專利名稱：甲醇酵母生產(chǎn)人激肽釋放酶－1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是采用基因工程的手段，通過(guò)甲醇酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模獲得一種新型重組蛋白-------甲醇酵母表達(dá)的重組人激肽釋放酶-1(Recombinant HumanKallikrein-1，r-hK1)，特別對(duì)r-hK1分子性質(zhì)的研究，以及體內(nèi)、體外活性的測(cè)定和試驗(yàn)，表明r-hK1可望成為治療腦梗塞的藥物。
背景技術(shù)：
早在1926年，F(xiàn)rey等就從人尿液中獲得了一種能引起血壓下降的成分，當(dāng)時(shí)稱之為血管舒緩素，不過(guò)，后來(lái)的研究者發(fā)現(xiàn)，該蛋白酶類成分也廣泛分布于血漿、胰腺、腎臟、唾液腺、腸、胰液之中，尤其胰腺中含量最高。1930年，希臘的Kraut H.等將從胰腺分離提取的這種成分命名為Kallikrein(希臘語(yǔ)Kallikreas是‘胰腺’，故稱胰腺中獲得的蛋白酶類為Kallikrein)。但是，隨著對(duì)這一類蛋白酶功能、分布和作用機(jī)理等方面的深入研究，在不同時(shí)期，研究人員對(duì)Kallikrein有著不同的稱謂，例如Kininogenase、Kallidinogenase和Kininogenin。事實(shí)上，在中文譯名中，‘激肽釋放酶’‘激肽原酶’、和‘激肽酶’等稱謂也是混用的。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)Kallikrein的中文譯名的使用也不統(tǒng)一，甚至近年來(lái)國(guó)內(nèi)發(fā)表的文章中仍對(duì)同一種成份使用不同名稱，例如‘尿激肽原酶’、‘尿激肽釋放酶’、‘胰激肽原酶’、‘胰腺激肽釋放酶’、‘組織激肽釋放酶’等。
在本專利中Kallikrein一詞譯為‘激肽釋放酶’，Kininogenase、Kallidinogenase和Kininogenin這三個(gè)詞中包含有激肽原或激肽一詞的詞根，似乎應(yīng)稱為‘激肽原酶’更妥。雖然‘激肽釋放酶’或‘激肽原酶’最早是在胰腺等特定組織器官中發(fā)現(xiàn)的，但是，由于其在動(dòng)物體內(nèi)分布廣、種類多，所以，在本專利的描述中將不再用組織或器官或來(lái)源等詞語(yǔ)來(lái)限定提及的某種激肽釋放酶。
早期，研究者將人的激肽釋放酶(Human Kallikrein，下文中簡(jiǎn)稱hK)分成血漿型和組織型兩大類。血漿型hK主要是在人的肝臟中表達(dá)，再分泌進(jìn)入血液的，它參與血液的凝固、纖維蛋白的水解、血壓的調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程；而組織型hK，是在胰腺、腎臟、唾液腺、乳腺、卵巢、睪丸和前列腺等部位產(chǎn)生，能對(duì)一些多肽(如，激肽原、胰島素原、腎素原等)進(jìn)行翻譯后加工，從中釋放出具有生理活性肽類(如，激肽，胰島素、腎素等)。現(xiàn)在，根據(jù)含量的高低以及發(fā)現(xiàn)的先后順序，國(guó)際上已經(jīng)統(tǒng)一將除血漿型hK之外的所有組織型hK進(jìn)行了命名，依次為hK1、hK2、hK3.......hK15等，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名的有15種之多(陳渝春國(guó)外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè).2003，23(4)386～88；Yousef GM，ObiezuCV，etal Human tissue kallikreinsfrom gene structure to function and clinical applications.Adv.in Clin.Chem.2005，3911-79.)。追溯早期研究者所描述的組織型hK，也就是來(lái)自胰腺、腎、唾液腺和尿液中hK不難發(fā)現(xiàn)，它并不包括后來(lái)發(fā)現(xiàn)并命名的這些種類的組織型hK。實(shí)際上，早年文獻(xiàn)中所說(shuō)的組織型激肽釋放酶、胰腺激肽釋放酶、唾液腺激肽釋放酶等按新分類標(biāo)準(zhǔn)，都是同一種成分，應(yīng)該稱之為人激肽釋放酶-1(Human Kallikrein 1，簡(jiǎn)稱hK1)，這也是本專利要描述的對(duì)象。本專利中將酵母分泌表達(dá)的hK1稱為重組人激肽釋放酶-1(Recombinant Human kallikrein-1，簡(jiǎn)稱r-hK1)。
hK1屬于絲氨酸蛋白酶類的肽酶S1家族(或稱激肽釋放酶亞族)。它能夠特異性水解低分子量或高分子量激肽原(Kininogen)蛋白分子中的Met-Lys或Arg-Ser氨基酸殘基間的肽鍵，分別釋放出激肽Lys-bradykinin或Kallidin。這些水解釋放出來(lái)激肽將對(duì)機(jī)體的血壓、電解質(zhì)平衡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。特別應(yīng)該注意的是，hK1能優(yōu)先切開(kāi)小分子生色底物S-2266(Val-Leu-Arg-pNA)中-Arg-pNA之的間肽鍵，這也是采用S-2266測(cè)定天然的hK1和r-hK1活性的基礎(chǔ)。(Gurunathan Laxmikanthan.etal 1.70 A0 X-RayStructure of Human Kallikrein 1Structural Changes Upon Peptide Inhibitor/SubstrateBinding Proteins.Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics 58802-814，2005)。
hK1在人體中的含量最高，其代謝后大部分又以完整的有活性的糖蛋白形式經(jīng)腎臟排泄。目前，從人尿中分離純化的hK1已經(jīng)用于臨床實(shí)踐。例如，廣州天普公司2005年4月獲得SFDA生產(chǎn)批文的人尿激肽原酶(商品名‘凱力康’，注射用尤瑞克林)就是來(lái)自人尿的生物提取品。人的hK1屬于熱穩(wěn)定性單鏈糖蛋白，由于糖基化的程度不同，所以分子量變化范圍也比較大(MW27～40kDa)。
國(guó)內(nèi)外對(duì)采用基因工程的方法生產(chǎn)hK1的工作都進(jìn)行過(guò)不少研究。德國(guó)的研究者，1989年就進(jìn)行了在E.coli中表達(dá)人唾液腺hK(即hK1)的研究工作(Angermann，A.etal Cloningand expression of human salivary-gland kallikrein in E.coli.Biochem J 1989，262(3)787-793)，但每升發(fā)酵液中的表達(dá)產(chǎn)量只有200～500μg，而Jing Wang等在美國(guó)(Jing Wang，Julie Chao etal Purification and characterization of recombinant tissue kallikrein from E.coliand yeast.Biochem.J.1991，27663-71)用E.coli和啤酒酵母(S.cerevisiae)系統(tǒng)表達(dá)大鼠組織型激肽釋放酶(類似hK1)，并用DEAE-Sepharose CL-6B結(jié)合Aprotinin-親和介質(zhì)進(jìn)行分離純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E.coli表達(dá)的N-端多一個(gè)蛋氨酸(Met)的大鼠激肽釋放酶的活性同天然的并沒(méi)有差別。