專利名稱：一種嗜熱α－淀粉酶的制備純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及重組蛋白質(zhì)與嗜熱酶的提取、純化。
背景技術(shù)：
耐高溫α-淀粉酶是工業(yè)上最常用的酶制劑之一，廣泛使用于食品工業(yè)、化工工業(yè)中的淀粉加工。尋求與開發(fā)耐受高熱的淀粉酶長(zhǎng)期以來始終是工業(yè)酶研究領(lǐng)域的重點(diǎn)與熱點(diǎn)課題。全球淀粉處理的酶的市場(chǎng)約為1.5億美圓，其中用于淀粉液化過程的約占24％。因此，對(duì)于淀粉酶生產(chǎn)產(chǎn)率，耐熱性以及酶活性的任何提高均具有十分重要的理論意義與直接商業(yè)價(jià)值。
目前工業(yè)上普遍使用的耐熱淀粉酶來自于地衣芽孢桿菌，該酶即地衣芽孢桿菌嗜熱淀粉酶(BLA，如Taka-therm)的最適催化溫度為90℃，最適pH值為7.0-8.0，且需要Ca2+來維持其熱穩(wěn)定。在實(shí)際的工業(yè)化淀粉加工過程中，需要高于100℃來實(shí)現(xiàn)淀粉的液化，淀粉溶液的pH值通常只有4.5左右，另外，Ca2+的加入會(huì)影響到后續(xù)反應(yīng)的糖化酶的活性，因此BLA并非最適的淀粉酶。S.Jorgensen與G.Dong等各自獨(dú)立的從極端嗜熱古菌Pyrococcus furiosus克隆并得到極端嗜熱α-淀粉酶PFA，研究發(fā)現(xiàn)，PFA具有優(yōu)秀的耐熱特性，其最適溫度為100℃，在100℃環(huán)境下數(shù)小時(shí)不喪失活力。與此同時(shí)，PFA的最適pH為5.5-6.0，不需要Ca2+仍能保持80％以上的活性。優(yōu)良的酶學(xué)特性使PFA具有良好的應(yīng)用前景和商業(yè)開發(fā)價(jià)值。
Pyrococcus furiosus是從海底火山溫泉中的分離得到的絕對(duì)厭氧菌，最適生長(zhǎng)溫度100℃，很難用作工業(yè)生產(chǎn)的菌種。由于Pyrococcus furiosus本身培養(yǎng)相對(duì)較為復(fù)雜，這一淀粉酶的大量制備只能通過外源重組表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。沈微等嘗試在大腸桿菌中直接表達(dá)或分泌表達(dá)，韋宇拓等在酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，但表達(dá)量較低，在SDS-PAGE上未能看到表達(dá)條帶。Dong等克隆了該基因并在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中表達(dá)，也遇到表達(dá)量偏低的問題。當(dāng)表達(dá)量升高時(shí)，重組PFA主要以不溶性的包涵體形式表達(dá)，Dong等采用了低溫誘導(dǎo)，從菌體破碎上清中純化得到重組蛋白以提高重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)，但提高非常有限。隨后Beata等采用與intein融合表達(dá)的方式，提高了PFA可溶性表達(dá)量，但總的表達(dá)量仍不高。Linden等認(rèn)為，由于重組PFA以包涵體形式表達(dá)時(shí)表達(dá)量遠(yuǎn)高于可溶性表達(dá)，從包涵體中純化該蛋白質(zhì)是一種效率更高的方法。他們采用甘油抽提的方法，從包涵體中溶解出有酶活的蛋白，并建立了用疏水柱的一步純化方法，簡(jiǎn)化了純化步驟。盡管如此，甘油抽提方法只能溶解出部分活性蛋白，仍有大量重組蛋白質(zhì)留在沉淀中被棄掉。甘油抽提方法除了收率方面的因素以外，在過程放大等方面亦存在問題。
因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種新的簡(jiǎn)便高效、低成本、可放大的重組PFA純化方法，為重組PFA的大量制備提供了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種重組的嗜熱α-淀粉酶的提純方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用上述提純方法所獲得的α-淀粉酶及其用途。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種嗜熱α-淀粉酶的制備方法，它包括步驟(1)將嗜熱α-淀粉酶的包涵體在70-100℃的溫度下，在pH9-13的堿性溶液中溶解變性，從而獲得嗜熱α-淀粉酶的變性溶液；(2)將步驟(1)中獲得的嗜熱α-淀粉酶的變性溶液進(jìn)行復(fù)性，從而獲得嗜熱α-淀粉酶的復(fù)性溶液；(3)從步驟(2)得到的嗜熱α-淀粉酶的復(fù)性溶液分離出嗜熱α-淀粉酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的嗜熱α-淀粉酶是選自下組的嗜熱α-淀粉酶火球菌屬的嗜熱α-淀粉酶、嗜熱古菌Pyrococcus furiosus(也譯為激烈火球菌)的嗜熱α-淀粉酶、沃氏火球菌Pyrococcus woesei的嗜熱α-淀粉酶以及來源于其他嗜熱微生物的嗜熱α-淀粉酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的嗜熱α-淀粉酶是以下菌種所產(chǎn)生的嗜熱α-淀粉酶嗜熱古菌Pyrococcus furiosus DSM 3638、嗜熱古菌Pyrococcus furiosus ATCC43587、Pyrococcus woesei ATCC 49860、或其組合。
