專利名稱：：一種培養(yǎng)鑒別致病支原體的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及支原體培養(yǎng)、鑒別及臨床檢驗(yàn)，更具體地，涉及一種培養(yǎng)鑒別致病支原體的試劑盒及其制備方法，更具體地，涉及一種解脲脲原體(U.u)、人型支原體(M.h)及肺炎支原體(M.p)培養(yǎng)鑒別的方法。
背景技術(shù)：
：支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細(xì)胞，也不同于病毒。支原體的種類繁多、分布廣泛、造成的危害相當(dāng)大。對(duì)人致病的支原體中，肺炎支原體(M.p)、解脲脲原體(U.u)和人型支原體(M.h)占絕大部分，前者是引起兒童肺炎的常見(jiàn)病原體，后兩者引起人非淋球菌性尿道炎?，F(xiàn)有技術(shù)的支原體感染的診斷方法有核酸診斷、免疫膠體金診斷、ELISA診斷等方法，但最準(zhǔn)確可靠的還是培養(yǎng)法。目前，市場(chǎng)上鑒別試劑盒都是單獨(dú)培養(yǎng)某一類支原體，給臨床使用帶來(lái)不便。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能一次培養(yǎng)鑒別解脲脲原體(U.u)、人型支原體(M.h)及肺炎支原體(M.p)診斷試劑盒。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述診斷試劑盒的制備方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的第一方面，提供了一種試劑盒配置的方法，其特征在于包括下述步驟(1)配制適合U.U生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基；(2)配制M.h鑒別試劑；(3)配制M.p鑒別試劑(4)在步驟(1)中的基本培養(yǎng)基中加入病原性支原體臨床標(biāo)本；(5)將步驟(2)中的鑒別試劑加入步驟(1)中的基本培養(yǎng)基，再加入病原性支原體臨床標(biāo)本；(6)將步驟(3)中的鑒別試劑加入步驟(1)中的基本培養(yǎng)基，再加入病原性支原體臨床標(biāo)本；(7)將步驟(4)(5)(6)中的培養(yǎng)基在37X:下培養(yǎng)后觀察結(jié)果。所述的制適合U.u生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有PPLO培養(yǎng)基、酵母粉、L-半胱氨酸、尿素、葡萄糖、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑、氨芐青霉素、酚紅和血清；所述的M.h鑒別試劑，含有大環(huán)內(nèi)脂類抗生素和精氨酸；所述的M.p鑒別試劑一種堿性溶液。在本發(fā)明的第二方面，提供了上述試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于病原性支原體臨床標(biāo)本加入基本培養(yǎng)基中，37X:下培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果；病原性支原體臨床標(biāo)本加入基本培養(yǎng)基中，加入M.h鑒別試劑，37C下培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果；病原性支原體臨床標(biāo)本加入基本培養(yǎng)基中，加入M.p鑒別試劑，37X:下培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。結(jié)果表明，本發(fā)明根據(jù)臨床上常見(jiàn)的三種致病支原體的共同特點(diǎn)，配制一種基本培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基適合解脲脲原體的直接培養(yǎng)。本發(fā)明又根據(jù)人型支原體和肺炎支原體的不同培養(yǎng)特點(diǎn)，配制人型支原體和肺炎支原體的鑒別試劑，當(dāng)在基本培養(yǎng)基中加入人型支原體或肺炎支原體的鑒別試劑后，該培養(yǎng)基只適合人型支原體或肺炎支原體的生長(zhǎng)，從而起到培養(yǎng)鑒別各類人體主要病原性支原體的作用。