專利名稱：一種磁性分選材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬磁性材料領(lǐng)域，更具體地，是涉及應(yīng)用于生物樣品分離的磁性材料。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，磁性分離技術(shù)在生物樣品的分離中得到了廣泛的應(yīng)用，其原理為在磁珠(粒徑＜5μm)的表面修飾上能識(shí)別、結(jié)合細(xì)胞、亞細(xì)胞物質(zhì)、細(xì)菌、病毒、核酸或蛋白等生物樣品的生物分子，構(gòu)成磁珠-生物分子復(fù)合物。用該復(fù)合物去捕獲目的生物樣品，再在外磁場(chǎng)作用下進(jìn)行阻留從而實(shí)現(xiàn)分離。由于普通的永磁體磁場(chǎng)所產(chǎn)生的磁感應(yīng)強(qiáng)度偏低，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分離物進(jìn)行快速、高效的分選。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種磁性分選材料及其制備方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)中僅以普通的永磁體進(jìn)行磁性分選，其磁場(chǎng)所產(chǎn)生的磁感應(yīng)強(qiáng)度偏低，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分離物進(jìn)行快速、高效的分選的不足。
技術(shù)方案本發(fā)明的構(gòu)思是選擇高磁導(dǎo)率、低矯頑力、低剩磁的材料作為磁分選的材料，并通過一定的工藝將其制備成形狀規(guī)則、尺寸統(tǒng)一的小球，將小球置于外磁場(chǎng)中，在小球表面的周圍便會(huì)產(chǎn)生高度不均勻的磁場(chǎng)，即高梯度磁場(chǎng)。因此當(dāng)標(biāo)記有超順磁性、鐵磁性或亞鐵磁性顆粒的生物樣品通過小球周圍時(shí)，便會(huì)被高效地阻留。
在此發(fā)明構(gòu)思之下，本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種磁性分選材料，其組分和重量百分比含量為鐵99.0-99.8％，碳0-0.04％，余量為雜質(zhì)；且其制成品矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導(dǎo)率μmax＝4000～9000。
上述的磁性分選材料，所說(shuō)的組分和重量百分比含量?jī)?yōu)選為含鐵量99.8％、含碳量0.01％，其余0.01％的質(zhì)量為雜質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種用于磁性分選的小球，其結(jié)構(gòu)和組成為(1)權(quán)利要求1所述的磁性分選材料組成的球體，直徑為0.01～1mm；(2)生物惰性高分子材料構(gòu)成的球體表面涂敷層，厚度為0.001～500μm；其中，所說(shuō)的小球的矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導(dǎo)率μmax＝4000～9000。
上述的用于磁性分選的小球的一種優(yōu)選方案為，所說(shuō)的生物惰性高分子材料選自聚氯化對(duì)二甲苯、聚二氯對(duì)二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡膠之中的一種或一種以上。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供上述的用于磁性分選的小球的制備方法，包括如下步驟(1)提供的熔化狀態(tài)的權(quán)利要求1所說(shuō)的磁性分選材料；(2)以噴濺、離心或高空跌落的方法處理上述熔化材料；(3)利用液相的表面張力凝固成球狀微粒；(4)利用生物惰性高分子材料對(duì)小球進(jìn)行表面涂敷，使其具有生物相容性。
上述的用于磁性分選的小球的制備方法的一種優(yōu)選方案為，所說(shuō)的生物惰性高分子材料選自聚氯化對(duì)二甲苯、聚二氯對(duì)二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡膠之中的一種或一種以上。
上述的用于磁性分選的小球的制備方法的另一種優(yōu)選方案為，所說(shuō)的制備方法還包括如下步驟(1)對(duì)凝固成形的小球進(jìn)行粒徑篩選、密度篩選和圓度篩選；(2)利用退火反應(yīng)消除小球的應(yīng)力以提高磁導(dǎo)率后，再進(jìn)行表面涂覆。