在另一優(yōu)選例中，所述的嗜熱α-淀粉酶是嗜熱古菌Pyrococcus furiosus的嗜熱α-淀粉酶。
在另一優(yōu)選例中，獲得重組的嗜熱α-淀粉酶包涵體的表達(dá)載體為T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體為Novagen公司的pET17b(產(chǎn)品號(hào)69663-3)、pET21a(產(chǎn)品號(hào)69740-3)。
在另一優(yōu)選例中，獲得重組的嗜熱α-淀粉酶包涵體的表達(dá)宿主為大腸桿菌E.coli。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)宿主為Stratagen公司的大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(產(chǎn)品號(hào)230245)。
在另一優(yōu)選例中，上述制備方法的步驟(1)中，所述的堿性溶液為pH9.5-12.0的緩沖液。
在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中的堿性溶液溫度為75-95℃。較佳地80-95℃。
在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中的變性處理時(shí)間為0.5-60分鐘，較佳地1-20分鐘。更佳地2-10分鐘。
在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中所述的堿性溶液是pH9-13的Britton-Robinson緩沖液、PBS、Tris-HCl緩沖液、碳酸鹽緩沖液。
在另一優(yōu)選例中，上述制備方法的步驟(2)中，復(fù)性條件是在15-70℃下，于pH7.5-10.0的緩沖液復(fù)性0.5-20小時(shí)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中所述的復(fù)性溶液是Britton-Robinson緩沖液、PBS、Tris-HCl緩沖液、碳酸鹽緩沖液。
在另一優(yōu)選例中，上述制備方法的步驟(3)中，所述的分離是通過以下方法進(jìn)行疏水層析、離子交換層析、分子排阻層析或其組合。
在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中的分離是通過以下方法進(jìn)行疏水層析、離子交換層析。
在另一優(yōu)選例中，上述制備方法還包括步驟(4)將分離的嗜熱α-淀粉酶凍干，制得嗜熱α-淀粉酶凍干劑。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種由上述的制備方法所獲得的嗜熱α-淀粉酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的嗜熱α-淀粉酶耐受超過100℃或更高的溫度，且在100℃數(shù)小時(shí)以上不喪失其活性(如100℃2小時(shí)后活性至少保留90％)。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種上述的嗜熱α-淀粉酶的用途，它可用于在超過100℃的高溫下，使淀粉水解成為寡糖與單糖的工藝。
由此，本發(fā)明提供一種新的簡(jiǎn)便高效、低成本、可放大的重組嗜熱α-淀粉酶的純化方法。


圖1顯示了α-淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1α-淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖2顯示了α-淀粉酶表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析，其中M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1IPTG誘導(dǎo)的含pET21a的BL21(DE3)RIL菌體全蛋白；2IPTG誘導(dǎo)的含pET21a-PFA的BL21(DE3)RIL菌體全蛋白；3IPTG誘導(dǎo)的含pET21a-PFA的BL21菌體裂解后的上清；4IPTG誘導(dǎo)的含pET21a-PFA的BL21(DE3)RIL菌體裂解后的沉淀。
