專(zhuān)利名稱(chēng)：利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法，可用于提高畜禽水產(chǎn)等養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫能力，屬于農(nóng)業(yè)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化的蓬勃發(fā)展，養(yǎng)殖水環(huán)境污染日益嚴(yán)重，與此同時(shí)，未經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水和工業(yè)、生活污水的排放使水體受到嚴(yán)重污染，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到破壞，導(dǎo)致病原微生物種類(lèi)增多和傳播速度加快，養(yǎng)殖生物病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年全國(guó)發(fā)生中等程度以上的養(yǎng)殖病害面積占養(yǎng)殖總面積的15％～20％，產(chǎn)量損失超過(guò)100萬(wàn)噸。由于環(huán)境惡化造成的水產(chǎn)動(dòng)物疾病或由此引發(fā)的傳染性疾病大量劇增，已成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要障礙。長(zhǎng)期使用抗生素和其他化學(xué)藥物防治養(yǎng)殖病害已引發(fā)了一系列環(huán)境和社會(huì)問(wèn)題，其突出表現(xiàn)為產(chǎn)品中抗生素和有害化學(xué)物質(zhì)殘留增加，水產(chǎn)品價(jià)格長(zhǎng)期低迷。利用有益微生物在水體及代謝產(chǎn)物提高養(yǎng)殖動(dòng)物的消化吸收能力，同時(shí)抑制致病菌的大量繁殖，這是一種治本的環(huán)境處理方法，也是推行綠色養(yǎng)殖的最佳措施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高養(yǎng)殖動(dòng)物免疫能力和消化吸收能力的利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法，其特征在于，采用液體高速培養(yǎng)和固體擴(kuò)大結(jié)合的發(fā)酵方法，其生產(chǎn)步驟為第一步發(fā)酵菌株選育a.菌株篩選以健康的鯽魚(yú)腸道中分泌物為菌源，采用MRS乳酸菌培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌分離，篩選出一種植物乳桿菌，在啤酒發(fā)酵液中用酵母選擇培養(yǎng)基分離釀酒酵母菌；將分離的兩種菌種分別放在酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，在4℃溫度下保存菌種；b.將分離的植物乳桿菌和釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，在35-40℃溫度下培養(yǎng)20-25小時(shí)，然后將釀酒酵母菌接種于酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，將植物乳桿菌接種于乳酸菌培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，選出生長(zhǎng)快、菌體特征明顯的植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別在實(shí)驗(yàn)室中保存；c. 生產(chǎn)制種最后將選出生長(zhǎng)快的植物乳桿菌轉(zhuǎn)接入裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，將釀酒酵母菌轉(zhuǎn)接入酵母膏麥芽汁瓊脂作培養(yǎng)基的茄子瓶中，在35-40℃溫度下培養(yǎng)45-50小時(shí)，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時(shí)即可取出，然后放入2-6℃的冰箱中進(jìn)行保存；第二步有益菌株的液體培養(yǎng)a.按以下重量配比例稱(chēng)取各菌種植物乳桿菌55-65％、釀酒酵母菌35-45％b.將稱(chēng)取的植物乳桿菌和釀酒酵母菌混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)步驟a中稱(chēng)取的混合菌苔按1∶25-30的比例接種于120-130℃、30-45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中攪拌30min，其轉(zhuǎn)速為200-240r/min，攪拌均勻后放入消毒后塑料桶中靜置5-7天，靜置過(guò)程中每天測(cè)定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；c.發(fā)酵過(guò)程中抽樣3次，顯微鏡下檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況和測(cè)定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml濃度和Ph值達(dá)到3.0-4.0時(shí)停止發(fā)酵；第三步離心收集菌體細(xì)胞壁a.