上述的用于磁性分選的小球的制備方法的再一種優(yōu)選方案為，所說(shuō)的粒徑篩選的目標(biāo)微粒直徑為0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm。
上述的用于磁性分選的小球的制備方法的又一種優(yōu)選方案為，所說(shuō)的退火反應(yīng)步驟為隨爐升溫400-900℃、控速升溫700-1000℃、保溫1-5小時(shí)、控速降溫400-900℃。
本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種所說(shuō)的磁性分選材料的應(yīng)用，即以磁性分選材料制成磁性分選小球，與標(biāo)記有生物分子的磁性粒子組成磁性分選系統(tǒng)，其中，所說(shuō)的生物分子為來(lái)自于動(dòng)物、植物或微生物的細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或多糖。優(yōu)選方案為，所說(shuō)的生物分子為核酸或抗體。
有益效果(1)發(fā)明使用的小球是以高磁導(dǎo)率、低矯頑力、低剩磁的新型的磁性材料作為主要成分，小球表面涂敷了一層生物惰性材料，是一種新材料的新應(yīng)用。
(2)本發(fā)明采用特殊的制備工藝，制成的小球形狀規(guī)則、尺寸統(tǒng)一，一方面可以保證磁性分離小球結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，另一方面也可以有效地保護(hù)分離的樣品不被破壞。
(3)以粒徑較小0.01～0.1mm或0.1～0.2mm的鐵球作為分選微粒，可以產(chǎn)生梯度較大的磁場(chǎng)，適應(yīng)于分離磁響應(yīng)較弱的被磁性標(biāo)記的生物樣品。
(4)本發(fā)明在制備小球過程中的粒徑篩選、密度篩選、圓度篩選和表面涂覆都采用了特別設(shè)計(jì)的工藝過程，對(duì)小球最后的分離性質(zhì)起到了決定性的作用。
(5)經(jīng)過退火處理的小球，其晶粒細(xì)化，組織均勻、硬度低，具有低矯頑力(Hc＝30～150A/m)和較高的最大磁導(dǎo)率(μmax＝4000～9000)，符合分離的要求。
(6)置于外磁場(chǎng)中，在小球表面的周圍便會(huì)產(chǎn)生高度不均勻的磁場(chǎng)，即高梯度磁場(chǎng)。利用該高梯度磁場(chǎng)可以對(duì)標(biāo)記有超順磁性、鐵磁性或亞鐵磁性顆粒的生物樣品進(jìn)行高效地收集，其余雜質(zhì)可簡(jiǎn)單地被洗滌沖去，實(shí)現(xiàn)了特異的高效分離。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“磁導(dǎo)率”指表征磁介質(zhì)磁化能的物理量，當(dāng)一個(gè)線圈中通過一定的電流時(shí)，由于磁介質(zhì)的存在而發(fā)生變化，各處磁感應(yīng)強(qiáng)度都將較磁介質(zhì)不存在時(shí)的磁場(chǎng)強(qiáng)度增強(qiáng)幾倍或減弱到幾分之一(假定磁介質(zhì)是均勻的，而且充滿磁場(chǎng)所占的整個(gè)空間)。各種材料對(duì)磁場(chǎng)磁感應(yīng)強(qiáng)度的影響即是用磁導(dǎo)率來(lái)量度物質(zhì)中某點(diǎn)的磁感應(yīng)強(qiáng)度B與該點(diǎn)磁場(chǎng)強(qiáng)度之比(MKS單位制)為該物質(zhì)此時(shí)的磁導(dǎo)率μ。鐵磁質(zhì)磁導(dǎo)率很大，且隨外磁場(chǎng)強(qiáng)度變化。順磁質(zhì)和抗磁質(zhì)磁導(dǎo)率都很小，且不隨著外磁場(chǎng)變化。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“矯頑力”指鐵磁材料在反復(fù)磁化過程中，磁通密度B的變化始終落后于磁場(chǎng)強(qiáng)度H的變化，對(duì)應(yīng)于外磁場(chǎng)增大與減小時(shí)相同的H值，會(huì)有不同的B值，這種不可逆現(xiàn)象稱為磁滯現(xiàn)象。當(dāng)外加磁場(chǎng)強(qiáng)度H下降至零時(shí)，B值并不回到零而為稱為剩余磁感應(yīng)強(qiáng)度，簡(jiǎn)稱剩磁。為使B值回到零，必須加一個(gè)反向磁場(chǎng)強(qiáng)度Hc，Hc稱為矯頑磁場(chǎng)強(qiáng)度，俗稱矯頑力。