圖3顯示了甘油抽取α-淀粉酶純化法各步驟的SDS-PAGE電泳分析，其中M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1包涵體；2甘油抽取上清(上樣)；3phenylSepharose疏水柱洗脫的活性組分。
圖4顯示了純化的α-淀粉酶SDS-PAGE電泳和酶譜分析，其中左圖電泳后用考馬氏亮蘭；右圖稀碘液染色；M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，6純化蛋白不經(jīng)加熱直接上樣；2，5純化蛋白在100℃加熱10分鐘后上樣；3，4純化蛋白121℃加熱10分鐘后上樣。
圖5顯示了本發(fā)明溶解包涵體純化法各步驟的SDS-PAGE電泳分析，其中M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1包涵體；2包涵體溶解上清；3稀釋后(上樣)；4phenyl Sepharose疏水柱洗脫的活性組分。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)在堿性和高溫條件下(如pH9-13、70-100℃)，只需數(shù)分鐘就能將重組蛋白(嗜熱α-淀粉酶PFA)包涵體溶解，而對(duì)蛋白基本上沒有破壞作用。然后，經(jīng)過復(fù)性過程，疏水層析分離，就可獲得純化的重組蛋白質(zhì)。其活性蛋白的回收率大大提高，可達(dá)到現(xiàn)有技術(shù)(甘油抽提法)的3倍。
可用于本發(fā)明的嗜熱α-淀粉酶沒有特別限制，可以是來自火球菌屬的嗜熱α-淀粉酶、嗜熱古菌Pyrococcus furiosus(也譯為激烈火球菌)的嗜熱α-淀粉酶、沃氏火球菌Pyrococcus woesei的嗜熱α-淀粉酶以及來源于其他嗜熱微生物的嗜熱α-淀粉酶。所述的嗜熱α-淀粉酶是選自下組的嗜熱α-淀粉酶在本發(fā)明中，所述的嗜熱α-淀粉酶可以是天然嗜熱α-淀粉酶或其變異體，也可以是重組的嗜熱α-淀粉酶。
優(yōu)選的是來自嗜熱古菌Pyrococcus furiosus DSM 3638、嗜熱古菌Pyrococcus furiosus ATCC 43587、嗜熱古菌Pyrococcus woesei ATCC 49860或其組合的嗜熱α-淀粉酶。
適用于本發(fā)明的嗜熱α-淀粉酶可以是天然的嗜熱α-淀粉酶、重組的嗜熱α-淀粉酶或其變異體。代表性的嗜熱α-淀粉酶包括(但并不限于)由以下基因編碼的嗜熱α-淀粉酶Genebank登陸號(hào)U96622、AF001268、AF177906.1、AE010170.1、AF240464.1、DQ192528.1等。
可用于本發(fā)明的包涵體沒有特別限制，只要該包涵體含有重組表達(dá)的嗜熱α-淀粉酶。本發(fā)明所用的包涵體可由本領(lǐng)域常規(guī)的重組方法獲得，其中可以選用本領(lǐng)域常規(guī)的各種大腸桿菌宿主菌、質(zhì)粒、啟動(dòng)子等材料構(gòu)建重組表達(dá)宿主菌，并且在常規(guī)條件下發(fā)酵，從而獲得包涵體。
一種優(yōu)選的方法為(a)PCR擴(kuò)增古菌Pyrococcus furiosus DSM3638基因組DNA；(b)用步驟(a)所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建pET21a-PFA表達(dá)載體；(c)將重組質(zhì)粒pET21a-PFA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中；(d)培養(yǎng)基中培養(yǎng)單菌落；(e)重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)；(f)離心收集菌體，超聲破碎得含重組蛋白(PFA)的包涵體。所用的初始菌種為Pyrococcus furiosus DSM 3638，Pyrococcus furiosusATCC43587；T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體可選用購自Novagen公司的pET17b(產(chǎn)品號(hào)69663-3)、pET21a(產(chǎn)品號(hào)69740-3)等；表達(dá)宿主選用購自Stratagen公司的BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(產(chǎn)品號(hào)230245)。
包涵體溶解變性是純化過程中的最為關(guān)鍵的因素。在大腸桿菌中表達(dá)的外源重組蛋白質(zhì)包涵體，其蛋白質(zhì)分子間主要通過非共價(jià)作用相互結(jié)合在一起，這些非共價(jià)作用包括疏水作用、范德華力、氫鍵以及離子鍵作用，唯一的共價(jià)作用是蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸殘基間的-S-S-鍵。最常用的包涵體溶解方法是高濃度的尿素與鹽酸胍等變性劑，另外還有包括極端pH條件，溫度以及去垢劑等。PFA是一種生物酶分子，純化過程需要充分考慮成本、工藝便利程度以及可放大性等多種因素。發(fā)明人嘗試采用在不同pH條件下進(jìn)行包涵體的溶解過程，發(fā)現(xiàn)在高堿性條件下(大于pH12.5)時(shí)可以獲得滿意的包涵體溶解效果，但由于強(qiáng)堿環(huán)境對(duì)于蛋白質(zhì)與酶活性具有一定的破壞作用，在隨后的疏水柱純化后獲得的總的活性蛋白量不高。發(fā)明人摸索了不同溫度和pH條件，發(fā)現(xiàn)在pH9-13、70-100℃條件下數(shù)分鐘即能將蛋白包涵體溶解。