將步驟1中發(fā)酵液在離心機(jī)以每1kg8000 r/min，10min離心收集菌體沉淀，用0.9％生理鹽水反復(fù)洗滌細(xì)菌至白色，將菌體懸浮于蒸餾水中，然后用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)處理30-40min，進(jìn)行物理破碎2-4次；b.細(xì)胞壁分離將物理破碎后的溶液在離心機(jī)以每1kg4000r/min離心15-20min，移去沉淀物，以去除未破碎菌體，再將上清夜在離心機(jī)以每1kg8000r/min離心20min，收集沉淀的粗細(xì)胞壁；第四步菌群的固體擴(kuò)大培養(yǎng)a.將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合按1∶25-30的比例接入120-130℃、30-45min高溫滅菌的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，攪拌30-45min至均勻，倒入50-70kg消毒雙層飼料袋中密封發(fā)酵，溫度30-35℃，時(shí)間8-10天，發(fā)酵過(guò)程中取樣三次，測(cè)定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測(cè)定水分為35-40％、Ph值為3.5-4.0；b.添加粗細(xì)胞壁將細(xì)胞壁收集物與固體擴(kuò)大發(fā)酵物按1∶50-60比例混合，倒在攪拌機(jī)中攪拌，轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/min，攪拌時(shí)間為30min；第五步粉碎添加載體a.干燥將步驟4發(fā)酵完全的產(chǎn)品按時(shí)間先后放入培養(yǎng)箱干燥，溫度控制在40-45℃，時(shí)間14-16小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在≤12％；b.添加載體將干燥后的產(chǎn)品按1∶0.02-0.03的比例添加載體，倒入攪拌機(jī)中攪拌均勻，然后轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，物料溫度控制在45℃以下，粉碎后的物料過(guò)50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新粉碎；c.過(guò)篩后裝入帶有內(nèi)袋的桶或袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識(shí)牌，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)有序堆放；取樣檢測(cè)，主要參數(shù)水份≤12％、活菌數(shù)60-80億/g；物理性狀深黃色粉末狀固體。
所述的步驟2液體培養(yǎng)基為無(wú)菌水再加豆粕粉、尿素、硫酸銨、酵母粉、玉米粉、糖蜜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸鎂、硫酸鎂的至少三種混合物，其重量百分配比為豆粕2-6％、尿素1-3％、硫酸銨0-1％、酵母粉0-3％、玉米粉2-8％、糖蜜10-20％、磷酸二氫鉀0-1％、磷酸二氫鈉0-2％、磷酸鎂0-1％、硫酸鎂0-1％、無(wú)菌水54-84％。
所述的步驟4的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基為清糠和無(wú)菌水再加豆粕粉、糖蜜、玉米粉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、無(wú)菌水10-30％、尿素中的至少四種混合物組成，其重量百分配比為豆粕2-6％、糖蜜8-12％、玉米粉4-8％、清糠40-70％、磷酸二氫鉀0.03-0.06％、磷酸二氫鈉1-2％、硫酸鎂0.4-0.8％、尿素1-2％、無(wú)菌水15-45％。
所述的載體由沸石粉、碳酸鈣組成，其重量百分配比為沸石粉40-50％、碳酸鈣50-60％。
非特異性防御機(jī)制是脊椎動(dòng)物抵抗病原體微生物感染的第一道防線系指機(jī)體組織和體液中大量的細(xì)胞和抗菌的蛋白質(zhì)、肽類(lèi)。在微生物細(xì)胞中，同樣存在著這些可被養(yǎng)殖動(dòng)物直接吸收利用的肽類(lèi)及多糖，如肽聚糖和葡聚糖等，肽聚糖(PG)存在于革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中，是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸形成的二糖通過(guò)胎鏈相互交叉構(gòu)成的聚合物。已被證實(shí)口服肽聚糖能增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病菌的抵抗能力，肽聚糖還能增強(qiáng)對(duì)蝦白細(xì)胞的噬菌作用及對(duì)白斑綜合病毒的抵抗能力(Itami er al.1998)，而且對(duì)對(duì)蝦血淋巴中的抗菌、溶菌、酚氧化酶和超氧化歧化酶具有不同程度的誘導(dǎo)作用。(孟凡超等，1999)。