但是，利用酵母α-信號(hào)肽分泌表達(dá)大鼠激肽釋放酶時(shí)，有一部分表達(dá)產(chǎn)物不能順利切除信號(hào)肽，這樣活性激肽釋放酶產(chǎn)量極低(約0.5～1mg/L發(fā)酵上清液)。另外，他們?cè)贓.coli表達(dá)的也多是包含體，表達(dá)產(chǎn)量很低，采用放射免疫分析法進(jìn)行定量，包含體的產(chǎn)量大約只有30～50mg/L發(fā)酵液。1993年，德國(guó)的研究者Georg Fertig等(GeorgFertig etal Biotech-nological aspects of the production of human pro-kallikrein using theAcNPV-baculovims-expression system Cytotechnology 1167-75，1993)用昆蟲(chóng)核形多角體病毒(AcNPV)表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人激肽釋放酶原(Human Pro-kallikrein，Pro-hK1)，篩選出的高表達(dá)細(xì)胞株在連續(xù)培養(yǎng)13天后，5L罐發(fā)酵所獲得的Pro-hK1折算成活性單位總產(chǎn)量也大約有7960U。之后，Lu等(Lu HS，Hsu YR，etal Isolation andcharacterization of human tissue kallikrein produced in E.colibiochemical comparison to theenzymatically inactive prokallikrein and methionyl kallikrein.Protein Expr Purif.1996，8(2)215-26.)在E.coli表達(dá)了Pro-hK1和Met-激肽釋放酶(Met-hK1)，Pro-hK1大體經(jīng)過(guò)表達(dá)、包含體溶解、蛋白折疊復(fù)性、嗜熱菌蛋白酶酶切激活、層析分離純化等步驟后，獲得了與天然品具有同樣的生物學(xué)活性hK1。Pro-hK1和Met-hK1的結(jié)構(gòu)雖然與hK1相似，但是都沒(méi)有生物學(xué)活性，這似乎同前面Jing Wang等研究者的結(jié)果是相矛盾的。同時(shí)，這些研究者(LuHS，etal Purification and characterization of human tissue prokallikrein and kallikrein isoformsexpressed in Chinese hamster ovary cells.Protein Expr.Purif.1996，8(2)227-37.)又在CHO中表達(dá)人的基因組全長(zhǎng)前激肽釋放酶原基因(Preprokallikrein，Prepro-hK1)，重組激肽釋放酶原這種無(wú)活性的酶原被大量分泌到發(fā)酵液中，在純化過(guò)程中，經(jīng)過(guò)嗜熱菌蛋白酶酶切激活后，就可以將Pro-hK1和hK1分別純化出來(lái)。所獲得的rhK1同天然品比較，其比活性沒(méi)有明顯區(qū)別，但是Pro-hK1或hK1的分子本身并不均一，這些蛋白的分子量和電荷有差別。研究者推測(cè)是分子的N-糖基化修飾程度以及糖鏈的唾液酸殘基數(shù)目不同所致。
有關(guān)hK1基因工程生產(chǎn)的突破性工作應(yīng)該是Hedy Chan等(Hedy Chan，etal Expressionand Characterization of Human Tissue Kallikrein Variants.Protein Expr & Purif.1998，12361-370)將人的三種激肽釋放酶原變異體(Pro-hK1)基因在甲醇酵母(Pichia pastoris)中分泌表達(dá)，獲得了Pro-hK1蛋白，再經(jīng)過(guò)胰蛋白酶切割，就可以獲得hK1。研究者從人體不同組織的cDNA文庫(kù)中，采用PCR法釣出Pro-hK1基因，獲得了三種氨基酸殘基略有不同的Pro-hK1基因(這中變異是PCR過(guò)程中產(chǎn)生的點(diǎn)突變或是組織中實(shí)際就有的差異尚未確定)。甲醇酵母表達(dá)的產(chǎn)量比以前的研究報(bào)道的都要高的多，達(dá)到約30mg/L發(fā)酵上清液，但是分泌表達(dá)出的rhK1在SDS-PAGE電泳時(shí)有兩條帶，產(chǎn)品不均一。
在國(guó)內(nèi)，中科院大連物理化學(xué)所的研究者等描述了(Yang Q.etal Purification of humantissue prokallikrein excreted from insect cells by liquid chromatography.J Pharm Biomed Anal.2005，39848-52.)用三步液相層析法，純化由昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的Pro-hK1，得率為57％，產(chǎn)品純度為95％。但是，這項(xiàng)工作也只能視作Georg Fertig等研究者工作的延伸。不過(guò)，到目前為止，將昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的成分用于治療性藥物的產(chǎn)品尚沒(méi)有報(bào)道，所以這方面的工作目前尚不具備醫(yī)藥用途。
綜上可見(jiàn)，國(guó)外的這些在E.coli、CHO、昆蟲(chóng)細(xì)胞、啤酒酵母或甲醇母中進(jìn)行的研究，都是Pro-hK1或Prepro-hK1或Met-hK1的表達(dá)為主，而進(jìn)行直接分泌表達(dá)hK1蛋白的工作時(shí)，發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列并不能順利切除。除了Hedy Chan等獲得了產(chǎn)量稍高的工程菌外，其它研究者的工作基本上都屬于純研究性質(zhì)的，從其產(chǎn)量、制備成本以及活性的等方面來(lái)看，也都表明大量制備rhK1極為困難。Hedy Chan等也是先獲得Pro-hK1，在酶切處理后獲得hK1的，盡管他們發(fā)現(xiàn)Pro-hK1在分泌時(shí)有一部分會(huì)直接以hK1形式分泌，但還有一部分是以Pro-hK1形式分泌入發(fā)酵上清中。因此，這種表達(dá)方式從產(chǎn)量和純化過(guò)程來(lái)看也不具備生產(chǎn)價(jià)值。
雖然國(guó)內(nèi)的研究者也進(jìn)行了E.coli中表達(dá)hK1的研究，如廣州的李體遠(yuǎn)等(李體遠(yuǎn)等人組織激肽釋放酶成熟蛋白的純化及活性分析《中國(guó)生物制品學(xué)雜志》18(1)33～35，2005)，杜珙，李體遠(yuǎn)等人胰激肽原酶的表達(dá)《中國(guó)藥學(xué)雜志》38(6)465～467，2003)用pMBP載體，在E.coli中，將hK1同麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)進(jìn)行融合分泌表達(dá)，在6L罐發(fā)酵的條件下，總共只獲得了24mg MBP-hK1融合蛋白，經(jīng)過(guò)凝血酶切割，才能獲得有活性hK1。這些研究同國(guó)外在E.coli中的工作一樣，不僅表達(dá)產(chǎn)量低，也沒(méi)有解決純化問(wèn)題。袁新清等(袁新清 陳勁春 人胰激肽原酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)《北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)》31(6)33～35，2004)在甲醇酵母表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)中直接表達(dá)hK1，發(fā)酵上清中hK1產(chǎn)量約40mg/L，而從研究者提供的信息中也不清楚其表達(dá)產(chǎn)量的確定方法，也沒(méi)有這項(xiàng)研究的后續(xù)性工作。綜合目前有關(guān)hK1的研究，所有r-hK1的制備有面臨工程菌株表達(dá)產(chǎn)量底，產(chǎn)品不均一，純化工藝復(fù)雜，有效收率很低的缺點(diǎn)。