溶解后的包涵體可用常規(guī)的復(fù)性方法進(jìn)行復(fù)性。一種優(yōu)選的復(fù)性方法是將溶解后的包涵體在緩沖液中進(jìn)行稀釋復(fù)性，經(jīng)疏水層析分離得到純化的重組PFA。經(jīng)堿性pH溶解復(fù)性純化得到的重組PFA表現(xiàn)出與甘油抽提純化PFA類似的酶活性。
一種優(yōu)選的從包涵體中得到嗜熱α-淀粉酶的方法包括步驟(1)將重組的嗜熱α-淀粉酶包涵體在70-100℃堿性緩沖液中溶解變性0.5-30分鐘；(2)將步驟(1)的溶液稀釋在pH7.5-9.5的緩沖液中復(fù)性；(3)上柱層析步驟(2)得到的溶液進(jìn)行分離純化，制得α-淀粉酶。
本發(fā)明的增溶過程中所用的溶液沒有特別的要求，只需將pH調(diào)節(jié)到特定的數(shù)值。可以使用水或水性溶劑作為溶解步驟的溶劑。合適的緩沖液可以包括(但并不限于)以下種類磷酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、Tris-HCl、碳酸鹽、甘氨酸-NaOH等；優(yōu)選地同時(shí)含有磷酸鹽、硼酸鹽與醋酸鹽，其比例為1∶1∶1。
用于增溶的溶液為堿性，pH9-13，較佳地pH9.5-12.0。
用于增溶的堿性溶液需加熱到70-100℃，較佳地85-95℃。
溶解變性的時(shí)間沒有特別限制，通常為0.5-60分鐘，較佳地1-20分鐘，更佳地2-10分鐘。
同樣，嗜熱α-淀粉酶的復(fù)性可以通過任何適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋來完成，緩沖液的pH范圍為7.5-9.5，較佳約8.0-9.0。在此稀釋步驟中完成復(fù)性α-淀粉酶的合適緩沖液包括磷酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、Tris-HCl、碳酸鹽、甘氨酸-NaOH等。經(jīng)過此步稀釋后，進(jìn)行柱層析分離純化，可以用疏水層析、離子交換層析、分子排阻層析或其組合進(jìn)行分離純化。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明針對(duì)重組嗜熱α-淀粉酶(PFA)包涵體蛋白質(zhì)的新純化方法大幅度提高了重組PFA蛋白質(zhì)的純化效率，并具有低成本、方法簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
實(shí)施例1制備嗜熱α-淀粉酶PFA材料與方法1、材料菌株及載體Pyrococcus furiosus DSM3638基因組DNA ATCC編號(hào)為43587TM；大腸桿菌E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)及E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL購自Stratagen公司；pET21a表達(dá)載體購自Novagen公司；分子生物學(xué)試劑限制性內(nèi)切酶Nde I、HindIII、Pyrobest DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自上海生化所；Phenyl Sepharose 6 Fast Flow層析柱材料購自Novagen公司；膠回收試劑盒購自華瞬生物工程有限公司；引物合成由上海博彩生物公司完成DNA測(cè)序由英駿生物技術(shù)有限公司完成其他試劑均為分析純。
2、方法(1)PCR擴(kuò)增PFA基因根據(jù)GenBank中PFA的基因序列設(shè)計(jì)引物，以ATCC編號(hào)為43587TM的Pyrococcus furiosus DSM3638基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。
表1引物序列

由于該基因N端26個(gè)氨基酸為分泌引導(dǎo)肽，其存在會(huì)影響活性，所以發(fā)明人從編碼第27個(gè)氨基酸的位點(diǎn)開始擴(kuò)增，并在下游引物的5’端設(shè)計(jì)了HindIII酶切位點(diǎn)，以便于連接入載體pET21a；擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性3min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。
