專利名稱：管花肉蓯蓉鑒定引物dna序列及管花肉蓯蓉鑒別方法
技術領域：
本發(fā)明是一種檢測中藥材的技術領域的鑒定引物DNA序列及鑒別方法，具體是一種管花肉蓯蓉鑒定引物DNA序列及管花肉蓯蓉鑒別方法。
背景技術：
肉蓯蓉(Herba Cistanches)，俗稱大蕓。中國藥典(2005年版)規(guī)定肉蓯蓉為列當科(Orobanchaceae)植物肉蓯蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或管花肉蓯蓉C.tubulosa(Schrenk)Wight的干燥帶鱗葉的肉質莖，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效。肉蓯蓉屬為寄生植物，生于干旱沙漠，寄主為梭梭(Haloxylon ammodena(C.A.Mey.)Bunge)、白梭梭(H.persicum)、檉柳(Tamarixspp.)、鹽爪爪(Kalidium spp.)等，世界約有20余種，我國分布有荒漠肉蓯蓉(C.deserticola)、管花肉蓯蓉(C.tubulosa)、鹽生肉蓯蓉(C.salsa)、沙蓯蓉(C.sinensis)和蘭州肉蓯蓉(C.lanzhouensis)，也有報道稱蘭州肉蓯蓉實際為沙蓯蓉。由于肉蓯蓉生長繁殖的特殊性，加之療效顯著而被人為的濫挖以及大批砍伐其寄主梭梭，致使肉蓯蓉野生資源急驟減少，因此同屬其它植物也在各地區(qū)作肉蓯蓉入藥。市場上甚至也有以列當(Orobanche cumina)及鎖陽(Cynomoriumsongaricum)混淆使用。
鑒于肉蓯蓉藥材資源緊缺以及市場上偽品較多等問題，因此需要快速、準確鑒別藥材真?zhèn)蔚姆椒?。然而傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別要求有一定的經(jīng)驗，對于破碎后的藥材就更加難以準確鑒別。DNA分子標記直接分析生物基因型而非表現(xiàn)型，所以鑒定結果不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)和材料來源的影響，不僅可以彌補中藥的形態(tài)鑒別中的主觀因素，同時具有用量少、效率高、準確可靠的特點，對于肉蓯蓉的資源保護與藥材鑒別有著重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種對管花肉蓯蓉藥材能夠準確鑒別其真?zhèn)蔚木酆厦告準椒磻囊锛捌滂b定方法。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明所設計的管花肉蓯蓉聚合酶鏈式反應的鑒定引物的序列為引物15’-AGT CTT GAC CCG CGA TTT-3’引物25’-ACA ACG GAA GGC ATA GAA-3’中藥管花肉蓯蓉的聚合酶鏈式反應鑒定的方法為1)肉蓯蓉藥材的DNA的提??；2)鑒別性聚合酶鏈式反應反應體系以25μl為參考，鑒定引物用無離子水調(diào)至10mM，采用TIANGEN公司的2×Taq Plus Master Mix進行反應；反應條件94℃預變性5分鐘，然后按下列參數(shù)進行40次循環(huán)反應；3)聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的檢測取上述反應混和液6～8μl，與2μl加樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠(含0.5％溴化乙錠，即EB)，電壓5v/cm，電泳檢測擴增結果。
4)若有陽性擴增，則供試樣品為正品管花肉蓯蓉；若為陰性，即無擴增條帶，則供試樣品不為管花肉蓯蓉。
所述的肉蓯蓉藥材DNA的提取，可以采用QIAGEN公司的DNeasy PlantMini Kit，具體方法(1)稱取干燥藥材樣品400mg，分別用蒸餾水和75％酒精沖洗表面，剪至1～2mm碎片，置于滅菌的研缽中，加入液氮并迅速研磨成細粉，置于2ml離心管中。
(2)加入400μl提取緩沖液AP1和4μlRNase A貯存液(100mg/ml)，用渦旋混勻器混勻。40℃保溫30min-60min，其間翻轉2-3次以保證充分混勻。
(3)加入130μl緩沖液AP2，混勻后置冰上恒溫30min。1,0000rpm離心10min。
(4)將上清液轉移置2ml的QIA shredder Mini Spin Column收集管中，1,0000rpm離心10min。得到的離心液轉移至一個新的離心管中。
(5)加入1.5倍體積的緩沖液AP3/E，混勻。吸取650μl混合液(包括產(chǎn)生的絮狀沉淀)，加入到2ml的DNeasy Mini Spin Column收集管中，8,000rpm離心1min，棄離心液。