本專利是根據(jù)Genebank中已經(jīng)公布的人hK1基因序列資料，合成其成熟蛋白基因序列的5`-和3`-引物，從商品化的人腎cDNA中釣取了hK1基因。將該基因插入到Invitrogen公司的pPICZ α A表達(dá)載體的限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI位點(diǎn)之間，線性化處理表達(dá)載體后，電轉(zhuǎn)化甲醇酵母宿主菌X33，在YPD+Zeocin抗性平板上篩選陽(yáng)性克隆，并按常規(guī)操作篩選獲得了高表達(dá)的工程菌株。該菌株可以利用載體自身的酵母α-信號(hào)肽分泌表達(dá)r-hK1蛋白，并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)α-信號(hào)肽無(wú)法切除的情況發(fā)生，表達(dá)產(chǎn)量高達(dá)1.25～1.35g/L發(fā)酵上清液，r-hK1產(chǎn)品雖有糖基化修飾程度的差別，但蛋白的N-、C-端均一，通過(guò)純化過(guò)程可以獲得糖基化程度一致的r-hK1蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
1.hK1基因的獲得和pPICZα-hK1表達(dá)載體的構(gòu)建 綜合GeneBank中已經(jīng)獲得的人激肽釋放酶-1(Homo sapines Kallikrein-1)基因(AY094609、NM-002257、BC005313、X13561、AY890098、AY890097、AY703451)的序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增hK1基因的5`-和3`-引物，以Panomics公司的人腎cDNA文庫(kù)為模板，用PCR法獲得了人hK1基因。
為將目的基因正確地插入到pPICZ α A載體中，5′-引物帶有XhoI位點(diǎn)(CTCGAG)，并在XhoI位點(diǎn)和hK1基因前加入Kex2蛋白酶的識(shí)別序列Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAAAGA，3`-引物是在hK1的羧端最后一個(gè)氨基酸殘基的密碼子之后添加終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶NotI位點(diǎn)(GCGGCCGC)，這樣一來(lái)，PCR出的hK1基因經(jīng)過(guò)XhoI和NotI雙切后就可以插入到pPICZ α A載體的XhoI-NotI位點(diǎn)之間，這樣就獲得了分泌型表達(dá)載體pPICZ α-hK1。
2.工程菌株的篩選 將測(cè)序確認(rèn)為正確的pPICZ α-hK1表達(dá)載體用SacI線性化處理，電轉(zhuǎn)線性化后的hK1表達(dá)載體至甲醇酵母X33感受態(tài)細(xì)胞中，鋪YPDZ(YPD+1.5％Agar+500μg/ml Zeocin)平板，篩選陽(yáng)性克隆。用YPD培養(yǎng)液增殖陽(yáng)性克隆，約6～8小時(shí)，當(dāng)菌體OD500達(dá)到2～3時(shí)，保存一份菌液為原始種子，并將其余菌液4000rpm離心，上清凍存作對(duì)照，而將菌體懸浮后轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)液BMMY，300rpm振蕩培養(yǎng)，每過(guò)12小時(shí)補(bǔ)無(wú)水甲醇至甲醇之終濃度為0.5％，如此維持甲醇誘導(dǎo)狀態(tài)約48小時(shí)。用誘導(dǎo)前上清作對(duì)照，電泳檢測(cè)是否有目的蛋白hK1條帶出現(xiàn)。同時(shí)，根據(jù)hK1活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法(見(jiàn)實(shí)施例2)測(cè)定活性變化，并根據(jù)活性差別，篩選更多數(shù)目的陽(yáng)性克隆，以便獲得高表達(dá)的r-hK1工程菌株。
3.發(fā)酵工藝的確定 甲醇酵母的發(fā)酵可分為菌體增殖、限速生長(zhǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)這三個(gè)相輔相成的階段，控制好這三個(gè)階段的關(guān)鍵性參數(shù)就能獲得目的蛋白的高表達(dá)。
菌體增殖階段整個(gè)發(fā)酵階段的溫度均為30.0℃。用氨水將初始全鹽培養(yǎng)基的pH值調(diào)為5.0，起始攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量0.5vvm，溶氧DO100％，進(jìn)行菌體增殖培養(yǎng)。當(dāng)罐中起始培養(yǎng)基內(nèi)的甘油耗盡后，DO值會(huì)急劇上升(DO Spike)，繼續(xù)補(bǔ)充碳源(甘油或葡萄糖等)提高菌體密度，此時(shí)，即進(jìn)入發(fā)酵的限速生長(zhǎng)階段。
限速生長(zhǎng)階段維持DO≥20％，繼續(xù)流加甘油，使發(fā)酵液中的菌體濕重達(dá)到180～200g/L。當(dāng)菌體濕重達(dá)到要求后就用氨水，將發(fā)酵的pH值上調(diào)為6.0，準(zhǔn)備進(jìn)入誘導(dǎo)表達(dá)階段。
誘導(dǎo)表達(dá)階段暫停碳源補(bǔ)給，饑餓菌體30分鐘后，再開(kāi)始補(bǔ)給甲醇，并緩慢增加甲醇的量，待菌體適應(yīng)后，維持DO值≥20％的水平基礎(chǔ)上以最大速率補(bǔ)加誘導(dǎo)物甲醇，并保持此狀態(tài)至發(fā)酵結(jié)束。
4.人激肽釋放酶的活性測(cè)定方法 4.1.測(cè)定的原理 hK1能特異性水解發(fā)色底物S-2266(Val-Leu-Arg-pNA，Chromogenix)分子中-Arg-pNA之間的化學(xué)鍵釋放出pNA，游離的pNA分子的特征性吸收峰是405nm，單位時(shí)間內(nèi)釋放的游離的pNA量(A405值)同酶的活性成正比，所以，根據(jù)A405值就可以計(jì)算hK1的活性。
4.2.測(cè)定所用試劑和溶液 進(jìn)行該項(xiàng)測(cè)定所用的試劑有發(fā)色底物S-2266溶液(2mM)，稀釋緩沖溶液(20mMTris-Cl，pH8.0)，反應(yīng)緩沖液(0.2M Tris-Cl，pH8.0)及反應(yīng)終止液(50％醋酸溶液)。
