專利名稱：結(jié)合熒光定量pcr的基因測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法。
背景技術(shù)：
近幾年來，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的不斷完善，為極微量DNA的檢測(cè)提供了有效的手段，不僅簡(jiǎn)便快速，而且特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。然而，常規(guī)的PCR技術(shù)在臨床應(yīng)用中只能做到定性檢測(cè)，而某些病毒的定量檢測(cè)對(duì)輔助診斷和治療具有相當(dāng)?shù)囊饬x，它為疾病的早期發(fā)現(xiàn)、治療效果和藥物的療效評(píng)價(jià)、病情的預(yù)后評(píng)判等方面提供了極大的便利。1995年，美國Perkin Elmer公司研制成功的熒光定量PCR技術(shù)，融匯了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果，不需要PCR后處理，完全閉管操作(整個(gè)過程中，僅有加入樣品一次開蓋)，一舉克服了常規(guī)PCR技術(shù)的諸多難題，為PCR的臨床應(yīng)用又開辟了新的道路。然而傳統(tǒng)的熒光定量PCR是將檢測(cè)的目的片段和探針設(shè)計(jì)在目的物的DNA或RNA的保守區(qū)域，只能檢測(cè)DNA或RNA的載量而無法檢測(cè)目的物的類型和是否具有相關(guān)突變。
為了獲得目的物的類型和是否具有相關(guān)突變等一系列信息，近年來各國相繼建立起病毒變異和耐藥基因序列測(cè)定的方法?；蛐蛄袦y(cè)定分析法同其他方法相比，在技術(shù)上和經(jīng)濟(jì)上都具有明顯優(yōu)勢(shì)。首先基因序列測(cè)定分析法是公認(rèn)的分型和突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。其次，基因序列測(cè)定分析法檢測(cè)的是易突變區(qū)域的完整序列。醫(yī)生可以根據(jù)病人對(duì)藥物應(yīng)答情況與基因序列進(jìn)行橫向和縱向的比較，從而確定病原體類型和相關(guān)耐藥突變，可做出及時(shí)準(zhǔn)確的分析和治療，并有可能發(fā)現(xiàn)新的未被報(bào)道的耐藥突變。再次，現(xiàn)在新的治療藥物不斷出現(xiàn)，新的耐藥位點(diǎn)也不斷被報(bào)道。由于基因序列分析法檢測(cè)的是易突變區(qū)域的完整序列，對(duì)于已報(bào)道的屬于被測(cè)區(qū)域新的點(diǎn)突變，醫(yī)生可直接與原測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，指導(dǎo)用藥和后續(xù)治療，無需再重新研發(fā)設(shè)計(jì)新試劑，從而極大的節(jié)省了社會(huì)資源。
然而傳統(tǒng)的基因序列測(cè)定前，通常需要跑電泳檢查，看是否有PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶，在有條帶的前提下再將產(chǎn)物割膠純化后進(jìn)行測(cè)序，這樣既增加了電泳割膠純化所造成的污染的可能性，又漏掉了由于電泳低敏感度所造成的低濃度的模板。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法，它使熒光定量PCR在檢測(cè)到DNA或RNA的載量的同時(shí)，又能獲得目的物的類型和是否具有相關(guān)突變的信息，且該方法提高了基因測(cè)序的效率。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供上述方法在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法，它包括如下步驟(1)熒光定量PCR，得到目的片段的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物；(2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，用外切酶處理PCR產(chǎn)物，以分解多余的引物，同時(shí)用SAP處理PCR產(chǎn)物，以去除多余的dNTP；(3)將酶處理后的產(chǎn)物用于基因測(cè)序和序列分析。
在本發(fā)明的另一方面，提供了上述方法在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，所述檢測(cè)試劑盒包含熒光定量PCR的各反應(yīng)試劑、檢測(cè)目的片段的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品、檢測(cè)用上游和下游引物、熒光探針、外切酶、SAP以及用于基因測(cè)序反應(yīng)的各試劑。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法使熒光定量結(jié)果可直接指導(dǎo)后續(xù)的基因測(cè)序，中間過程的酶處理避免了電泳、割膠等一系列過程，不僅簡(jiǎn)化了操作，也避免了電泳、割膠過程帶來的污染。部分低濃度的目的物產(chǎn)物電泳后無法看到條帶，但只要熒光定量PCR有起跳，就可以將產(chǎn)物直接酶處理后測(cè)序，提高了檢測(cè)的靈敏度，避免了假陰性。另外，本發(fā)明的方法還可有效獲取目的物的類型和是否發(fā)生突變的信息。