(6)重復上一步操作，直至加完所有的混合液，棄離心液和收集管。
(7)將DNeasy Mini Spin Colum置于新的2ml收集管中，加入500μl緩沖液AW，8,000rpm離心1min，棄離心液。
(8)在DNeasy Mini Spin Colum中加入500μl緩沖液AW，1,0000rpm離心10min以干燥膜。
(9)將DNeasy Mini Spin Colum置于新的1.5ml離心管中。吸取50μl 65℃預熱的緩沖液AE，小心加入至離心柱膜上，室溫放置5min后，8,000rpm離心1min洗脫，收集洗脫液。
(10)重復洗脫一次。合并洗脫液，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 所述的鑒別性聚合酶鏈反應，是指(1)反應體系以25μl為參考，引物用無離子水調(diào)至10mM，采用TIANGEN公司的2×Taq Plus Master Mix進行反應，聚合酶鏈式反應各試劑的用量分別為2×Taq Plus Master Mix 12.5μl引物1(10mM) 1μl引物2(10mM) 1μl總DNA模板 25ng無離子水補齊到25μl，混勻后，瞬時離心。
(2)聚合酶鏈反應條件反應在PCR儀上進行，94℃預變性5分鐘，然后按照下列參數(shù)進行40次循環(huán)反應變性94℃ 50秒復性52～56℃ 1分鐘延伸72℃ 1分鐘循環(huán)結束后在72℃保持8分鐘補齊，反應結束后在4℃保存。
所述的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的檢測，是指取出上述反應混和液6～8μl，與2μl加樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠(含0.5％溴化乙錠，即EB)，電壓5v/cm，電泳檢測擴增結果。
若有陽性擴增，則供試樣品為正品管花肉蓯蓉；若為陰性，即無擴增條帶，則供試樣品不為管花肉蓯蓉。
本發(fā)明解決了中藥材管花肉蓯蓉真?zhèn)蔚蔫b別問題，設計了可以鑒別管花肉蓯蓉的一對高效特異性引物，該引物在給定的反應條件下，能夠特異性地鑒別管花肉蓯蓉，對于其他種類的肉蓯蓉或偽品均不能擴增出相應的DNA片段。由于應用了PCR方法，因此可以快速方便地檢測樣品的真?zhèn)?，通常只需要極少量的樣品，用此引物可以制造用于管花肉蓯蓉鑒別的試劑盒。本發(fā)明對于從事中藥生產(chǎn)、銷售的部門快速準確地鑒定管花肉蓯蓉，控制藥材質量是十分必要的，對于各地藥檢部門打擊假冒偽劣藥材，凈化藥材市場將是十分有效的。


圖1本發(fā)明PCR實施結果示意圖其中M為1kb DNA分子量梯度，1為荒漠肉蓯蓉，2為鹽生肉蓯蓉，3為沙蓯蓉，4為管花肉蓯蓉，5為鎖陽，6為草蓯蓉，7為列當，CK為空白對照。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明首先用植物DNA提取試劑盒(QIAGEN，Germany)加以改進的方法從肉蓯蓉藥材的不同種的原植物以及混淆品的列當、鎖陽等植物中提取總DNA，用PCR方法擴增多個基因片段并分別純化，將各純化的片段進行DNA序列分析，建立管花肉蓯蓉藥材及其偽、混品的DNA序列數(shù)據(jù)庫。在比較數(shù)據(jù)庫的基礎上，針對藥材偽、混品出現(xiàn)的情況選擇合適的DNA區(qū)段，設計一對鑒別性PCR引物引物15’-AGT CTT GAC CCG CGA TTT-3’；引物25’-ACA ACG GAA GGC ATA GAA-3’。
用全自動DNA合成儀按上述DNA序列進行合成，即可得到鑒定引物的白色粉末結晶。
以上均為本發(fā)明的基礎工作，本發(fā)明的使用者只需按實施例實施即可1.肉蓯蓉藥材DNA的提取，采用QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit進行提取(1)稱取干燥藥材樣品400mg，分別用蒸餾水和75％酒精沖洗表面，剪至1-2mm碎片，置于滅菌的研缽中，加入液氮并迅速研磨成細粉，置于2ml離心管中。
(2)加入400μl提取緩沖液AP1和4μl RNase A貯存液(100mg/ml)，用渦旋混勻器混勻。40℃保溫30min-60min，其間翻轉小管2-3次，保證充分混勻。
(3)加入130μl緩沖液AP2，混勻后置冰上恒溫30min。1,0000rpm離心10min。
(4)將上清液轉移置2ml的QIAshredder Mini Spin Column收集管中，1,0000rpm離心10min。得到的離心液轉移至一個新的離心管中，注意不要吸入沉淀。