4.3.活性測(cè)定的過(guò)程 根據(jù)估計(jì)的待測(cè)樣品濃度，用20mM Tris-Cl，pH8.0緩沖液將待測(cè)樣品稀釋成一系列倍數(shù)，如100、200、300等。在潔凈的2ml西林瓶中加入400ul 0.2M pH8.0 Tris-Cl緩沖液，再加入20μl稀釋后的待測(cè)定樣品溶液，對(duì)照樣則加入20μl稀釋緩沖溶液，混勻后，37℃水浴保溫5分鐘使各測(cè)定管中溶液溫度一致，再分別各加入40μl發(fā)色底物S-2266，混勻，精確計(jì)時(shí)，并于37℃水浴反應(yīng)15分鐘。然后，各反應(yīng)樣品中加入40μl 50％乙酸溶液終止反應(yīng)，分用對(duì)照將分光光度計(jì)調(diào)零，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值A(chǔ)405值，A405值應(yīng)在0.1～0.2之間，不在此范圍時(shí)則增加或減少稀釋倍數(shù)重新進(jìn)行。
4.4.測(cè)定結(jié)果的計(jì)算 游離型pNA的A405摩爾消光系數(shù)為9,600 L mol-1 cm-1，根據(jù)bK1活性單位的含義1PNAU是指在37℃，Tris-Cl，pH8.0緩沖體系中，1分鐘內(nèi)能水解底物S-2266釋放1μmol游離pNA的酶量為一個(gè)hK1活性單位(PNAU)。按照朗伯-比爾(Beer-Lambert)定律，則每毫升待測(cè)樣品中hK1活性單位可按下述公式計(jì)算 PNAU/ml＝0.1736*A405*稀釋倍數(shù) 用S-2266發(fā)色底物測(cè)定hK1活性是整個(gè)研究工作的基礎(chǔ)，采用本方法可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)待測(cè)定樣本(發(fā)酵液、原液、純化中間樣品等)中hK1活性進(jìn)行準(zhǔn)確定量。如果r-hK1的準(zhǔn)確比活性為5.2PNAU/mg，那么要采用此法測(cè)定時(shí)，應(yīng)該將待測(cè)定r-hK1樣品的蛋白濃度稀釋在3.2～6.5μg/ml(相當(dāng)于0.017～0.034PNAU/ml)范圍內(nèi)，這樣就可以減少稀釋樣品的工作量，便于快速獲得結(jié)果。



圖1.試管中對(duì)24孔板上初篩的6個(gè)高抗Zeocin克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá) 泳道0.是誘導(dǎo)表達(dá)前的發(fā)酵上清；泳道1～6.高抗Zeocin抗性(500μg/ml)的克隆誘導(dǎo)48小時(shí)的結(jié)果?？梢?jiàn)，還原(R)和非還原(NR)的SDS-PAGE時(shí)，r-hK1的遷移率有差別，且有兩條靠近的帶。MLMW Marker Kit(Amersham Pharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
圖2.30L發(fā)酵誘導(dǎo)階段產(chǎn)生r-hK1的SDS-PAGE還原電泳 整個(gè)誘導(dǎo)階段每間隔8小時(shí)取樣，每個(gè)泳道下面的數(shù)字表示甲醇誘導(dǎo)的小時(shí)數(shù)。MLMWMarker Kit(Amersham Pharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
圖3.Phenyl-Sepharose FF層析(A)和Superdex75分子篩層析(B)純化 A用20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0緩沖液平衡Phenyl-Sepharose FF層析介質(zhì)。1.將200mM PB，pH6.0和3M(NH4)2SO4母液加至hK1發(fā)酵液中，使其在發(fā)酵液終濃度為20mMPB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，再用0.45μm膜過(guò)濾即成上樣液；2.流出液；3.20mM PB，0.7M(NH4)2SO4，pH6.0時(shí)洗脫峰；4.20mM PB，0.35M(NH4)2SO4，pH6.0時(shí)洗脫峰，其中分子量偏大的和稍低的hK1各占50％左右；5.20mM PB，pH6.0洗脫峰。
BSuperdex75分子篩層析的平衡和洗脫緩沖液均為20mM PB，0.15M NaCl，pH7.5，對(duì)0.5V柱體積時(shí)出現(xiàn)的洗脫峰進(jìn)行分段收集，共分成①、②、③、④、⑤和⑥六段，其中①段分子量最大，量少，質(zhì)譜r-hK1-B測(cè)定的實(shí)際分子量為32871.16Dalton，④段是hK1主峰部分，量最大，質(zhì)譜r-hK1-A測(cè)定其實(shí)際分子量是28975.79Dalton。MLMW Marker Kit(AmershamPharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
圖4.凝膠過(guò)濾層析純化出不同糖基化程度r-hK1的質(zhì)譜 r-hK1-A是電泳分子量偏低的r-hK1，在整個(gè)分泌表達(dá)的蛋白中比例最高，r-hK1-B是SDS-PAGE電泳時(shí)分子量偏高的部分，所占比例較低。MLMW Marker Kit(AmershamPharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
圖5.r-hK1的等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果 泳道M中A和C～L代表的各個(gè)pI標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子是A.Amylglucosidase(3.50)；C.Trypsininhibitor(4.55)；D.b-Lactoglobulin a(5.20)；E.Bovine carbonic anhydrase b(5.85)；F.Humancarbonic anhydrase b(6.55)；G.Myoglobin，acidic band(6.85)；H.Myoglobin，basic band(7.35)；I.Lentil lectin，acidic(8.15)；J.Lentil lectin，middle(8.45)；K.Lentil lectin，basic(8.65)；L.Trypsinogen(9.30)。泳道r-hK1-A是糖基化程度低的蛋白分子；泳道r-hK1-B是糖基化程度高的蛋白分子。r-hK1-A和r-hK1-B對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜如圖4。
圖6.PNGaseF去除r-hK1的N-糖基化修飾后的SDS-PAGE和質(zhì)譜 Ar-hK1是未進(jìn)行脫糖處理時(shí)，De-r-hK1是PNGaseF處理后的r-hK1?？梢钥闯龇肿恿棵黠@變小了。B將De-r-hK1進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，確定其MW為26404.35Dalton，同按r-hK1理論氨基酸序列計(jì)算出的MW非常吻合。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 hK1工程菌株的構(gòu)造 1.hK1基因的獲得和表達(dá)載體pPICZa-hK1構(gòu)建 參考GeneBank中公布的有關(guān)hK1基因全序列資料，設(shè)計(jì)并合成(上海生工)能擴(kuò)增成熟hK1基因的兩條引物Kal5(5`-引物，SEQ-3)Kal3(3`-引物，SEQ-4) Kal5(AA07624) 5`-catctc gag aaa aga att gtg gga ggc tgg gag tgt gag-3` Kal3(AA07625) 5`-cat gcg gcc gct tag gag ttc tcc gct atg gtg tcc tc-3` 以Panomics公司的人腎cDNA文庫(kù)(P/N7202，L/NP0260602)為模板，經(jīng)過(guò)PCR就獲得hK1基因。引物Kal5將在hK1基因5`-端添加DNA限制性內(nèi)切酶XhoI位點(diǎn)(CTCGAG)，和Kex2蛋白酶的識(shí)別序列Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAA AGA，這將保證插入的hK1基因分泌表達(dá)時(shí)能順利切除α-信號(hào)肽，獲得具有天然N-端序列的hK1蛋白分子；引物Kal3在3`-端加終止密碼子TAA和DNA限制性內(nèi)切酶NotI位點(diǎn)(GCGGCCGC)。