矯頑力不僅與鐵磁質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，還依賴于鐵磁質(zhì)原先的磁化強(qiáng)度。矯頑力高低不同是軟磁材料和硬磁材料的重要區(qū)別之一，在制造變壓器鐵芯或電磁鐵時(shí)，需要選擇矯頑力較小的材料(如軟鐵，硅鋼)，制造永磁體時(shí)，需要選擇矯頑力大的材料(如鋁鎳鈷等)，以求盡可能保存磁性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如化工產(chǎn)品手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。所有無(wú)機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠。其他來(lái)源K562白血病細(xì)胞(上海細(xì)胞庫(kù))、CD34單克隆抗體(美國(guó)CALTAG公司)和磁性納米粒子(來(lái)源為上海師范大學(xué)沈鶴柏，文獻(xiàn)沈鶴柏，汪友寶，楊海峰，等。DNA在磁性納米粒子表面的鍵合及表面增強(qiáng)拉曼光譜研究。科學(xué)通報(bào)，2003，48(21)，2252～2256)，Oligo-dT購(gòu)自Promega公司。
實(shí)施例1
磁性分選小球的制備采用飛濺驟冷法制備。
取軟鐵材料三份，其組分和重量百分比含量分別為鐵99.0％+碳0.04％，鐵99.5％+碳0.001％，以及鐵99.8％+碳0.01％，余量均含極少量鋁、鈉、鋅、鉻、鎳、銅、錳等元素。使該三種材料在1500℃-1800℃高溫下熔化，熔化的軟鐵經(jīng)過3-50米/秒的速度噴濺、高空跌落或離心摔出法，利用液相的表面張力自動(dòng)收縮成球狀，跌落水中，驟冷凝固成小鐵球。
實(shí)施例2粒度篩選實(shí)施例1所制備的三種材料的小球的粒徑大部分為0.2～1mm，鐵球粒徑不同，其磁學(xué)性質(zhì)也不同。本發(fā)明采用分樣篩進(jìn)行粒度篩選挑選合適目數(shù)的分樣篩篩選目標(biāo)粒度分別為0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm的小球。粒徑較大的鐵球0.2～1mm可用于處理大量樣品，適合于分離磁響應(yīng)較強(qiáng)的被磁性標(biāo)記的生物樣品。粒徑較小0.01～0.1mm或0.1～0.2mm的鐵球可以產(chǎn)生梯度較大的磁場(chǎng)，適應(yīng)于分離磁響應(yīng)較弱的被磁性標(biāo)記的生物樣品。
密度篩選小球的主要成分是鐵。在小球制備的過程中會(huì)出現(xiàn)氧化物含量較多或含有其它雜質(zhì)的小球，需要通過密度篩選來(lái)選擇質(zhì)量合格的小球。采用密度篩選器進(jìn)行密度篩選，原理為利用小球在低阻力直線運(yùn)動(dòng)時(shí)所受一個(gè)持續(xù)恒定的與運(yùn)動(dòng)方向垂直的力，因密度有所差別，不同小球運(yùn)動(dòng)軌跡不同，通過針對(duì)一定運(yùn)動(dòng)軌跡的小球進(jìn)行剔除，從而實(shí)現(xiàn)密度篩選。
圓度篩選小球應(yīng)為形狀規(guī)則的球型，若形狀不規(guī)則，會(huì)破壞被分離的生物樣品，因此還需對(duì)小球進(jìn)行圓度篩選，剔除形狀不規(guī)則的鐵球。采用圓度篩選器進(jìn)行圓度篩選，原理為利用小球外形規(guī)整度與摩擦力之間的關(guān)系來(lái)篩選，球形規(guī)整度越高，小球與接觸面綜合摩擦力越低，待篩選的小球通過含一定高低落差的圓弧形軌道，圓度不規(guī)則的小球摩擦力大，能提供足夠向心力保證其始終在軌道內(nèi)運(yùn)動(dòng)，圓度規(guī)則的小球不能提供足夠向心力，被甩出軌道，由此篩選出圓度規(guī)則的小球。
實(shí)施例3
提高磁導(dǎo)率由驟冷產(chǎn)生的應(yīng)力，使小球的磁學(xué)性質(zhì)不能滿足分選用料的要求。需要通過合適的退火工序，來(lái)消除應(yīng)力，從而提高小鐵球的磁導(dǎo)率，降低其矯頑力。隨爐升溫至400-900℃、控制升溫至700-1000℃、保溫1-5小時(shí)，控速降溫至400-900℃，優(yōu)選隨爐升溫至800℃、控制升溫至900℃、保溫4小時(shí)，控速降溫至500℃。為了避免小球的氧化，小球的退火，在真空爐或氫氣氛圍中進(jìn)行。經(jīng)過退火處理的小球，其晶粒細(xì)化，組織均勻、硬度低，具有低矯頑力(Hc＝30～150A/m)和較高的最大磁導(dǎo)率(μmax＝4000～9000)，符合分離用料的基本要求。其中，鐵99.8％+碳0.01％，余量為雜質(zhì)的材料性能最適合于磁性分離應(yīng)用。