(2)pET21a-PFA表達(dá)載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物HindIII酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收，pET21a以Nde I酶切，以T4DNA聚合酶補(bǔ)平，再以HindIII酶切，膠回收試劑盒回收，以T4DNA連接酶連接回收PCR片段和載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，菌落PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子送到英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)得的DNA序列翻譯為蛋白質(zhì)序列，與GenBank收錄的PFA蛋白序列對(duì)比完全相同。
(3)重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)與分析將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET21a-PFA轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)和Ecoli BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中，同時(shí)轉(zhuǎn)化pET21a作對(duì)照。挑單菌落接種于液體LB中(含100μg/ml氨芐青霉素、BL21(DE3)RIL中另添加50μg/ml卡那霉素)，過夜培養(yǎng)，以1％接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時(shí)，至OD600達(dá)到0.7時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mmol/L，誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收集菌體，重懸于50mmol/L Tris-HClpH7.5、100mmol/L NaCl(緩沖液A)的緩沖液，超聲破碎，離心收集上清，用1/5體積相同緩沖液重懸沉淀。分別取菌體及超聲離心后得到的上清和沉淀重懸液，以2×上樣緩沖液處理，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。
(4)表達(dá)產(chǎn)物的純化誘導(dǎo)后收集菌體超聲破碎，離心后棄去上清，包涵體用緩沖液A洗滌，離心棄去上清。
方法1120mg濕重包涵體懸浮于20ml含20％甘油的50mM醋酸鈉緩沖液，室溫?cái)嚢?小時(shí)，離心取上清，反復(fù)三次，上清合并待上柱。
方法2120mg濕重包涵體懸浮于6ml 120mM Britton-Robinson(pH 10.5)緩沖液(內(nèi)含磷酸鹽、硼酸鹽與醋酸鹽)中，90℃水浴3分鐘，大多數(shù)蛋白溶解，置冰浴中冷卻。離心，上清稀釋于54ml 120mM Britton-Robinson(pH 8.5)緩沖液中待上柱。
樣品上樣于用同樣緩沖液平衡的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析柱，以含0-50％乙二醇的50mmol/L，pH6.0醋酸鈉緩沖液梯度洗柱，用含50％乙二醇的50mmol/L，pH6.0醋酸鈉緩沖液洗脫，流速1ml/min，收集洗脫液，同時(shí)A280檢測(cè)。以Lowry法對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。
(5)淀粉酶活力測(cè)定方法用常規(guī)的DNS法進(jìn)行測(cè)量，參照文獻(xiàn)(BernfeldP.Amylases α-and β-.Methods Enzymol，1955，1149-158)，將稀釋的酶液加入到0.5ml含1％淀粉的50mmol/L，pH5.0醋酸鈉溶液中，100℃反應(yīng)15min，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)。加入0.5ml DNS試劑(1g 3，5-二硝基水楊酸溶解于20ml 2mol/LNaOH中，加入30g酒石酸鈉鉀，稀釋至100ml；I2-KI溶液1％碘，10％碘化鉀，50％甲醇)，沸水煮5分鐘，冷水冷卻，加入5ml水，用分光光度計(jì)檢測(cè)在波長(zhǎng)546nm的吸光度，以葡萄糖與DNS試劑反應(yīng)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以1分鐘降解淀粉產(chǎn)生1umol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)；(6)淀粉酶酶譜檢測(cè)將酶液對(duì)稱上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，取出凝膠，從中間切開，一半進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，另一半置于50mmol/L，pH5.0醋酸鈉溶液中，40℃水浴15分鐘，將溶液換成含1％淀粉的50mmol/L，pH5.0醋酸鈉溶液，100℃加熱30min，浸入I2-KI溶液顯色。根據(jù)透明條帶出現(xiàn)的位置，對(duì)照考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，確定淀粉酶的酶帶。