用DNA聚合酶(Pyrobest)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如下 Human kidney cDNA------------------1μl Kal5(5`-引物)---------------------2μl Kal3(3`-引物)---------------------2μl dNTP Mix -------------------------1μl 10x Pyrobest Buffer----------------------2μl Pyrobest------------------------------0.25μl ddH2O --------------------------------1175μl總20μl PCR條件94℃變性3分鐘，再按94℃、30秒/55℃、30秒/72℃、1分種的方式循環(huán)30次。PCR結(jié)束后，取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖電泳，能獲得長(zhǎng)度為約為750bp片段就表明PCR成功。
將PCR產(chǎn)物用柱回收試劑盒(Sangon)純化，用限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI雙切經(jīng)過(guò)柱回收的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)膠回收hK1基因。將pPICZ α A載體(Invitrogen)用XhoI和NotI雙切，回收載體的大片段作為插入目的基因的載體，將回收的hK1基因片段同與pPICZ α載體建立如下連接反應(yīng) pPICZ α載體(XhoI-NotI)-----------------2μl hK1基因(XhoI-NotI)------------------4μl 10×Ligation Buffer------------------------1μl T4 DNA Ligase(連接酶)-------------0.5μl ddH2O---------------------------2.5 總10μl 22℃條件下連接反應(yīng)進(jìn)行約1小時(shí)，取上述連接產(chǎn)物5μl與CaCl2法制備的TOP10F′感受態(tài)100μl小心混勻，4℃，30分鐘，42℃，熱休克90秒種，冰上放3～5分鐘，然后加入500μlLB培養(yǎng)液，于37℃ 200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)45分鐘，取100μl菌液涂布于含LZ(LB+Zeocin25μg/ml)+1.5％瓊脂糖的平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，將長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性克隆。從中隨機(jī)挑取6個(gè)單菌落接種于5ml LZ培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒(BioAsia公司)抽提質(zhì)粒，用XhoI和NotI雙切篩選，取能酶切出約750bp片段的克隆測(cè)序確證序列。測(cè)序結(jié)果如SEQ-1，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ-2。這同GenBank中已經(jīng)公布的序列沒(méi)有區(qū)別。
2.工程菌株獲得 按照Invitrogen公司P.methanolica Expression Kit中方法制備X-33感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒表達(dá)載體用SacI酶切進(jìn)行線性化，酚-氯仿抽提除去蛋白，乙醇沉淀用去離子水溶解后的線性化載體與X33感受態(tài)細(xì)胞混勻，電轉(zhuǎn)化，涂布于含Zeocin 500ug/ml的YPD(1％酵母提取物，2％多聚蛋白胨， 2％葡萄糖)平板上，30℃培養(yǎng)2～3天，直到有酵母單菌落生長(zhǎng)出現(xiàn)。根據(jù)Easyselect Pichia Expression Kit中的描述，首先通過(guò)提高Zeocin抗生素的抗性來(lái)篩選重組子，挑取100個(gè)重組子接種于400μl YPD(含Zeocin 600μg/ml)培養(yǎng)液的24孔板中，30℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，將篩出的高抗Zeocin孔留種(6個(gè)符合要求的克隆)共篩選出并轉(zhuǎn)接到試管中補(bǔ)加2ml YPD培養(yǎng)液繼續(xù)增殖，24小時(shí)后離心收集菌體，用含甲醇0.5％的BMMY培養(yǎng)基30℃誘導(dǎo)表達(dá)，24小時(shí)添加甲醇使其在菌液中的終濃度為0.5％，維持這種誘導(dǎo)狀態(tài)48小時(shí)，離心收集菌液上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)誘導(dǎo)前后對(duì)比，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的發(fā)酵上清中有30kDa蛋白條帶表達(dá)出來(lái)。由于電泳觀察蛋白帶型變化很難進(jìn)行準(zhǔn)確判斷表達(dá)產(chǎn)量，所以同時(shí)也采用前面發(fā)明內(nèi)容4.中描述的方法，以誘導(dǎo)前上清作空白對(duì)照，用發(fā)色底物S-2266來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定誘導(dǎo)后發(fā)酵上清中r-hK1活性單位產(chǎn)量。最后確定其中一株高表達(dá)的hK1工程菌株(圖1)作為發(fā)酵用，并建立三級(jí)種子庫(kù)。
實(shí)施例2 r-hK1工程菌的發(fā)酵 1.種子液準(zhǔn)備 取工作種子甘油凍存管，融化后取1ml接種至500ml YPD培養(yǎng)基(1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中，在30℃，300rpm的搖床中培養(yǎng)30小時(shí)至OD600值在6.0±1.0，鏡檢正常就得到種子液上罐接種用。配制發(fā)酵用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM1(K2SO4 60.7克，MgSO424.2克，CaSO4·2H2O 3.9克，H3PO4 89毫升，KOH 13.8克，PTM1 14毫升，甘油400克，泡敵2毫升，以10L為例，以配制1升的微量元素培養(yǎng)基PTM1為例，其中各組份的含量是CuSO4·5H2O 6.0克，NaI 0.008克，MnSO4 3.0克，NaMoO4 0.2克，H3BO3 0.02克，ZnSO4 20.0克，CoCl2 0.5克，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0克，生物素0.2克，H2SO4 5毫升，加水定容為1升)后進(jìn)行實(shí)罐滅菌。滅菌條件為121℃，20分鐘，消后冷至30℃。按1∶15(V/V，種子液基礎(chǔ)罐基培養(yǎng)液BSM1)比例接種。