葡聚糖的免疫效果已得到廣泛的研究，現(xiàn)已應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物中的有酵母葡聚糖，β-1，3葡聚糖等類(lèi)型，其中研究最多的是酵母葡聚糖，酵母葡聚糖能提高魚(yú)類(lèi)的溶菌酶產(chǎn)量和巨噬細(xì)胞的殺菌活性(Jorgensen，Rorstad，1993)。β-1，3葡聚糖已被用來(lái)預(yù)防疾病，它能增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)的溶菌酶和補(bǔ)體活性，吞噬細(xì)胞的呼吸爆炸作用及其過(guò)氧化物的產(chǎn)量?？偟膩?lái)說(shuō)，微生物多糖是一類(lèi)帶有多種復(fù)雜基團(tuán)的生物聚合物，它能作為免疫增強(qiáng)劑激活非特異性免疫系統(tǒng)，通常這些聚合物是通過(guò)微生物進(jìn)化保留下來(lái)的特定序列結(jié)構(gòu)，但不是高等動(dòng)物體的組成成分。
本專(zhuān)利從動(dòng)物腸道中選取一種乳酸桿菌，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，選擇在培養(yǎng)基中高速生產(chǎn)的菌種，同時(shí)在啤酒發(fā)酵底物中選取一種釀酒酵母菌，其細(xì)胞壁中含有大量的葡聚糖特別是β-1，3葡聚糖，能顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性病菌的免疫能力，同時(shí)提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收能力，使日增重明顯提高，養(yǎng)殖周期縮短。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.采用液體高速培養(yǎng)和固體擴(kuò)大結(jié)合的發(fā)酵技術(shù)，既保證了有益菌種的高速生長(zhǎng)，又保證了其代謝產(chǎn)物完全保留；2.產(chǎn)品中的高濃度乳酸能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物的消化吸收功能，同時(shí)產(chǎn)生的肽聚糖增加了水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)病原體的免疫能力；3.產(chǎn)品中高濃度的酵母能提高魚(yú)體生長(zhǎng)需要的豐富的單細(xì)胞蛋白，同時(shí)，酵母細(xì)胞被充分破壁，釋放出大量的β-1，3葡聚糖，顯著提高對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的免疫能力；
4.乳酸菌和酵母菌發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)豐富的固體培養(yǎng)基，產(chǎn)生大量的纖維素酶、半纖維素酶、低聚肽、短肽混合物、抗生素、微量元素及其它代謝產(chǎn)物，為水產(chǎn)動(dòng)物提供最佳的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)條件；5.采用糧食作物和常用飼料載體作為主要培養(yǎng)基原料，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)使用常用的發(fā)酵及生產(chǎn)設(shè)備，易于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣；6.本發(fā)明的產(chǎn)品添加到水產(chǎn)飼料中，提供豐富的乳酸菌提高動(dòng)物的消化吸收能力，提供豐富的微生物多糖提高養(yǎng)殖體的非特異性免疫能力，減少了抗生素在養(yǎng)殖中的使用量，在動(dòng)物體內(nèi)無(wú)任何抗生素和重金屬殘留，是一種安全、綠色的微生物產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1第一步發(fā)酵菌株選育a.菌株篩選在健康的鯽魚(yú)腸道中提取分泌物為菌源，采用MRS乳酸菌培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌分離，篩選出植物乳桿菌，在啤酒發(fā)酵液中用酵母選擇培養(yǎng)基分離釀酒酵母菌；將分離的植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別在酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中4℃下保存菌種；本發(fā)明使用的是篩選到的以下菌種為L(zhǎng)actobacillus plantarum(ATCC8014)植物乳桿菌、Saccharomycscerevisiac(IFO0203)釀酒酵母菌，b.將分離的植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，在37℃溫度下培養(yǎng)22小時(shí)后，將釀酒酵母菌接種于酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，將植物乳桿菌接種于乳酸菌培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，選出生長(zhǎng)快、菌體特征明顯的植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別在實(shí)驗(yàn)室中保存；c.生產(chǎn)制種最后將選出生長(zhǎng)快的植物乳桿菌轉(zhuǎn)接入裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，釀酒酵母菌轉(zhuǎn)接入裝有酵母膏麥芽汁瓊脂作培養(yǎng)基的茄子瓶中，在37℃溫度下培養(yǎng)47小時(shí)，帶茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時(shí)即可取出，然后放入4℃的冰箱中進(jìn)行保存；
