專利名稱：一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑及制備方法,尤其涉及一種 利用枯草芽孢桿菌和兩種乳酸菌生產(chǎn)飼料用多肽制劑及制備方法，在飼養(yǎng)動物中 添加，可提高動物的免疫能力，促進(jìn)養(yǎng)殖動物消化吸收功能，提高動物應(yīng)激性， 屬于農(nóng)業(yè)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是動物體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)物質(zhì)，目前我們飼料中的蛋白有大 豆蛋白和動物蛋白兩種，主要是通過動物消化道消化液作用后在小腸壁上以氨基 酸形式被動物體利用?，F(xiàn)代生物代謝實(shí)驗(yàn)證明，腸道吸收短肽、多肽的速度比同 一組成的游離氨基酸快，大豆多肽具有溶解性好、低黏度、抗凝膠形成等物理特 性，尤其重要的是，大豆多肽具有免疫調(diào)節(jié)、恢復(fù)疲勞、增強(qiáng)肌肉力量、降血壓、 降血脂、降膽固醇等特殊的生理活動功能。作為一種新型的功能因子，大豆多肽 在營養(yǎng)療效食品、功能食品、動物營養(yǎng)、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值， 在動物營養(yǎng)方面，多肽、短肽已成為動物營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
目前，我國的大豆蛋白生產(chǎn)主要以酶解法制備為主，酶解生產(chǎn)具有成本低、 純度高的特點(diǎn)，但這在飼料行業(yè)中并不適用，因?yàn)槠淇刂茥l件要求高，設(shè)備投入 大，同時(shí)，下游技術(shù)中提純步驟多，延長了生產(chǎn)周期和生產(chǎn)成本。而動物蛋白營 養(yǎng)需求并不專一，其純度要求并不高。'
類似的一項(xiàng)國內(nèi)多肽飼料添加劑專利，其專利號為97106988.3，題為"中 草藥復(fù)合多肽飼料添加劑及其制作方法"，其制作方法為動物骨頭—分選—蒸煮 —混合液—備用貯槽—混合液分離—多肽溶液—復(fù)合—過濾—干燥—產(chǎn)品。該添 加劑利于畜禽的消化吸收，可防病治病，改善畜禽產(chǎn)品的品質(zhì)。其生產(chǎn)過程僅利 用物理的方法提取動物原料中的多肽，有一定的安全隱患，同時(shí)采用藥物原料為 組分，其應(yīng)用范圍不廣。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提供一種生產(chǎn)成本低、周期快，養(yǎng)殖后動物吸收快、日增重提 高，免疫力增強(qiáng)，應(yīng)激性提高，養(yǎng)殖效果作用明顯的微生物發(fā)酵制作飼料用多肽 制劑及制備方法。
為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽
制劑，其特征在于，由以下重量百分比原料組成枯草芽孢桿菌40—55、植物 乳桿菌25—35、干酪乳桿菌10—35。
一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑的制備方法，其特征在于，生產(chǎn)菌種通
過微波誘導(dǎo)和射線誘導(dǎo)相結(jié)合，篩選產(chǎn)量高、產(chǎn)酶量大的生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)工藝采 用液體單獨(dú)培養(yǎng)和固體復(fù)合培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)基中添加產(chǎn)物促進(jìn)劑,其生產(chǎn)工藝為
第一步發(fā)酵菌株選育
a. 菌株傳代采用農(nóng)業(yè)部菌種保存中心提供的枯草芽孢桿菌菌株和植物乳
桿菌、干酪乳桿菌，通過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，選育生長速度快、
菌落特征明顯的菌種，在o'c—4t:溫度下保存菌種；