2.發(fā)酵過(guò)程 初期菌體增殖階段的發(fā)酵溫度為30.0±0.5℃，pH5.00±0.05，起始轉(zhuǎn)速300rpm培養(yǎng)，通氣量0.5vvm，DO值100％，添加PTM1。此階段大約20小時(shí)左右，維持DO值不低于30％，當(dāng)碳源消耗完畢時(shí)，溶氧值迅速地上升，菌體濕重達(dá)到約100g/L，此時(shí)進(jìn)入限速生長(zhǎng)階段，此階段的開(kāi)始2小時(shí)期間，以240ml/小時(shí)的速率補(bǔ)加濃度為50％的甘油溶液。補(bǔ)料2小時(shí)后，補(bǔ)料速率上調(diào)為360ml/小時(shí)。通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量、罐壓(＜0.8bar)使DO值維持在不低于20％的水平。補(bǔ)加約4小時(shí)，菌體濕重約160～180g/L時(shí)，停止補(bǔ)料，DO值上升。DO值上升表明培養(yǎng)基中碳源耗盡，應(yīng)該可以碳源兼誘導(dǎo)物甲醇進(jìn)行補(bǔ)料，這就進(jìn)入發(fā)酵的關(guān)鍵性階段誘導(dǎo)表達(dá)階段用氨水將pH值控制在6.20±0.05，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇。甲醇的起始加入量控制在30ml/小時(shí)，緩慢增加甲醇的加入量，約2小時(shí)后將補(bǔ)料速度設(shè)定為60ml/小時(shí)。誘導(dǎo)4小時(shí)后將甲醇補(bǔ)料速度設(shè)定為120ml/小時(shí)，此時(shí)甲醇誘導(dǎo)成功，菌體可以正常高速度利用甲醇作為碳源。維持DO值不低于20％，溫度30℃，pH值為6.20±0.05，進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，在整個(gè)發(fā)酵期間，每8小時(shí)取一次樣，測(cè)定活性(表1)并SDS-PAGE電泳(圖2)。誘導(dǎo)60小時(shí)時(shí)結(jié)束發(fā)酵過(guò)程，離心收集上清，SDS-PAGE電泳和S-2266發(fā)色底物法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)量。
整個(gè)發(fā)酵誘導(dǎo)階段中，以1毫升發(fā)酵液為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段時(shí)，發(fā)酵液中菌體濕重增加、發(fā)酵上清減少，表達(dá)產(chǎn)物r-hK1蛋白的顯著增加情況。可見(jiàn)，并不是誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng)越好，因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中取樣會(huì)減少發(fā)酵液總體積，菌體大量增加會(huì)使上清大大減少以及誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)久會(huì)使雜蛋白大幅度增加，r-hK1降解增加，權(quán)衡這些因素后將發(fā)酵的誘導(dǎo)時(shí)間定為50～60小時(shí)。
表1.發(fā)酵誘導(dǎo)階段菌體濕重、上清體積和表達(dá)產(chǎn)量比較 實(shí)施例3 r-hK1蛋白的純化 純化過(guò)程由疏水、陰離子交換和凝膠過(guò)濾層析三步組成，其中疏水層析選擇Phenyl-Sepharose FF，陰離子交換介質(zhì)是Q-Sepharose FF，凝膠過(guò)濾層析采用Superdex75。
具體過(guò)程如下 1.發(fā)酵液的預(yù)處理 向發(fā)酵上清液中加入0.2M PB，pH6.0和3.0M(NH4)2SO4溶液至其在發(fā)酵液中的終濃度分別為20mM和1.0M，調(diào)節(jié)pH值至6.0，靜置1小時(shí)后0.45微米濾膜過(guò)濾即成含有20mMPB，1.0M(H4)2SO4，pH6.0的處理后發(fā)酵液(上樣液)，就可以進(jìn)行層析過(guò)程。
2.Phenyl-Sepharose FF疏水層析 將上述處理后的發(fā)酵液上Phenyl Sepharose FF層析柱，柱型為Index70/500，柱床體積為500ml，平衡緩沖液為20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，洗脫緩沖液為20mM PB，0.7M(NH4)2SO4，pH6.0、20mM PB，0.4M(NH4)2SO4，pH6.0和20mM PB，pH6.0，收集各個(gè)洗脫峰。其中目的蛋白r-hK1主要在20mM PB，pH6.0洗脫峰中(圖3A)。
3.Q-Sepharose FF陰離子交換層析 將疏水層析洗脫主峰收集液用1.0M NaOH向上調(diào)節(jié)pH至7.5，稀釋電導(dǎo)≤8.0mS/cm，上Q-Sepharose FF陰離子交換層析柱，柱規(guī)格為5×10cm，柱床體積為200ml，平衡緩沖液20mM PB，pH7.5，洗脫緩沖液為20mM PB，0.2M NaCl，pH7.5和20mM PB，0.5M NaCl，pH7.5，收集各個(gè)洗脫峰。目的蛋白r-hK1主要在20mM PB，0.5M NaCl，pH7.5的洗脫峰中。
4.Superdex 75凝膠過(guò)濾層析 平衡及洗脫采用的是20mM PB，0.15M NaCl，pH7.5緩沖液，將陰離子交換層析洗脫液分批上Superdex 75，柱規(guī)格為6.0×60cm預(yù)裝柱，柱床體積為1700ml，每次上樣量為不超過(guò)柱床體積的5％(約85ml)，分段收集主峰，SDS-PAGE電泳確定純度后合并符合要求的部分，過(guò)濾除菌，即為r-hK1原液(圖3B)。
實(shí)施例4 r-hK1性質(zhì)確證 1.r-hK1比活性測(cè)定 對(duì)純化出的r-hK1進(jìn)行蛋白純度(SDS-PAGE電泳、RP-HPLC)測(cè)定，將純度不低于98％的r-hK1用Lorry法準(zhǔn)確測(cè)定濃度，按照發(fā)明內(nèi)容4.中hK1的活性測(cè)定方法中描述，用S-2266發(fā)色底物測(cè)定活性單位(PNAU)數(shù)。用活性單位(PNAU)/蛋白濃度(mg)，就可以得出r-hK1的比活性，實(shí)際結(jié)果約為5.2PNAU/mg。
2.r-hK1蛋白的質(zhì)譜和N-端和C-端序列測(cè)定 將凝膠過(guò)濾層析分段收集純化出的r-hK1蛋白取分子量偏低的和分子量偏高作為兩組，委托中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞研究所蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蛋白N-端序列分析，結(jié)果表明兩者雖然在分子量上有差別，但是用S-2266發(fā)色底物法測(cè)定其體外活性時(shí)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差別，它們多肽鏈的N-端序列完全一致，N-端前15個(gè)氨基酸殘基均為I-V-G-G-W-E-C-E-Q-H-S-Q-P-W-Q-。利用羧肽酶水解法測(cè)定這兩組r-hK1的羧端三個(gè)氨基酸殘基是-E-N-S。這表明我們利用甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)r-hK1時(shí)并沒(méi)有以前的研究者所描述的N-端不均一現(xiàn)象，電泳顯示的分子不均一是糖基化修飾程度不同所致，但是通過(guò)純化可以分開(kāi)糖基化程度不同的r-hK1蛋白分子。