MRS乳酸菌培養(yǎng)基Yeast extract(酵母膏)7.5g Peptone(蛋白胨)7.5Glucose(葡萄糖)10g、KH2PO42g(磷酸二氫鉀)、Tomato juice(西紅柿汁)100ml Tween(吐溫)80 0.5ml、Distilled water(蒸餾水)900mlpH 7.0；酵母選擇培養(yǎng)基為葡萄糖1g、KCl1.8g、酵母浸膏2.5g、醋酸鈉g.2g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000ml。
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15-20g、水1000ml、pH7.0-7.2；肉湯培養(yǎng)基牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、水1000ml、pH7.0-7.2，酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基麥芽粉3g、酵母浸膏0.1g、水1000ml。
以上幾種培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室操作教課書(shū)上都有記載；第二步有益菌株的液體培養(yǎng)a.按以下重量配比稱(chēng)取各菌種植物乳桿菌55％、釀酒酵母菌45％；b.將稱(chēng)取的植物乳桿菌和釀酒酵母菌混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)步驟a中稱(chēng)取的混合菌苔按1∶25的比例接種于121℃、45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，倒在發(fā)酵罐中攪拌30min，其轉(zhuǎn)速為220r/min，攪拌均勻后放入消毒后塑料桶中靜置5天，靜置過(guò)程中每天測(cè)定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體，c.發(fā)酵過(guò)程中抽樣3次，顯微鏡下檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況和測(cè)定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml濃度以上和Ph值達(dá)到3.0-4.0時(shí)停止發(fā)酵；液體培養(yǎng)基豆粕2％、尿素1％、硫酸銨0.5％、酵母粉1％、玉米粉3％、糖蜜10％、磷酸二氫鉀0.5％、磷酸二氫鈉0.7％、磷酸鎂0.6％、硫酸鎂0.2％、無(wú)菌水80.5％；第三步離心收集菌體細(xì)胞壁b.將步驟1中發(fā)酵液在外購(gòu)離心機(jī)以每1kg8000 r/min，10min離心收集菌體沉淀，用0.9％生理鹽水反復(fù)洗滌細(xì)菌至白色，將菌體懸浮于蒸餾水中，然后用外購(gòu)超聲波細(xì)胞破碎機(jī)處理30-40min，進(jìn)行物理破碎2-4次；c.細(xì)胞壁分離將物理破碎后的溶液在離心機(jī)以每1kg4000r/min離心15-20min，移去沉淀物，以去除未破碎菌體，再將上清夜在離心機(jī)以每1kg8000r/min離心20min，收集沉淀的粗細(xì)胞壁；第四步菌群的固體擴(kuò)大培養(yǎng)a.將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合按1∶25的比例接入121℃、30min高溫滅菌的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，攪拌30min至均勻，倒入50kg消毒雙層飼料袋中密封發(fā)酵，溫度30℃，時(shí)間8-10天，發(fā)酵過(guò)程中取樣三次，測(cè)定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測(cè)定水分為35-40％、Ph值為3.5-4.0；b.添加粗細(xì)胞壁將細(xì)胞壁收集物與固體擴(kuò)大發(fā)酵物按1∶50比例混合，倒在攪拌機(jī)中攪拌，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/min，攪拌時(shí)間為30min；固體擴(kuò)大培養(yǎng)基豆粕2％、糖蜜8％、玉米粉4％、清糠40％、磷酸二氫鉀0.03％、磷酸二氫鈉1％、硫酸鎂0.4％、尿素1％、無(wú)菌水43.57％；第五步粉碎添加特殊載體a.