結(jié)果1.pET21a-PFA表達(dá)載體的構(gòu)建用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出約1.3kb的片段與預(yù)期的PFA的1301bp大小相符(圖1)，將擴(kuò)增出的片段用HindIII酶切，回收后，與經(jīng)Nde I酶切、補(bǔ)平再經(jīng)HindIII酶切的載體pET21a進(jìn)行一端平端一端粘端的連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定陽性后進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)及BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中進(jìn)行表達(dá)。
2.PFA蛋白的表達(dá)將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)和BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析表達(dá)結(jié)果，見圖2。
結(jié)果表明轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株與對(duì)照相比沒有明顯表達(dá)，而轉(zhuǎn)入BL21-Codon Plus(DE3)-RIL的菌株在43KD處出現(xiàn)特征蛋白質(zhì)帶。根據(jù)核酸推算，該蛋白的分子量應(yīng)為52KD，這可能是由于該蛋白在含2％SDS和100mMDDT的樣品處理液中加熱處理后仍能保持部分折疊。在Dong的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。細(xì)胞超聲破碎后，分別進(jìn)行上清和沉淀的SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要是以包涵體的形式存在與細(xì)胞破碎液的沉淀中。
3.表達(dá)產(chǎn)物的純化Linden等建立的甘油常溫抽提后疏水柱一步純化法是目前為止純化耐熱嗜熱α-淀粉酶最便捷的方法。發(fā)明人首先采用Linden等方法進(jìn)行純化，并以此方法獲得的蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。用20％甘油懸浮包涵體室溫?cái)嚢?小時(shí)，可以抽提出目的蛋白，見圖3，反復(fù)進(jìn)行三次抽提，第三次抽提液中幾乎檢測(cè)不到活性。將前兩次抽提液合并上樣，通過Phenyl Sepharose 6Fast Flow疏水層析柱純化。通常蛋白需要高鹽離子才能結(jié)合到疏水柱上，但由于PFA的疏水性很強(qiáng)，不添加鹽離子且有20％甘油存在時(shí)依然能結(jié)合到疏水柱上。樣品上柱時(shí)，細(xì)菌的雜蛋白和結(jié)構(gòu)異常的PFA不會(huì)結(jié)合到柱子上，從而和目的蛋白分離開來。50％乙二醇洗脫出單一峰。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示在46KD和64KD處各有一條帶，見圖3，Dong等發(fā)現(xiàn)該蛋白易于形成二聚體。本實(shí)施例中，將樣品121℃加熱15分鐘后，電泳條帶變成46kD處一條，說明該蛋白在100℃加熱后在SDS-PAGE上仍能保持部分二聚體狀態(tài)。酶譜鑒定發(fā)現(xiàn)PFA二聚體具較強(qiáng)活性，而單體只有微弱的活性。當(dāng)121℃加熱15分鐘后，仍有微量二聚體，盡管蛋白電泳看不到條帶，但酶譜鑒定上二聚體位置有微弱的活性，見圖4、表2。
表2從0.4g重組大腸桿菌細(xì)胞中純化α-淀粉酶(方法1通過甘油抽提)

a細(xì)胞超聲破碎后b離心后含α-淀粉酶和細(xì)胞破碎物的沉淀c沉淀經(jīng)20％甘油抽提后的上清d經(jīng)phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱純化后的樣品結(jié)果表明，采用這種方法，最終獲得的PFA淀粉酶比活為3629.4/mg。
用甘油雖然可以溶解部分蛋白，但仍有大量蛋白保留在沉淀中。形成包涵體的蛋白質(zhì)存在正常的二級(jí)結(jié)構(gòu)。發(fā)明人用方法2，即在pH10.5、90℃條件下3分鐘就能將蛋白包涵體溶解，且對(duì)蛋白沒有明顯的破壞作用。進(jìn)一步稀釋到pH8.5，通過Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析柱純化，50％乙二醇洗脫出單一峰，見圖5、表3。