3.r-hK1蛋白的等電點(diǎn)測(cè)定 采用等電聚焦法測(cè)定r-hK1蛋白的等電點(diǎn)，所用pI標(biāo)準(zhǔn)蛋白是GE Healthcare LifeScience公司的Broad pI Kit pH3～10，高糖基化和低糖基化修飾的r-hK1蛋白的pI也沒(méi)有明顯區(qū)別，都在pI標(biāo)準(zhǔn)蛋白的3.5～4.5位置中間區(qū)域?qū)?yīng)處(圖5)，這表明甲醇酵母表達(dá)的r-hK1的pI約為4.0。
4.r-hK1蛋白的去糖基化試驗(yàn) 按理論推測(cè)，hK1蛋白的氨基酸序列中有三個(gè)可能的N-型糖基化修飾位點(diǎn)，是否這些位點(diǎn)在酵母分泌表達(dá)r-hK1蛋白時(shí)都發(fā)生了糖基化修飾了呢？根據(jù)hK1蛋白的氨基酸序列計(jì)算不發(fā)生修飾的hK1多肽鏈的分子量應(yīng)該是26405.74Dalton，而實(shí)際純化出的r-hK1蛋白的分子量并不均一，從SDS-PAGE電泳可以看出(圖1、圖2、圖3)，但是更準(zhǔn)確的是用質(zhì)譜測(cè)定純化的r-hK1蛋白的分子量，根據(jù)圖4從28975.79Dalton到31871.16Dalton，那么甲醇酵母分泌表達(dá)的r-hK1蛋白在分子量上凈增加的2570.05～5465.42Dalton就應(yīng)該是甲醇酵母分泌表達(dá)時(shí)對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾時(shí)添加上去修飾成分的分子量，也就是說(shuō)修飾增加的N-糖鏈部分占蛋白分子的8.86～17.15％。
用PNGase F蛋白酶(New England BioLabs)按使用手冊(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)操作處理r-hK1，SDS-PAGE電泳可以看出除去N-糖鏈后r-hK1分子變小了(圖6A)，將除去N-型糖鏈的r-hK1(De-r-hK1)進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定(圖6B)，此時(shí)的分子量為26404.35Dalton，同理論計(jì)算出的26405.74Dalton非常接近，這表明甲醇酵母表達(dá)出的r-hK1蛋白中并無(wú)其他的修飾方式，只有酵母的N-型糖基化修飾。
實(shí)施例5 r-hK1對(duì)大鼠局灶性腦缺血的影響 本試驗(yàn)委托中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研究室進(jìn)行，初步結(jié)果如下 1.實(shí)驗(yàn)材料 1.1藥品 受試藥批號(hào)為20060218的r-hK1原液，純度之98％，蛋白濃度4.8mg/ml、活性濃度25PNAU/ml。臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。陽(yáng)性對(duì)照藥尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)0411022)，每50ml注射液中含尼莫地平10mg。溶劑對(duì)照0.9％氯化鈉注射液(上海百特醫(yī)療用品有限公司，產(chǎn)品批號(hào)A6B11307)。
1.2試劑 紅四氮唑(TTC)(上海生工生物工程有限公司，批號(hào)2803B19)，臨用前用PBS緩沖液配成濃度為2％，避光備用。
1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體重從280克至350克，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。
1.4儀器 圖像分析系統(tǒng)(Germany，Leica Microsystems，Type DM LB2)。
2.實(shí)驗(yàn)方法 2.1局部腦缺血模型制備 取雄性大鼠，腹腔注射15％水合氯醛(300mg/kg)麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，小心分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和枕動(dòng)脈，在CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。在距CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，這時(shí)用繞在CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開(kāi)始算距離，當(dāng)插入深度在20mm時(shí)，緊緊系牢CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線，逐層縫合切口。
2.2頸靜脈插管給藥 分離頸外靜脈，穿線兩道備用。遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端動(dòng)脈夾夾閉。斜行剪一切口，將充滿藥液或生理鹽水的靜脈管45度角插入。近心端結(jié)扎導(dǎo)管，除去動(dòng)脈夾。稍稍回抽檢查是否成功，于腦梗模型造成后30min按0.1ml/100g體重給藥。另穿一線于導(dǎo)管下方，將導(dǎo)管末端靜脈結(jié)扎，拔出導(dǎo)管，逐層縫合。回籠飼養(yǎng)。室溫嚴(yán)格控制在24～25℃。24h后斷頭去腦，測(cè)定梗死區(qū)面積及梗死區(qū)重量。
2.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量 實(shí)驗(yàn)分三組(模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，受試藥組)，每組約15只雄性SD大鼠。模型組造模并給予等體積的生理鹽水0.1ml/100g。陽(yáng)性藥對(duì)照組給予尼莫地平注射液0.5mg/kg。受試藥組給予r-hK1 30×10-3 PNAU/kg，0.1ml/100g。
2.4觀察指標(biāo) 術(shù)后24h，先觀察并記錄動(dòng)物的死亡情況，然后將動(dòng)物斷頭取腦，把剝離完整的大腦放入-20℃冰 表2.24小時(shí)內(nèi)各組動(dòng)物死亡計(jì)數(shù) 表3.尼莫地產(chǎn)組腦梗死百分比 n。
表2.24小時(shí)內(nèi)各組動(dòng)物死亡計(jì)數(shù) 表3.尼莫地平組腦梗死百分比 如表2所示，尼莫地平組和r-hK1組24小時(shí)內(nèi)大鼠死亡率顯著低于模型組，提示r-hK1和尼莫地平均可降低急性腦梗動(dòng)物的死亡。
表4.模型組腦梗死百分比 表5.r-hK1組腦梗死百分比 與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
如表6總結(jié)所示，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照藥尼莫地平能顯著地縮小腦梗死區(qū)面積和腦梗死區(qū)重量(P＜0.05)。受試藥r-hK1與模型組比較，能非常顯著地縮小腦梗死區(qū)面積和腦梗死區(qū)重量(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與尼莫地平類似，r-hK1對(duì)急性缺血性腦梗死具有治療作用。
