CP基因的RT-PCR擴(kuò)增及克隆用設(shè)計(jì)的TRSV CP基因特異性引物TRSV-F和TRSV-R進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳，可見大小744bp的特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期的大小相符，結(jié)果見圖1。其中M為DNA Marker(標(biāo)記)(TaKaRaD2000，1000，750，500，250，100bp)；1，2為TRSV純病毒；3為健康白肋煙；4為空白對(duì)照。
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到pMD18-T載體上。經(jīng)藍(lán)白斑篩選、酶切鑒定和序列測(cè)定，得到了含有目的基因片段的重組子pETCP1-744。
實(shí)施例12重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證對(duì)pETCP1-744用引物TRSV-F和TRSV-R進(jìn)行擴(kuò)增，得到一744bp的條帶，利用GenBank(核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫)中Blast(比對(duì))程序?qū)y(cè)定的序列進(jìn)行比對(duì)，同源性高達(dá)90％以上，結(jié)果證明測(cè)定序列為TRSV的部分序列；對(duì)pETCP1-744進(jìn)行雙酶切，可見一744bp條帶，與預(yù)期大小相符，說明截短的TRSV CP基因(TRSV CP1-744)已連接到pET28a載體上。測(cè)序結(jié)果(見圖2)證明閱讀框架正確。其中AF461163、AF461164、AY787756、NC-005096和L09205為Genbank公布的TRSV 5個(gè)分離物的序列；TRSV-BIAODA為本實(shí)驗(yàn)酶切后測(cè)定的序列。
實(shí)施例13
表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)和Western blot分析將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE后，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，含重組質(zhì)粒的菌株特異的產(chǎn)生了一條分子量為35kDa(千道爾頓)的條帶。此條帶大小與預(yù)期相符(圖3)。其中M為蛋白Marker；1，2為純化的蛋白。Western blot顯示，TRSV抗血清(agdia公司)僅與此35kDa的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)，而與其它條帶之間均無反應(yīng)，表明所表達(dá)的目的基因產(chǎn)物即為截短的TRSV CP基因(TRSV CP1-744)產(chǎn)物。
實(shí)施例14表達(dá)產(chǎn)物的純化及定量對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體反復(fù)凍溶，高速離心后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，證明蛋白得到表達(dá)，但表達(dá)產(chǎn)物主要在沉淀中，即主要以包涵體形式存在。將分離的包涵體電泳后，對(duì)35kDa的條帶切膠、研磨、離心、透析，得到純度較高的表達(dá)產(chǎn)物(圖4)。其中M為蛋白Marker；1為未誘導(dǎo)；2為超聲上清；3為超聲沉淀；4為上清沉淀混合；5為洗液；6～9為分別洗柱1～4次后的誘導(dǎo)產(chǎn)物。
實(shí)施例15表達(dá)產(chǎn)物的ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)選用美國(guó)agdia公司生產(chǎn)的TRSV血清檢測(cè)試劑盒，將表達(dá)的蛋白作為待檢樣品，設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，結(jié)果表達(dá)的蛋白呈較強(qiáng)的陽性反應(yīng)。
序列表<110>上海出入境檢驗(yàn)檢疫局、上海交通大學(xué)、中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部<120>低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法<130>NP-10431<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>32<212>DNA<213>Tobacco Ringspot Virus<400>1CGCGAATTCA TGTGTGCTGT GACAGTTGTT CC32<210>2<211>30<212>DNA<213>Tobacco Ringspot Virus<400>2ATCCTCGAGT CCGCTTATAG TGCCAGACCA 30
權(quán)利要求
1.一種低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法，其特征在于它包含下列步驟a)將煙草環(huán)斑病毒毒源摩擦接種白肋煙，1~2周后，取除根外的帶毒株進(jìn)行病毒的提純；b)根據(jù)煙草環(huán)斑病毒的5個(gè)分離物的外殼蛋白CP基因的保守序列設(shè)計(jì)引物；c)從所述接種煙草環(huán)斑病毒的白肋煙葉片中提取RNA；d)RT-PCR擴(kuò)增煙草環(huán)斑病毒的cDNA片段；e)PCR電泳回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，堿法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切后電泳分析原PCR產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序鑒定；f)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進(jìn)行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組質(zhì)粒；g)將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，挑取單克隆進(jìn)行目的基因的小量表達(dá)；h)挑取單克隆進(jìn)行目的基因的大量表達(dá)；i)將誘導(dǎo)前的樣品、誘導(dǎo)后的樣品和過柱后的樣品分別進(jìn)行純化并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定蛋白純度；j)以煙草環(huán)斑病毒抗血清為一抗，堿性磷酸酯酶標(biāo)記的A蛋白為二抗，用NBT-BCIP顯色，Western-Blot鑒定所提純的蛋白作為抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法，其特征在于所述引物的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法，其特征在于所述RT-PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4分鐘后進(jìn)行94℃變性30秒、55℃復(fù)性30秒、72℃延伸2分鐘的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72℃延伸10分鐘后保存于4℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法，其特征在于所述大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞為DH5α。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法，其特征在于所述的雙酶切所用酶為EcoRI和XhoI。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低含量煙草環(huán)斑病毒外殼重組蛋白的原核表達(dá)的制備方法，其特征在于所述的質(zhì)粒為質(zhì)粒pET28a。
全文摘要
本發(fā)明公開了提供一種在血清檢測(cè)中提純低濃度或較難提純的病毒用作檢測(cè)抗原的方法。該制備方法主要包括一些生物學(xué)克隆技術(shù)和原核表達(dá)技術(shù)，對(duì)一些在寄主體內(nèi)含量較低或較難提純的病毒進(jìn)行克隆，制備的方法取得該病毒的抗原，從而使得利用常規(guī)血清學(xué)檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)出這些病毒抗原變?yōu)榭赡堋?br> 文檔編號(hào)C12N15/70GK101041825SQ20061002488
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2006年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月21日
發(fā)明者楊翠云, 曹潔, 沈禹飛, 于翠, 鄭建中, 代光輝, 陶庭典 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海交通大學(xué), 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)