b. 菌種的復(fù)合誘導(dǎo)將保存的枯草芽孢桿菌用0.9%的生理鹽水稀釋至10 一s—10—'，在微波爐中用低火處理菌懸液30S—50S，利用血球計(jì)數(shù)法計(jì) 數(shù)，將處理后的菌懸液在淀粉培養(yǎng)基的平板上涂布，在30—401C溫度下 倒置培養(yǎng)48小時(shí)，選育出培養(yǎng)基中透明圈直徑與菌落直徑的比值大于 0.8的菌落，接種至營養(yǎng)瓊脂試管中保存；
將干酪乳桿菌、植物乳桿菌和微波處理后的枯草芽孢桿菌分別稀釋 至10—5—10—7,干酪乳桿菌、植物乳桿菌的懸浮液在40—50X:溫度下水 浴5min，在30cm處用功率為.15—20W、波長為260nm的紫外燈處理10 —30分鐘，處理后的菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板中在30—40'C溫度下倒置 培養(yǎng)48小時(shí)，選出生長速度快的菌落進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，觀察菌種生長速 度；
C、生產(chǎn)菌種的制作將篩選出的枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌 分別轉(zhuǎn)接入裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，在35—40X:溫度下培養(yǎng) 45—50小時(shí)，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時(shí)即可取出，然后放 入2—6"C的冰箱中保存；
第二步有益菌株的液體培養(yǎng)
a. 按以下重量百分比稱取各菌種枯草芽孢桿菌40—55、植物乳桿菌25— 35、干酪乳桿菌10—35;
b. 乳酸菌的液體培養(yǎng)將稱取的植物乳桿菌和干酪乳桿菌混合在一起進(jìn)行復(fù)
合培養(yǎng)將植物乳桿菌和干酪乳桿菌的混合菌苔按l: 25 — 30的比例接種 于120—130'C、 30—45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵fiH^攪拌 30min,其轉(zhuǎn)速為220—240r/min，攪拌均勻后放入消毒后塑料桶中靜置5 一7天，靜置過程中每天測定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；發(fā)酵過程中抽樣 3次，顯微鏡下檢測菌體生長情況和測定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml 濃度和Ph值達(dá)到3. 0-4. 0時(shí)停止發(fā)酵；
c. 枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)將稱去的枯草芽孢桿菌按l: 25—30的比例接 種于120—130'C、 30—45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加 0.1%-0.2%的吐溫(Tween)作產(chǎn)物促進(jìn)劑，發(fā)酵時(shí)通氣量維持在1: 1， 發(fā)酵時(shí)間24—35小時(shí)；
第三步菌種的固體擴(kuò)大培養(yǎng)
a. 將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合后按1: 25—30的比例接入120—13(TC、 30—45min高溫滅菌的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加0.05% — 0. 2%的植酸質(zhì)作產(chǎn)物促進(jìn)劑，攪拌30—45min至均勻，倒入消毒雙層飼 料袋中密封發(fā)酵，溫度30—35'C,時(shí)間8-10天；
b、 發(fā)酵過程中取樣三次，測定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測定水分為 35-40% 、 Ph值為4.5—6.0;.