DNA和蛋白質(zhì)的序列描述
SEQ-1序列的資料
(1).序列特征
a.長(zhǎng)度714bp
b.類型核苷酸
c.拓?fù)鋵W(xué)線性
(2).分子類型人胎腎cDNA
(3).序列描述SEQ-1
1 ATTGTGGGAG GCTGGGAGTG TGAGCAGCAT TCCCAGCCCT GGCAGGCGGC
51 TCTGTACCAT TTCAGCACTT TCCAGTGTGG GGGCATCCTG GTGCACCGCC
101 AGTGGGTGCT CACAGCTGCT CATTGCATCA GCGACAATTA CCAGCTCTGG
151 CTGGGTCGCC ACAACTTGTT TGACGACGAA AACACAGCCC AGTTTGTTCA
201 TGTCAGTGAG AGCTTCCCAC ACCCTGGCTT CAACATGAGC CTCCTGGAGA
251 ACCACACCCG CCAAGCAGAC GAGGACTACA GCCACGACCT CATGCTGCTC
301 CGCCTGACAG AGCCTGCTGA TACCATCACA GACGCTGTGA AGGTCGTGGA
351 GTTGCCCACC CAGGAACCCG AAGTGGGGAG CACCTGTTTG GCTTCCGGCT
401 GGGGCAGCAT CGAACCAGAG AATTTCTCAT TTCCAGATGA TCTCCAGTGT
451 GTGGACCTCA AAATCCTGCC TAATGATGAG TGCAAAAAAG CCCACGTCCA
501 GAAGGTGACA GACTTCATGC TGTGTGTCGG ACACCTGGAA GGTGGCAAAG
551 ACACCTGTGT GGGTGATTCA GGGGGCCCGC TGATGTGTGA TGGTGTGCTC
601 CAAGGTGTCA CATCATGGGG CTACGTCCCT TGTGGCACCC CCAATAAGCC
651 TTCTGTCGCC GTCAGAGTGC TGTCTTATGT GAAGTGGATC GAGGACACCA
701 TAGCGGAGAA CTCC
SEQ-2序列的資料
(1).序列特征
a.長(zhǎng)度238氨基酸
b.類型氨基酸
c.拓?fù)鋵W(xué)未知
(2).分子類型蛋白質(zhì)
(3).序列描述SEQ-2
1 IVGGWECEQH SQPWQAALYH FSTFQCGGIL VHRQWVLTAA HCISDNYQLW
51 LGRHNLFDDE NTAQFVHVSE SFPHPGFNMS LLENHTRQAD EDYSHDLMLL
101 RLTEPADTIT DAVKVVELPT QEPEVGSTCL ASGWGSIEPE NFSFPDDLQC
151 VDLKILPNDE CKKAHVQKVT DFMLCVGHLE GGKDTCVGDS GGPLMCDGVL
201 QGVTSWGYVP CGTPNKPSVA VRVLSYVKWI EDTIAENS
SEQ-3序列的資料
(1).序列特征
a.長(zhǎng)度39nt
b.類型核苷酸
c.拓?fù)鋵W(xué)線性
(2).分子類型人工合成序列
(3).序列描述SEQ-3
1 CATCTCGAGA AAAGAATTGT GGGAGGCTGG GAGTGTGAG 39
SEQ-4序列的資料
(1).序列特征
a.長(zhǎng)度38nt
b.類型核苷酸
c.拓?fù)鋵W(xué)線性
(2).分子類型人工合成序列
(3).序列描述SEQ-4
1 CATGCGGCCG CTTAGGAGTT CTCCGCTATG GTGTCCTC38
權(quán)利要求
1.一種由甲醇酵母(Pichiapastoris)系統(tǒng)高效分泌表達(dá)，并經(jīng)過(guò)發(fā)酵、純化過(guò)程制備且含有糖基化修飾的重組人激肽釋放酶-1(r-hK1)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的高效分泌表達(dá)，是指上罐發(fā)酵時(shí)所獲得的發(fā)酵上清中r-hK1的蛋白產(chǎn)量可達(dá)到1.2g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所制備的r-hK1的分子量范圍是28～32kDa，整個(gè)分子是一條含有238氨基酸殘基的多肽鏈，其N-端前15個(gè)氨基酸殘基為I-V-G-G-W-E-C-E-Q-H-S-Q-P-W-Q-，C-末端3個(gè)氨基酸殘基為-E-N-S，分子內(nèi)全部為甲醇酵母的N-型糖鏈修飾，其中糖類占整個(gè)糖蛋白的8.86～17.16％，蛋白的等電點(diǎn)(pI)約為4.0。r-hK1的基因及氨基酸序列分別為SEQ-1和SEQ-2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所制備的r-hK1，采用S-2266發(fā)色底物法確定的比活性為5.2 PNAU/mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所指的發(fā)酵是采用全鹽培養(yǎng)基，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)r-hK1時(shí)的pH6.2，溫度為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間50小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所指的純化是由疏水層析(Phenyl-SepharoseFF)捕獲、陰離子交換層析(Q-SepharoseFF)除去雜蛋白并濃縮目的蛋白r-hK1，以及凝膠過(guò)濾層析(Superdex-75)分段收集獲得高純度r-hK1這三步層析純化過(guò)程組成。其中Phenyl-Sepharose FF疏水層析的最適上樣條件是20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，最適洗脫條件是20mM PB，pH6.0，Q-Sepharose FF陰離子交換層析的上樣電導(dǎo)率不高于8.0mS/cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所制備的r-hK1可以顯著降低大鼠腦梗塞動(dòng)物模型的死亡率。
全文摘要
本發(fā)明是采用基因工程的方法，在甲醇酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組人激肽釋放酶－1(Recombinant Human Kallikrein－1，r－h(huán)K1)，對(duì)r－h(huán)K1的發(fā)酵和層析純化過(guò)程，特別是對(duì)其分子量、等電點(diǎn)、糖含量以及糖修飾類型等有關(guān)分子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了描述。通過(guò)對(duì)r－h(huán)K1體外、體內(nèi)活性的測(cè)定和試驗(yàn)，表明r－h(huán)K1可望成為治療和預(yù)防腦梗塞的藥物。
文檔編號(hào)C12N9/00GK101092598SQ20061002775
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2006年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月19日
發(fā)明者黃秀東, 陳佩新, 王俊, 陳耀國(guó), 袁靖宇, 王書(shū)生, 潘學(xué)工, 曹之舫 申請(qǐng)人:上海萬(wàn)興生物制藥有限公司