圖1是本發(fā)明的熒光定量PCR圖；圖2是本發(fā)明的熒光定量PCR后的電泳圖；圖3是本發(fā)明的測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本發(fā)明的結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法是將熒光定量PCR和基因測(cè)序結(jié)合在一起的新方法，它將檢測(cè)的目的片段和探針設(shè)計(jì)在目的基因中DNA或RNA的相關(guān)區(qū)域，在熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)出目的基因載量后，再將定量PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物簡(jiǎn)單處理后直接進(jìn)行序列分析，只要定量PCR檢測(cè)出目的基因濃度大于103copies/ml就可直接處理測(cè)序，避免了電泳割膠純化過程中可能出現(xiàn)的污染。同時(shí)，PCR的定量結(jié)果對(duì)測(cè)序的前期準(zhǔn)備有明確的指導(dǎo)作用。如用傳統(tǒng)的測(cè)序法需要電泳，低濃度的模板在電泳時(shí)有可能無法看到條帶，而熒光定量PCR基因序列分析由于其靈敏度高的特點(diǎn)，只要樣本在熒光定量過程中有擴(kuò)增起跳，就可直接處理進(jìn)行基因序列分析。
本發(fā)明的結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法包括如下步驟(1)熒光定量PCR，得到目的片段的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物。
配制反應(yīng)體系，在PCR熱循環(huán)儀上設(shè)定如表1所示的程序，并在PCR循環(huán)第二步60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，圖1為熒光定量PCR圖，其中，標(biāo)有1、2、3、4和5數(shù)字的5條有起跳的曲線分別代表了被靈敏檢測(cè)出的5個(gè)樣本的目的片段。
(2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，用外切酶處理PCR產(chǎn)物，以分解多余的引物，同時(shí)用SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理PCR產(chǎn)物，以去除多余的dNTP。
表1

配制SAP和外切酶的混合物，終濃度為0.4U SAP+5U EXON1外切酶/7ul，根據(jù)定量PCR結(jié)果，取PCR產(chǎn)物100ng稀釋至5ul，再加入2ul以上比例的SAP和外切酶的混合物，37℃60分鐘，然后80℃保溫15分鐘，滅活酶。
將圖1中定量PCR的產(chǎn)物跑電泳膠時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有些樣本在跑電泳膠時(shí)，不能顯示PCR產(chǎn)物，如圖2中標(biāo)數(shù)字1的泳道，但該樣本在熒光定量PCR過程中能給出值(3×102)，仍可用于后續(xù)的測(cè)序。
(3)將酶處理后的產(chǎn)物用于基因測(cè)序和序列分析。
測(cè)序反應(yīng)體系為2ul PCR產(chǎn)物、2ul測(cè)序引物(1pmol)、1ul bigdye(染料)，測(cè)序反應(yīng)條件為95℃5秒，50℃5秒，60℃5秒，40圈。反應(yīng)完畢，加9倍體積70％乙醇，2000g離心20分鐘，棄上清，涼干，加上樣緩沖液，上樣。圖3所示即為測(cè)序圖(是將圖1和圖2中的1號(hào)樣本測(cè)序的結(jié)果)，在圖中，A、T、G和C四個(gè)DNA堿基分別以綠色、紅色、黑色和藍(lán)色的峰表示。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法，其特征在于，它包括如下步驟(1)熒光定量PCR，得到目的片段的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物；(2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，用外切酶處理PCR產(chǎn)物，以分解多余的引物，同時(shí)用SAP處理PCR產(chǎn)物，以去除多余的dNTP；(3)將酶處理后的產(chǎn)物用于基因測(cè)序和序列分析。
2.如權(quán)利要求1所述的方法在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒包含熒光定量PCR的各反應(yīng)試劑、檢測(cè)目的片段的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品、檢測(cè)用上游和下游引物、熒光探針、外切酶、SAP以及用于基因測(cè)序反應(yīng)的各試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法，它包括步驟為熒光定量PCR、用外切酶和SAP處理PCR產(chǎn)物以及將酶處理后的產(chǎn)物用于基因測(cè)序分析。本發(fā)明還公開了該方法在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法使熒光定量PCR在檢測(cè)到DNA或RNA的載量的同時(shí)，又能獲得目的物的類型和是否發(fā)生突變的信息，且本發(fā)明中的熒光定量結(jié)果可直接指導(dǎo)后續(xù)的基因測(cè)序，提高了檢測(cè)的靈敏度和基因測(cè)序的效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1884579SQ20061002670
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者熊慧, 謝立群, 陳嘉錚, 傅強(qiáng), 程新建, 傅剛 申請(qǐng)人:上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司