第四步粉碎添加載體
a. 干燥:將步驟3發(fā)酵完全的產(chǎn)品按時(shí)間先后放入培養(yǎng)箱干燥，溫度控制 在40—45iC,時(shí)間14—16小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在《12%;
b. 添加載體將干燥后的產(chǎn)品按1: 0.02-0.03的比例添加載體，倒入攪 拌機(jī)中攪拌均勻，然后轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，物料溫度控制在45'C以 下，粉碎后的物料過50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新粉碎；
c. 過篩后裝入帶有內(nèi)袋的桶或袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識牌，轉(zhuǎn)入成品庫
有序堆放；取樣檢測，主要參數(shù)水份《12%、活菌數(shù)20—30億/g、總蛋白量
>68%;物理性狀深黃色粉末狀固體。
所述的步驟2液體培養(yǎng)基為無菌水再加豆粕粉、大豆粉、硫酸銨、玉米淀粉、 糖蜜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、無菌水的至少三種混合物，其重量百 分比為豆粕粉2—6、大豆粉l一3、硫酸銨0—0.8、玉米淀粉1—8、糖蜜8—20、 磷酸二氫鉀0—1、磷酸二氫鈉0—2、硫酸鎂0—1、無菌水60—87。
所述的步驟3的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基為無菌水、植酸質(zhì)、再加豆粕粉、大豆粉、 糖蜜、玉米粉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、尿素中的至少四種混合物組 成，其重量百分比為豆粕20—25、大豆粉25—30、糖蜜8—12、玉米粉8—10、、 磷酸二氫鉀0. 5—1、磷酸二氫鈉1—2、硫酸鎂0. 4—1、尿素l一2、無菌水16. 7 —36。
所述的載體由沸石粉、碳酸鈣組成，其重量百分比為沸石粉40—50、碳酸 鈣50—60。
本發(fā)明提供的微生物發(fā)酵生產(chǎn)大豆蛋白，可利用目前飼料行業(yè)中主要的蛋白 來源大豆及豆粕，在一般的發(fā)酵設(shè)備中生產(chǎn)，在產(chǎn)生大豆多肽功能因子的同時(shí), 保留發(fā)酵過程中多種代謝酶、維生素、抗氧化肽聚糖等發(fā)酵產(chǎn)物，通過在飼養(yǎng)動 物的飼料中添加，可顯著提高養(yǎng)殖動物免疫能力和消化吸收能力，提高養(yǎng)殖動物 的應(yīng)激性，同時(shí)有很好的適口性，能同時(shí)提高動物的日采食量。
利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆在日本有較早的應(yīng)用，在日本風(fēng)靡一時(shí)的營養(yǎng)保
健食品——納豆，就是利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵而來，不過由于菌種未經(jīng)過專門的 誘導(dǎo)，其酶解效果差，對大豆蛋白利用較低。本發(fā)明利用微波照射技術(shù)誘導(dǎo)枯草 芽孢桿菌，它的特點(diǎn)是設(shè)備要求簡單、無需專門的操作空間，同時(shí)結(jié)合紫外線誘 導(dǎo)，能使得到高產(chǎn)酶能力的優(yōu)秀菌株的得率大大提高，與化學(xué)誘導(dǎo)、營養(yǎng)缺陷型 選育相比，微波及射線誘導(dǎo)具有設(shè)備簡單、操作方便、誘變周期短的特點(diǎn)，可以 在有限的時(shí)間內(nèi)選育更多的優(yōu)秀菌株。
乳酸菌對飼料原料發(fā)酵的效果早己被詞料界所接受，但其熱敏感度高，如何 在飼料制粒中防治失活是一個(gè)難題，本發(fā)明基本解決了這一難題,其主要做法是, 在菌株選育中進(jìn)行耐高溫實(shí)驗(yàn)， 一般乳酸菌最適的生長代謝溫度是30—37'C,
在45'C左右代謝水平大大降低，而在育種時(shí)就進(jìn)行水浴加熱可改變其耐熱突變 菌株產(chǎn)生的幾率，本發(fā)明中就是利用多次水浴加熱，篩選耐髙溫的乳酸菌種，可 有效改變在飼料制粒中菌種失活的現(xiàn)象。同時(shí)由于本發(fā)明產(chǎn)品主要利用的是營養(yǎng) 多肽及各種發(fā)酵代謝產(chǎn)物，所以對活菌數(shù)量要求不高，所以飼料制粒時(shí)的短暫高 溫對其效果影響不大。