本發(fā)明試劑盒，僅用一個(gè)試劑盒能一次培養(yǎng)鑒別三種常見(jiàn)支原體，大大方便了臨床檢測(cè)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1提供一種能培養(yǎng)鑒別U.u、M.h及M.p的診斷試劑盒。主要分為試劑盒制備和試驗(yàn)操作兩個(gè)過(guò)程一、試劑盒的制備(一)基本培養(yǎng)基配置1、配置磺胺甲惡唑(SMZ)溶液，濃度為50100mg/ml;配置甲氧芐啶(TMP)溶液，濃度為1050mg/ml，將兩者混勻?yàn)閺?fù)方新諾明溶液(SXT),低溫保存;2、配置酚紅溶液，濃度為15%,低溫保存；3、配置添加劑溶液，其中L-半胱氨酸濃度為110mg/ml，尿素濃度為10.0~100.0rag/ml,葡萄糖濃度為2001000mg/ml，無(wú)菌過(guò)濾，低溫保存；4、配置培養(yǎng)基肉湯，其中PPL()培養(yǎng)基濃度為10100g/L,酵母粉濃度為10~100g/L,滅菌后保存；5、將l2mlSMZ、TMP溶液，45ml酚紅溶液，300800ml培養(yǎng)基肉湯及50100ml添加劑混勻，加入血清100200ml及氨芐青每素O.55g，調(diào)pH值至6.2~7.2。(二)配制Mh鑒別試劑1、稱取大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，959b的乙醇溶解，配制成濃度為10.0~50mg/ml的母液；2、稱取MgC:U、MgS04、精氨酸，用去離子水溶解，配制成稀釋液，調(diào)pH至6.27.2;3、取15ml上述母液，加入100200ml稀釋液，配制抗生素的終濃度為100500ug/ml。(三)配制M.P鑒別試劑配制0.11.0N的NaOH溶液。將瓶裝基本培養(yǎng)基、M.h鑒別試劑和M.p鑒別試劑包裝為一個(gè)試劑盒。二、試驗(yàn)操作1、取懷疑為泌尿道支原體感染的臨床標(biāo)本，接種于2瓶基本培養(yǎng)基，其中一瓶滴加M.h鑒別試劑，兩者均37'C培養(yǎng)48hr,培養(yǎng)基顏色變化者為陽(yáng)性。2、取懷疑為泌尿道支原體感染的臨床標(biāo)本，接種于1瓶基本培養(yǎng)基，滴加M.p鑒別試劑，37'C培養(yǎng)710天，培養(yǎng)基顏色變化者為陽(yáng)性。實(shí)施例2:解脲脲原體、人型支原體及肺炎支原體培養(yǎng)鑒別試劑盒本試劑盒有基本培養(yǎng)基、M.h鑒別試劑、M.p鑒別試劑組稱。1、按表l的基本培養(yǎng)基配方，通過(guò)下述步驟制備基本培養(yǎng)基，1)稱磺胺甲惡唑(SMZ)550畫(huà)mg,甲氧芐啶(TMP)110500mg,加1020mlDMSO，充分溶解，分裝，低溫保存；2)以lN的NaOH溶解船紅，加35倍體積的無(wú)菌去離子水，低溫保存；3)稱取1050gPPLO培養(yǎng)基、520g酵母粉，加入去離子水300800ml，加熱混勻，調(diào)pH至6.27.2，121tl5min滅菌處理。4)稱取0.21.0gL-半胱氨酸，3.010.0g尿素，20100g葡萄糖，溶于50~200ml去離子水中，調(diào)pH至6.27.2，加入氨芐青苒素0.55g及SMZ、TMP溶液lml,混勻，無(wú)菌過(guò)濾，加100200ml無(wú)菌去離子水；5)將步驟1.2.3、1.2.4中的溶液混合，無(wú)菌加入0.55ml酚紅溶液及100200ml馬血清，混勻，調(diào)pH值至6.27.2;6)清洗容量為520ml的玻璃瓶，高壓滅菌，將步驟1.2,5中的培養(yǎng)基無(wú)菌分裝，15ml/瓶，低溫保存。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Ph:6.27.22.按表2的配方，通過(guò)下述步驟制備M.h鑒別試劑1)稱取100500mg羅紅霉素+10.Oml95%的乙醇，配制成濃度為10.050mg/ml的母液2)稱取l5mgMgC12、l~5mgMgSO4+1050g精氨酸+100mlH20，配制成稀釋液，調(diào)pH至6.27.2;3)取lml母液+100ml稀釋液，配制終濃度20200ug/ml;4)滅菌處理容量為520ml的塑料滴瓶，將上述溶液無(wú)菌分裝，520ml/瓶，低溫保存。