干燥將步驟4發(fā)酵完全的產(chǎn)品按時(shí)間先后放入培養(yǎng)箱干燥，每盤(pán)重量2.0公斤±0.5，溫度控制在40-45℃，時(shí)間14-16小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在≤12％；b.添加載體；將干燥后的產(chǎn)品按1∶0.02的比例添加載體，載體組成和比例為沸石粉40％、碳酸鈣60％，倒入攪拌機(jī)中攪拌均勻；轉(zhuǎn)入粉碎間進(jìn)行粉碎，物料溫度控制在45℃以下，粉碎后的物料過(guò)50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新粉碎；c.過(guò)篩后裝入帶有內(nèi)袋的桶或袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識(shí)牌，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)有序堆放；取樣檢測(cè)，主要參數(shù)水份≤12％、活菌數(shù)60-80億/g；物理性狀深黃色粉末狀固體。
實(shí)施例2第一步發(fā)酵菌株選育同實(shí)施例1；第二步有益菌株的液體培養(yǎng)a.按以下重量配比稱(chēng)取各菌種植物乳桿菌65％、釀酒酵母菌35％b.將稱(chēng)取的植物乳桿菌和釀酒酵母菌混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)步驟a中稱(chēng)取的混合菌苔按1∶30的比例接種于121℃、45min高溫滅菌的培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中攪拌30min，其轉(zhuǎn)速為200r/min，攪拌均勻后放入消毒后塑料桶中靜置7天，靜置過(guò)程中每天測(cè)定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；c.發(fā)酵過(guò)程中抽樣3次，顯微鏡下檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況和測(cè)定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml濃度和Ph值達(dá)到3.0-4.0時(shí)停止發(fā)酵；液體培養(yǎng)基豆粕6％、尿素3％、硫酸銨1％、酵母粉3％、玉米粉8％、糖蜜20％、磷酸二氫鉀1％、磷酸二氫鈉1.9％、磷酸鎂0.8％、硫酸鎂0.9％、無(wú)菌水54.4％；第三步離心收集菌體細(xì)胞壁a.將步驟1中發(fā)酵液在外購(gòu)離心機(jī)以每1kg8000 r/min，10min離心收集菌體沉淀，用0.9％生理鹽水反復(fù)洗滌細(xì)菌至白色，將菌體懸浮于蒸餾水中，然后用外購(gòu)超聲波細(xì)胞破碎機(jī)處理30-40min，進(jìn)行物理破碎2-4次；b.細(xì)胞壁分離將物理破碎后的溶液在離心機(jī)以每1kg4000r/min離心15-20min，移去沉淀物，以去除未破碎菌體，再將上清夜在離心機(jī)以每1kg8000r/min離心20min，收集沉淀的粗細(xì)胞壁；第四步菌群的固體擴(kuò)大培養(yǎng)a.將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合按1∶30的比例接入121℃、45min高溫滅菌的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，攪拌45min至均勻，倒入70kg消毒雙層飼料袋中密封發(fā)酵，溫度35℃，時(shí)間10天，發(fā)酵過(guò)程中取樣三次，測(cè)定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測(cè)定水分為35-40％、Ph值為3.5-4.0b.添加粗細(xì)胞壁將細(xì)胞壁收集物與固體擴(kuò)大發(fā)酵物按1∶60比例混合，倒入攪拌機(jī)中攪拌，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/min，攪拌時(shí)間為30min；固體擴(kuò)大培養(yǎng)基豆粕粉6％、糖蜜12％、玉米粉8％、清糠55％、磷酸二氫鉀0.06％、磷酸二氫鈉2％、硫酸鎂0.8％、尿素1.8％、無(wú)菌水43.3％第五步粉碎添加特殊載體a.干燥將步驟4發(fā)酵完全的產(chǎn)品按時(shí)間先后放入培養(yǎng)箱干燥，溫度控制在45℃，時(shí)間16小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在≤12％；b.添加載體；將干燥后的產(chǎn)品按1∶0.03的比例添加載體，載體組成和比例為沸石粉50％、碳酸鈣50％，倒入攪拌機(jī)中攪拌均勻；轉(zhuǎn)入粉碎間進(jìn)行粉碎，物料溫度控制在45℃以下，粉碎后的物料過(guò)50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新粉碎；其余同實(shí)施例1一樣。