實(shí)施例4表面涂敷小球在潮濕空氣中容易氧化，并且易被腐蝕。因此不宜直接應(yīng)用于生物樣品的分離，需要對(duì)其表面進(jìn)行生物相容性的改性處理。本發(fā)明采用的辦法是在其表面均勻涂敷一層生物相容性的材料。選用的材料為聚氯化對(duì)二甲苯或聚二氯對(duì)二甲苯等高分子或天然高分子。
制備二甲苯聚合物的反應(yīng)可分成兩步即二聚體熱解成活性中間體對(duì)二亞甲基苯(p-xylylene)和活性中間體的氣相沉積聚合。
1、工業(yè)上二甲苯聚合物的單體是對(duì)二亞甲基苯的環(huán)狀二聚體或其取代衍生物。二聚體最直接的合成方法是用二甲苯作原料，使其與水蒸氣于常壓下熱解(950℃)然后把熱解氣體驟冷到二甲苯溶劑中，即得到二聚體；在對(duì)二亞甲基苯二聚體苯環(huán)上的氫經(jīng)氯取代即可得氯代對(duì)二亞甲基苯二聚體。
2、二甲苯聚合物的制備包含兩個(gè)過程，即二聚體的熱解(680℃)和熱解中間體的氣相沉積聚合(常溫)。二聚體氣化后進(jìn)入熱解區(qū)，其亞甲基—亞甲基鍵受熱斷裂形成二分子活性中間體(對(duì)二亞甲基苯)。該活性中間體在氣相時(shí)穩(wěn)定，但一旦在沉積室凝結(jié)就迅速聚合成高分子量固態(tài)膜。
以氯代二甲基苯聚合物涂覆物件時(shí)，被涂物件置于沉積室，并不斷旋轉(zhuǎn)以使聚合物膜在物件表面均勻分布。物件涂覆過程類似于金屬蒸鍍，擔(dān)不同的是金屬蒸鍍只能是視線式，而二甲苯聚合物則是彌散式，各個(gè)方位共性涂覆，這樣就使得任何復(fù)雜表面都可以均勻的涂覆上聚合物膜。聚合物膜厚度可以通過調(diào)節(jié)二聚體蒸發(fā)量來(lái)控制。此外，因沉積室溫度是常溫，從而可以使被涂覆物件免受熱破壞危險(xiǎn)。沉積室尺寸可根據(jù)被涂物件大小而改變。
該涂覆層完全無(wú)針孔，涂層超薄，厚度為0.001～500μm，厚度均一。涂敷層具有極低的水汽透過率(對(duì)于去離子水的溶脹為零)和耐溶劑性，可抵抗強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及各種溶劑侵蝕，對(duì)氧氣、氯氣、氮?dú)夂投趸嫉纫簿哂休^好的阻隔性，可有效抑制霉菌、細(xì)菌在表面繁殖生長(zhǎng)。
實(shí)施例5從人臍帶血樣品中分離純化出CD34+細(xì)胞(即造血干細(xì)胞)本發(fā)明采用磁性納米粒子直接與CD34單克隆抗體連接，構(gòu)成磁性納米粒子—抗體復(fù)合物，將該復(fù)合物加入到需要分離的樣品中，由于CD34+細(xì)胞表面表達(dá)CD34抗原，抗原抗體之間有特異性反應(yīng)，磁性納米粒子復(fù)合物便可以與目的細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合，再將實(shí)施例4所制備的磁性分選小球加入待分離樣品內(nèi)，常規(guī)方法外加一磁場(chǎng)，利用小球產(chǎn)生的高強(qiáng)度、高梯度磁場(chǎng)吸引磁性納米粒子-CD34抗體-CD34+細(xì)胞復(fù)合物。經(jīng)PBS緩沖液(磷酸緩沖液)多次洗滌后，未經(jīng)磁標(biāo)記的其他物質(zhì)被洗滌沖去，然后撤去外磁場(chǎng)，再用PBS緩沖液將CD34+細(xì)胞洗脫出來(lái)，免疫分析和顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示分離效果良好，從而實(shí)現(xiàn)了CD34+細(xì)胞的分離、純化。
實(shí)施例6從K562白血病細(xì)胞中提取mRNA(信使RNA)取k562并加入細(xì)胞裂解液將其裂解，然后采用磁性納米粒子與Oligo-dT(連續(xù)T堿基的寡聚核苷酸)相連接，構(gòu)成磁性納米粒子-Oligo-dT復(fù)合物，將該復(fù)合物加入已裂解的k562細(xì)胞液中，利用Oligo-dT和mRNA之間的堿基互補(bǔ)原則將mRNA磁性標(biāo)記，標(biāo)記完畢后細(xì)胞液中加入實(shí)施例4所制備的磁性分選小球，并以常規(guī)方法外加一磁場(chǎng)，被標(biāo)記的mRNA被細(xì)胞液內(nèi)的磁性分選小球的內(nèi)磁場(chǎng)高效阻留，其余物質(zhì)沖洗流出，再將阻留物清洗后撤去外磁場(chǎng)，然后依靠推塞提供的壓力用雙蒸水將納米粒子-mRNA洗脫出來(lái)。RT-PCR檢測(cè)mRNA分離效果良好，從而實(shí)現(xiàn)了mRNA的一步法提取、分離和純化。
權(quán)利要求