表3從0.4g重組大腸桿菌細(xì)胞中純化α-淀粉酶(方法2通過堿性條件下加熱溶解包涵體的方法)

a細(xì)胞超聲破碎后b離心后含α-淀粉酶和細(xì)胞破碎物的沉淀c沉淀在pH10.5條件下90℃加熱3分鐘，離心后上清d稀釋于pH8.5的緩沖液e經(jīng)phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱純化后的樣品結(jié)果表明通過堿性條件下加熱溶解包涵體的方法，測(cè)得比活為3830.2U/mg，回收率是甘油抽提法的3.1倍。
討論P(yáng)FA是來源于Pyrococcus furiosus的胞外嗜熱α-淀粉酶，本發(fā)明人通過PCR方法從Pyrococcus furiosus基因組中擴(kuò)增出PFA的序列，在大腸桿菌BL23(DE3)RIL菌株中獲得高效表達(dá)，重組PFA表達(dá)量占菌體總蛋白30％以上，并主要以不溶性的包涵體形式表達(dá)。本發(fā)明人采用Linden等的甘油抽提純化方法，獲得了一定量的純化蛋白，并以此作為陽性對(duì)照。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甘油抽提方法只能溶解出部分活性蛋白，仍有大量重組蛋白質(zhì)留在沉淀中無法被溶解純化。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>一種嗜熱α-淀粉酶的制備純化方法<130>062455<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1atgaaatact tggagcttga agag24<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2aagaagctta tcacccaaca ccacaataac tc 3權(quán)利要求
1.一種嗜熱α-淀粉酶的制備方法，其特征在于，它包括步驟(1)將嗜熱α-淀粉酶的包涵體在70-100℃的溫度下，在pH9-13的堿性溶液中溶解變性，從而獲得嗜熱α-淀粉酶的變性溶液；(2)將步驟(1)中獲得的嗜熱α-淀粉酶的變性溶液進(jìn)行復(fù)性，從而獲得嗜熱α-淀粉酶的復(fù)性溶液；(3)從步驟(2)得到的嗜熱α-淀粉酶的復(fù)性溶液分離出嗜熱α-淀粉酶。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的嗜熱α-淀粉酶是選自下組的嗜熱α-淀粉酶火球菌屬的嗜熱α-淀粉酶、嗜熱古菌Pyrococcusfuriosus的嗜熱α-淀粉酶、沃氏火球菌Pyrococcus woesei的嗜熱α-淀粉酶以及來源于其他嗜熱微生物的嗜熱α-淀粉酶。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的堿性溶液為pH9.5-12.0的緩沖液。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中的堿性溶液溫度為75-95℃。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，變性處理時(shí)間為0.5-60分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，復(fù)性條件是在15-70℃下，于pH7.5-10.0的緩沖液復(fù)性0.5-20小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述的分離是通過以下方法進(jìn)行疏水層析、離子交換層析、分子排阻層析或其組合。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(4)將分離的嗜熱α-淀粉酶凍干，制得嗜熱α-淀粉酶凍干劑。
9.一種如權(quán)利要求1所述的制備方法所獲得的嗜熱α-淀粉酶。
10.一種如權(quán)利要求9所述的嗜熱α-淀粉酶的用途，其特征在于，用于在超過100℃的高溫下，使淀粉水解成為寡糖與單糖的工藝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備嗜熱α－淀粉酶(PFA)的方法，所述的方法是在堿性條件下加熱溶解重組蛋白包涵體，稀釋復(fù)性后通過柱層析分離純化。該方法的回收率高，且回收的α－淀粉酶活性高。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101063115SQ20061002597
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日
發(fā)明者張毅, 王麗薩, 楊勝利 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院