在本發(fā)明產(chǎn)品的發(fā)酵過程中，采用了添加產(chǎn)物促進(jìn)劑的辦法，本產(chǎn)品中的營 養(yǎng)多肽主要由產(chǎn)品菌種產(chǎn)生大量的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶 分解培養(yǎng)基而來，所以，加入產(chǎn)物促進(jìn)劑是提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一個(gè)有效方法，我們 在10多種產(chǎn)酶促進(jìn)劑中進(jìn)行了篩選，分別確定了一種液體培養(yǎng)基、 一種固體培 養(yǎng)基的產(chǎn)物促進(jìn)劑，與未添加者相比，其產(chǎn)物中酶活分別增加15倍和4倍。
由于枯草桿菌是產(chǎn)芽孢菌，后期發(fā)酵液體呈堿性，而兩種乳酸菌是典型的酸 性培養(yǎng)細(xì)菌，所以直接復(fù)合培養(yǎng)有很大的難度，所以本發(fā)明產(chǎn)品釆用了液體單獨(dú) 培養(yǎng)，再進(jìn)行固體馴化復(fù)合培養(yǎng)的辦法，既保證了菌種活菌數(shù)量，又將代謝產(chǎn)物 的保留最大化，保證了產(chǎn)品的應(yīng)用效果。同時(shí)在最終產(chǎn)品中添加載體，保證了菌 種在運(yùn)輸和保存過程中存活時(shí)間。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1. 菌種選育過程中采用獨(dú)創(chuàng)的微波誘導(dǎo)和紫外誘導(dǎo)相結(jié)合的技術(shù)，操作設(shè)備簡 單，誘導(dǎo)周期短，場地要求低。同時(shí)在乳酸菌菌種選育中采用高溫水浴，保 證菌種在詞料制粒中能大量存活；
2. 采用液體單獨(dú)髙速培養(yǎng)和固體擴(kuò)大結(jié)合的發(fā)酵技術(shù)，在保證菌種高速生長的 同時(shí)，進(jìn)行固體馴化培養(yǎng)，既保證.了有益菌種的高速生長，又保證了其代謝 產(chǎn)物完全保留；
3. 在液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)中添加產(chǎn)物促進(jìn)劑，大大提高發(fā)酵過程中酶活和產(chǎn)物 的數(shù)量；
4. 產(chǎn)品中的高濃度乳酸能顯著提高水產(chǎn)動物的消化吸收功能，同時(shí)產(chǎn)生的肽聚 糖增加了水產(chǎn)動物對病原體的免疫能力；
5. 枯草芽孢桿菌和乳酸菌發(fā)酵營養(yǎng)豐富的固體培養(yǎng)基，在產(chǎn)生多肽的同時(shí)，產(chǎn) 生大量的纖維素酶、半纖維素酶、低聚肽、短肽混合物、抗生素、微量元素
及其它代謝產(chǎn)物，為養(yǎng)殖動物提供最佳的營養(yǎng)生長條件；
6. 采用糧食作物和常用飼料載體作為主要培養(yǎng)基原料，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí) 使用常用的發(fā)酵及生產(chǎn)設(shè)備，易于在動物養(yǎng)殖中推廣；
7. 本發(fā)明的產(chǎn)品采用農(nóng)業(yè)部658公告允許添加的微生物菌種，在養(yǎng)殖動物體內(nèi) 無有害殘留，同時(shí)減少了抗生素在養(yǎng)殖中的使用量，是一種安全、綠色的微 生物產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例l 第一步發(fā)酵菌株選育
a. 菌株傳代采用農(nóng)業(yè)部菌種保存中心提供的枯草芽孢桿菌菌株和植物乳 桿菌、干酪乳桿菌，通過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中作畫線 分離，選育生長速度快、菌落特征明顯的菌種，在4'C溫度下保存菌種；
b. 菌種的復(fù)合誘導(dǎo)將步驟a保存的枯草芽孢桿菌用0.9X的生理鹽水稀 釋至It)—5,在微波爐中用低火處理菌懸液30S，利用血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)， 比較處理前后的活菌數(shù)量，將存活率較高的處理后的菌懸液在淀粉培養(yǎng) 基的平板上涂布，在35'C溫度下倒置培養(yǎng)48小時(shí)，選育出培養(yǎng)基中透 明圈直徑與菌落直徑比值大于O. 8的菌落,接種至營養(yǎng)瓊脂試管中保存， 將保存的菌種制作菌懸液，稀釋至10—7，在30cm處用功率為15W的紫 外燈(波長為260nm)處理15s，處理后的菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板中35 'C倒置培養(yǎng)48h,選出生長速度快的菌落進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，觀察菌種生長 速度；