使用時(shí)按1-1.5‰比例添加到水產(chǎn)飼料攪拌均勻后投喂，在水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病期間應(yīng)加大使用量，按2-3‰比例添加使用至發(fā)病癥狀消失為止，本產(chǎn)品需在干燥通風(fēng)處密閉封存，開(kāi)封后應(yīng)盡快使用。在上海市科委領(lǐng)導(dǎo)的關(guān)心和支持下，于2002年開(kāi)始在上海市青浦區(qū)進(jìn)行青蝦的立體衛(wèi)生養(yǎng)殖研究，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，試驗(yàn)塘各塘的平均畝產(chǎn)量為151.8斤，而對(duì)照塘的平均產(chǎn)量?jī)H為70斤，試驗(yàn)塘的產(chǎn)量提高了116.9％，差異相當(dāng)明顯，餌料系數(shù)平均降低了17.1％。養(yǎng)殖周期中對(duì)照塘平均病害1.8次，而試驗(yàn)塘平均病害0.5次。且各試驗(yàn)塘青蝦的個(gè)體比較大，體表光滑、體色較青、賣(mài)價(jià)較高，而對(duì)照塘各塘青蝦體表毛糙、淤積物較多，體色較白，出售價(jià)不高。
權(quán)利要求
1.一種利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法，其特征在于，采用液體高速培養(yǎng)和固體擴(kuò)大結(jié)合的發(fā)酵方法，其生產(chǎn)步驟為第一步發(fā)酵菌株選育a.菌株篩選以健康的鯽魚(yú)腸道中分泌物為菌源，采用MRS乳酸菌培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌分離，篩選出一種植物乳桿菌，在啤酒發(fā)酵液中用酵母選擇培養(yǎng)基分離釀酒酵母菌；將分離的兩種菌種分別放在酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，在4-6℃溫度下保存菌種；b.將分離的植物乳桿菌和釀酒酵母菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，在35-40℃溫度下培養(yǎng)20-25小時(shí)，然后將釀酒酵母菌接種于酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，將植物乳桿菌接種于乳酸菌培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，選出生長(zhǎng)快、菌體特征明顯的植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別在實(shí)驗(yàn)室中保存；c.生產(chǎn)制種最后將選出生長(zhǎng)快的植物乳桿菌轉(zhuǎn)接入裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，將釀酒酵母菌轉(zhuǎn)接入酵母膏麥芽汁瓊脂作培養(yǎng)基的茄子瓶中，在35-40℃溫度下培養(yǎng)45-50小時(shí)，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時(shí)即可取出，然后放入2-6℃的冰箱中進(jìn)行保存；第二步有益菌株的液體培養(yǎng)a.按以下重量配比例稱(chēng)取各菌種植物乳桿菌55-65％、釀酒酵母菌35-45％；b.將稱(chēng)取的植物乳桿菌和釀酒酵母菌混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)步驟a中稱(chēng)取的混合菌苔按1∶25-30的比例接種于120-130℃高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中攪拌30min，其轉(zhuǎn)速為200-240r/min，攪拌均勻后放入消毒后塑料桶中靜置5-7天，靜置過(guò)程中每天測(cè)定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；c.發(fā)酵過(guò)程中抽樣3次，顯微鏡下檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況和測(cè)定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml濃度和Ph值達(dá)到3.0-4.0時(shí)停止發(fā)酵；第三步離心收集菌體細(xì)胞壁a.將步驟1中發(fā)酵液在離心機(jī)以每1kg8000r/min，10min離心收集菌體沉淀，用0.9％生理鹽水反復(fù)洗滌細(xì)菌至白色，將菌體懸浮于蒸餾水中，然后用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)處理30-40min，進(jìn)行物理破碎2-4次；b.細(xì)胞壁分離將物理破碎后的溶液在離心機(jī)以每1kg4000r/min離心15-20min，移去沉淀物，以去除未破碎菌體，再將上清夜在離心機(jī)以每1kg8000r/min離心20min，收集沉淀的粗細(xì)胞壁；第四步菌群的固體擴(kuò)大培養(yǎng)a.將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合按1∶25-30的比例接入120-130℃、30-45min高溫滅菌的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，攪拌30-45min至均勻，到入50-70kg消毒雙層飼料袋中密封發(fā)酵，溫度30-35℃時(shí)間8-10天，發(fā)酵過(guò)程中取樣三次，測(cè)定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測(cè)定水分為35-40％、Ph值為3.5-4.0；b.