(5)加入1.5倍體積的緩沖液AP3/E，混勻。吸取650μl混合液(包括產(chǎn)生的絮狀沉淀)，加入到2ml的DNeasy Mini Spin Column收集管中，8,000rpm離心1min，棄離心液。
(6)重復上一步操作，直至加完所有的混合液，棄離心液和收集管。
(7)將DNeasy Mini Spin Colum置于新的2ml收集管中，加入500μl緩沖液AW，8,000rpm離心1min，棄離心液。
(8)在DNeasy Mini Spin Colum中加入500μl緩沖液AW，1,0000rpm離心10min以干燥膜。
(9)將DNeasy Mini Spin Colum置于新的1.5ml離心管中。吸取50μl 65℃預熱的緩沖液AE，小心加入至離心柱膜上，室溫放置5min后，8,000rpm離心1min洗脫，收集洗脫液。
(10)重復洗脫一次。合并洗脫液，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.鑒別性聚合酶鏈反應(1)反應體系以25μl為參考，引物用無離子水調(diào)至10mM，采用TIANGEN公司的2×Taq Plus MasterMix進行反應，各物品的用量分別為2×Taq Plus Master Mix12.5μl引物(10mM)1μl總DNA模板 25ng加滅菌蒸餾水至總體積為25μl，混勻后，瞬時離心。
(2)聚合酶鏈反應條件反應在PCR儀上進行，94℃預變性5分鐘，然后按照下列參數(shù)進行40次循環(huán)反應變性94℃ 50秒復性52～56℃ 1分鐘延伸72℃ 1分鐘循環(huán)結束后在72℃保持8分鐘補齊，反應結束后在4℃保存。
3.反應產(chǎn)物的電泳檢測取出上述反應混和液6～8μl，與2μl加樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠(含0.5％溴化乙錠，即EB)，電壓5v/cm，電泳檢測擴增結果。
權利要求
1.一種管花肉蓯蓉鑒定引物的DNA序列，其特征在于，所設計的管花肉蓯蓉聚合酶鏈式反應的鑒定引物DNA序列為引物15’-AGT CTT GAC CCG CGA TTT-3’；引物25’-ACA ACG GAA GGC ATA GAA-3’。
2.一種管花肉蓯蓉鑒別方法，其具體方法為1)藥材DNA的提?。?)鑒別性聚合酶鏈式反應反應體系以25μl為參考，引物用無離子水調(diào)至10mM進行反應；反應條件94℃預變性5分鐘，然后按照下列參數(shù)進行40次循環(huán)反應；3)聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的檢測取上述反應混和液6～8μl，與2μl加樣緩沖液混合均勻，用2％瓊脂糖凝膠，電壓5v/cm，電泳檢測擴增結果；若有陽性擴增，則供試樣品為正品管花肉蓯蓉；若為陰性，即無擴增條帶，則供試樣品不為管花肉蓯蓉。
3.根據(jù)權利要求2所述的管花肉蓯蓉鑒別方法，其特征是，所述的聚合酶鏈反應，各試劑的用量分別為2×Taq Plus Master Mix 12.5μl，引物1μl；總DNA模板25ng，無離子水補齊到25μl，混勻后，瞬時離心。
4.根據(jù)權利要求2所述的管花肉蓯蓉鑒別方法，其特征是，所述的循環(huán)反應按下列參數(shù)進行變性94℃50秒，復性52～56℃1分鐘，延伸72℃1分鐘，循環(huán)40次，循環(huán)結束后在72℃保持8分鐘，反應結束后在4℃保存。
5.根據(jù)權利要求2所述的管花肉蓯蓉鑒別方法，其特征是，所述的2％瓊脂糖凝膠是指含0.5％溴化乙錠。
全文摘要
一種檢測中藥材的技術領域的管花肉蓯蓉鑒定引物DNA序列及管花肉蓯蓉鑒別方法。本發(fā)明所設計的管花肉蓯蓉聚合酶鏈式反應的鑒定引物DNA序列為引物15’－AGT CTT GAC CCG CGATTT－3’；引物25’－ACA ACG GAAGGC ATA GAA－3’。管花肉蓯蓉鑒別方法為藥材DNA的提取；聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的檢測；若有陽性擴增，則供試樣品為正品管花肉蓯蓉；若為陰性，即無擴增條帶，則供試樣品不為管花肉蓯蓉。本發(fā)明解決了中藥材管花肉蓯蓉真?zhèn)蔚蔫b別問題。對于從事中藥生產(chǎn)、銷售的部門快速準確地鑒定管花肉蓯蓉，控制藥材質量是十分必要的。對于各地藥檢部門打擊假冒偽劣藥材，凈化藥材市場將是十分有效的。
文檔編號C12Q1/68GK1896276SQ200610027990
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月22日 優(yōu)先權日2006年6月22日
發(fā)明者李曉波, 王敬, 屠鵬飛 申請人:上海交通大學