將步驟a中保存的千酪乳桿菌、植物乳桿菌制作菌懸液(其中枯草 芽孢桿菌制作孢子懸浮液)，稀釋至10—6，用試管將干酪乳桿菌、植物 乳桿菌的懸浮液在45X:中水浴5niin,在30cm處用功率為15W的紫外燈 (波長為260nm)處理10—30s,處理后的菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板中在 35'C溫度下倒置培養(yǎng)48h,選出生長速度快的菌落進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，觀察 菌種生長速度；
C、生產(chǎn)菌種的制作將篩選出的枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌 轉(zhuǎn)接入裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，將釀酒酵母菌轉(zhuǎn)接入酵母裔麥
芽汁瓊脂作培養(yǎng)基的茄子瓶中，在35'C溫度下培養(yǎng)45小時(shí)，待茄子瓶 表面菌苔布滿，并白中帶黃時(shí)即可取出，然后放入2—6'C的冰箱中進(jìn)行 保存；
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉裔3g、蛋白胨10g、 NaC15g、瓊脂15—20g、水 1000ml、 pH7.0-7.2。 121'C滅菌20min; 淀粉培養(yǎng)基蛋白胨10、 NaC15g、牛肉膏5 g、可溶性淀粉2 g、蒸餾 水、瓊脂15—20克。121'C滅菌20min; 第二步有益菌株的液體培養(yǎng)
a.按以下重量百分比例稱取各菌種枯草芽孢桿菌40、植物乳桿菌25、干 酪乳桿菌35。
b. 乳酸菌的液體培養(yǎng)將稱取的植物乳桿菌和干酪乳桿菌按步驟a中比例 混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng):將混合菌苔按1:25的比例接種于121'C、30min 高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基重量百分比為豆粕粉3、大豆粉 1、硫酸銨0. 3、玉米淀粉2、糖蜜10、磷酸二氫鉀0. 2、磷酸二氫鈉0. 3、 磷酸鎂0.2、無菌水83,接種后液體在發(fā)酵罐中攪拌30min,其轉(zhuǎn)速為 220r/min,攪拌均勻后放入消毒后塑料桶中靜置5—7天，靜置過程中每 天測定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；發(fā)酵過程中抽樣3次，顯微鏡下檢測菌 體生長情況和測定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml濃度和Ph值達(dá)到 3. 0-4. 0時(shí)停止發(fā)酵；
c、 枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)將稱去的枯草芽孢桿菌按l: 25的比例接種 于121'C、 30min髙溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基重量百分比為豆粕 粉2、大豆粉1. 5、硫酸銨0. 5、玉米淀粉3、糖蜜10、磷酸二氫鉀0. 2、 磷酸二氫鈉0.3、磷酸鎂0.1、無菌水82.4,在發(fā)酵中加入0.1%的吐溫
(TVeen)為促進(jìn)產(chǎn)酶的產(chǎn)物促進(jìn)劑，發(fā)酵時(shí)通氣量維持在1: 1,發(fā)酵 時(shí)間28小時(shí)，待Ph值上升到7.5時(shí)停止發(fā)酵。 第三步菌種的固體擴(kuò)大培養(yǎng)
a、 將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合按1: 25的比例接入121'C、 30min髙溫滅 菌的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，固體擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比為豆粕20、大豆 粉25、糖蜜8、玉米粉8、磷酸二氫鉀0.5、磷酸二氫鈉l、硫酸鎂0.4、 尿素l、無菌水36,同時(shí)加入植酸質(zhì)0.05%為產(chǎn)物促進(jìn)劑，攪拌35min至 均勻，倒入50—70kg消毒雙層飼料袋中密封發(fā)酵，溫度30—35'C，時(shí)間 8天；