1.一種磁性分選材料，其組分和重量百分比含量為鐵99.0-99.8％，碳0-0.04％，余量為雜質(zhì)；且其制成品矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導(dǎo)率μmax＝4000～9000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性分選材料，其特征在于，所說(shuō)的組分和重量百分比含量為鐵99.8％、碳0.01％，余量為雜質(zhì)。
3.一種用于磁性分選的小球，其結(jié)構(gòu)和組成為(1)由權(quán)利要求1所述的磁性分選材料組成的球體，直徑為0.01～1mm；(2)生物惰性高分子材料構(gòu)成的球體表面涂敷層，厚度為0.001～500μm；其中，所說(shuō)的小球的矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導(dǎo)率μmax＝4000～9000。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于磁性分選的小球，其特征在于，所說(shuō)的生物惰性高分子材料選自聚氯化對(duì)二甲苯、聚二氯對(duì)二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡膠之中的一種或一種以上。
5.權(quán)利要求3所述的用于磁性分選的小球的制備方法，包括如下步驟(1)提供的熔化狀態(tài)的權(quán)利要求1所說(shuō)的磁性分選材料；(2)以噴濺、離心或高空跌落的方法處理上述熔化材料；(3)利用液相的表面張力凝固成球狀微粒；(4)利用生物惰性高分子材料對(duì)小球進(jìn)行表面涂敷，使其具有生物相容性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于磁性分選的小球的制備方法，其特征在于，所說(shuō)的生物惰性高分子材料選自聚氯化對(duì)二甲苯、聚二氯對(duì)二甲苯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或者硅橡膠之中的一種或一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于磁性分選的小球的制備方法，其特征在于，所說(shuō)的制備方法還包括如下步驟(1)對(duì)凝固成形的小球進(jìn)行粒徑篩選、密度篩選和圓度篩選；(2)利用退火反應(yīng)消除小球的應(yīng)力以提高磁導(dǎo)率后，再進(jìn)行表面涂覆。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于磁性分選的小球的制備方法，其特征在于，所說(shuō)的粒徑篩選的目標(biāo)微粒直徑分別為0.01～0.1mm、0.1～0.2mm和0.2～1mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于磁性分選的小球的制備方法，其特征在于，所說(shuō)的退火反應(yīng)步驟為隨爐升溫400-900℃、控速升溫700-1000℃、保溫1-5小時(shí)、控速降溫400-900℃。
10.權(quán)利要求1所說(shuō)的磁性分選材料的應(yīng)用，即以磁性分選材料制成磁性分選小球，與標(biāo)記有生物分子的磁性粒子組成磁性分選系統(tǒng)，其中，所說(shuō)的生物分子為來(lái)自于動(dòng)物、植物或微生物的細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種磁性分選材料及其制備方法和應(yīng)用。該材料其組分和重量百分比含量為鐵99.0－99.8％，碳0－0.04％，余量為雜質(zhì)；且其制成品矯頑力Hc＝30～150A/m，最大磁導(dǎo)率μmax＝4000～9000。本發(fā)明還提供將該磁性材料加工成形狀均一小球的方法，小球具有高磁導(dǎo)率、低矯頑力、低剩磁的磁學(xué)特征。本發(fā)明還涉及以磁性分選材料制成磁性分選小球，與標(biāo)記有生物分子的磁性粒子組成磁性分選系統(tǒng)的應(yīng)用，可以簡(jiǎn)單、有效、方便、快捷地分離各種細(xì)胞、亞細(xì)胞物質(zhì)、細(xì)菌、病毒、核酸或蛋白質(zhì)等生物樣品。
文檔編號(hào)C12N13/00GK1889203SQ20061002844
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者沈鶴柏, 周海清, 蘭天, 張?jiān)姕Y 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)