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>Ph:6.2~7.23、通過(guò)下述步驟制備M.p試劑1)稱取0.42gNaOH，加入100ml無(wú)菌去離子水，配置成0.10.5N的NaOH溶液；2)滅菌處理容量為520ml的塑料滴瓶，將上述溶液無(wú)菌分裝，520ml/瓶，低溫保存。4、組裝試劑盒將2040瓶基本培養(yǎng)基、12瓶M.h鑒別試劑、12瓶M.p鑒別試劑包裝為一個(gè)試劑盒。權(quán)利要求1、一種培養(yǎng)鑒別致病支原體的試劑盒，其特征在于，包括解脲脲原體基本培養(yǎng)基、人型支原體鑒別試劑和肺炎支原體鑒別試劑，2、權(quán)利要求1的培養(yǎng)鑒別致病支原體的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括下述步驟(1)配制適合解脲脲原體生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基；(2)配制人型支原體鑒別試劑；(3)配制肺炎支原體鑒別試劑；(4)將上述瓶裝基本培養(yǎng)基和鑒別試劑包裝成試劑盒。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟1的基本培養(yǎng)基含有PPLO培養(yǎng)基、酵母粉、L-半胱氨酸、尿素、葡萄糖、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑、氨芐青霉素、多年菌素、酚紅和血清。4、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于人型支原體鑒別試劑含有大環(huán)內(nèi)脂類抗生素和精氨酸。5、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于肺炎支原體鑒別試劑為堿性溶液。6、如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)鑒別致病支原體的試劑盒，其特征在于所述試劑盒培養(yǎng)鑒別致病支原體通過(guò)下述步驟(1)在步驟(1)的基本培養(yǎng)基中加入病原性支原體臨床標(biāo)本；(2)將步驟(2)的鑒別試劑中加入歩驟(1)的基本培養(yǎng)基，再加入病原性支原體臨床標(biāo)本；(3)將歩驟(3)的鑒別試劑加入步驟(1)的基本培養(yǎng)基，再加入病原性支原體臨床標(biāo)本；(4)將上述步驟的培養(yǎng)基在37X:下培養(yǎng)后觀察結(jié)果。7、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述步驟1的病原性支原體是解脲脲原體。8、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述步驟2的病原性支原體是人型支原體。9、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述歩驟2的病原性支原體是肺炎支原體。全文摘要本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種培養(yǎng)鑒別致病支原體的試劑盒及其制備方法，更具體地，涉及一種解脲脲原體、人型支原體及肺炎支原體培養(yǎng)鑒別的方法。本發(fā)明根據(jù)臨床常見(jiàn)的致病支原體的共同特點(diǎn)，配制基本培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基適合解脲脲原體直接培養(yǎng)；根據(jù)人型支原體和肺炎支原體的不同培養(yǎng)特點(diǎn)，配制人型支原體和肺炎支原體的鑒別試劑，當(dāng)在基本培養(yǎng)基中加入人型支原體或肺炎支原體的鑒別試劑后，該培養(yǎng)基只適合人型支原體或肺炎支原體的生長(zhǎng)，起到培養(yǎng)鑒別各類人體主要病原性支原體的作用。本發(fā)明進(jìn)一步制成試劑盒，明顯方便了臨床檢測(cè)。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101109746SQ20061002902公開(kāi)日2008年1月23日申請(qǐng)日期2006年7月17日優(yōu)先權(quán)日2006年7月17日發(fā)明者嚴(yán)正龍,華王,醇邵申請(qǐng)人:上海中正慧東醫(yī)療技術(shù)有限公司