添加粗細(xì)胞壁將細(xì)胞壁收集物與固體擴(kuò)大發(fā)酵物按1∶50-60比例混合，倒在攪拌機(jī)中攪拌，轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/min，攪拌時(shí)間為30min；第五步粉碎添加特殊載體a.干燥將步驟4發(fā)酵完全的產(chǎn)品按時(shí)間先后放入培養(yǎng)箱干燥，溫度控制在40-45度，時(shí)間14-16小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在≤12％；b.添加載體；將干燥后的產(chǎn)品按1∶0.02-0.03的比例添加載體，倒入攪拌機(jī)中攪拌均勻，然后轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，物料溫度控制在45℃以下，粉碎后的物料過(guò)50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新粉碎；c.過(guò)篩后裝入帶有內(nèi)袋的桶或袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識(shí)牌，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)有序堆放；取樣檢測(cè)，主要參數(shù)水份≤12％、活菌數(shù)60-80億/g；物理性狀深黃色粉末狀固體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法，其特征在于，所述的步驟2液體培養(yǎng)基為無(wú)菌水再加豆粕粉、尿素、硫酸銨、酵母粉、玉米粉、糖蜜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸鎂、硫酸鎂的至少三種混合物，其重量百分配比為豆粕2-6％、尿素1-3％、硫酸銨0-1％、酵母粉0-3％、玉米粉2-8％、糖蜜10-22％、磷酸二氫鉀0-1％、磷酸二氫鈉0-2％、磷酸鎂0-1％、硫酸鎂0-1％、無(wú)菌水54-84％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法，其特征在于，所述的步驟4的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基為清糠和無(wú)菌水再加豆粕粉、糖蜜、玉米粉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、尿素中的至少四種混合物組成，其重量百分配比為豆粕2-6％、糖蜜8-12％、玉米粉4-8％、清糠40-70％、磷酸二氫鉀0.03-0.06％、磷酸二氫鈉1-2％、硫酸鎂0.4-0.8％、尿素1-2％、無(wú)菌水15-45％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法，其特征在于，所述的步驟4的特殊載體由沸石粉、碳酸鈣組成，其重量百分配比為沸石粉40-50％、碳酸鈣50-60％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用乳酸桿菌和酵母菌生產(chǎn)微生物多糖制劑的制備方法，其特征在于，采用有益菌株的液體培養(yǎng)；離心收集菌體細(xì)胞壁；然后將菌群進(jìn)行固體擴(kuò)大培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中添加收集富含多糖的細(xì)胞壁。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品中的高濃度乳酸菌能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物的消化吸收功能，同時(shí)產(chǎn)生的肽聚糖增加了水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)病原體的免疫能力；產(chǎn)品中高濃度的酵母菌能提高魚(yú)體生長(zhǎng)需要的豐富的單細(xì)胞蛋白，同時(shí)，酵母細(xì)胞被充分破壁，釋放出大量的β－1，3葡聚糖，顯著提高對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的免疫能力，采用糧食作物和常用飼料載體作為主要培養(yǎng)基原料，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)使用常用的發(fā)酵及生產(chǎn)設(shè)備，易于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101085982SQ20061002755
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2006年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月11日
發(fā)明者江瀚 申請(qǐng)人:上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司