b、 發(fā)酵過程中取樣三次，測定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測定水分為 35-40% 、 Ph值為4. 5—6.0;
第四步粉碎添加載體
a. 干燥:將步驟4發(fā)酵完全的產(chǎn)品按時(shí)間先后放入培養(yǎng)箱干燥，溫度控制 在40'C，時(shí)間15小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在《12%;
b. 添加載體將干燥后的產(chǎn)品按1: 0.02的比例添加載體，其中沸石粉 40%、碳酸鈣60%，倒入攪拌機(jī)中攪拌均勻，然后轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎, 物料溫度控制在45'C以下，粉碎后的物料過50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新 粉碎；
c、 篩后裝入帶有內(nèi)袋的桶或袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識牌，轉(zhuǎn)入成品庫有 序堆放；取樣檢測，主要參數(shù)水份《12%、活菌數(shù)20—30億/g、總蛋 白量》68%;物理性狀深黃色粉末狀固體。
實(shí)施例2
第一步發(fā)酵菌株選育
a. 菌株傳代同實(shí)施例l。
b. 菌種的復(fù)合誘導(dǎo)將保存的枯草芽孢桿菌用0.9%的生理鹽水稀釋至10 一7，在微波爐中用低火處理菌懸液45S,利用血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，將處理 后的菌懸液在淀粉培養(yǎng)基的平板上涂布，在37t:溫度下倒置培養(yǎng)48h, 選育出培養(yǎng)基中透明圏直徑與菌落直徑的比值(HC值)比較大的菌落， 接種至營養(yǎng)瓊脂試管中保存。將保存的菌種稀釋至10—7。在30cm處用 功率為20W的紫外燈(波長為260nm)處理25s,處理后的菌懸液在營 養(yǎng)瓊脂平板中在35"C溫度下倒置培養(yǎng)48h，選出生長速度快的菌落進(jìn)行
搖瓶實(shí)驗(yàn)，觀察菌種生長速度。
將保存的干酪乳桿菌、植物乳桿菌株制作菌懸液，稀釋至10—7，在
50'C溫度下中水浴5min，在30cm處用功率為20W的紫外燈(波長為 260nm)處理25s,處理后的菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板中在35'C溫度下倒 置培養(yǎng)48h，選出生長速度快的菌落進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，觀察菌種生長速度。 C、同實(shí)施例l。 第二步有益菌株的液體培養(yǎng)
a.按以下重量百分比稱取各菌種枯草芽孢桿菌55、植物乳桿菌32、干酪 乳桿菌13;
b.乳酸菌的液體培養(yǎng)按步驟a中比例將稱取的植物乳桿菌和干酪乳桿菌 混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)按l: 30的比例接種于123'C、 45min高溫滅 菌的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基重量百分比為豆粕粉6、大豆粉3、硫 酸銨0.8、玉米淀粉5、糖蜜15、磷酸二氫鉀1、磷酸二氫鈉1.8、硫酸 鎂1、無菌水66.4。其余同實(shí)例l;
C.枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)將稱去的枯草芽孢桿菌按1: 30的比例接種
于123'C、 45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基重量百分比為 豆粕粉6、大豆粉3、硫酸銨0. 7、玉米淀粉5、糖蜜14、磷酸二氫鉀0.8、 磷酸二氫鈉2、硫酸鎂1、無菌水67.5，發(fā)酵中加入吐溫0.2%為產(chǎn)物 促進(jìn)劑，其余同實(shí)施例l; 第三步菌種的固體擴(kuò)大培養(yǎng)
a、 步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合按1: 30的比例接入123'C、 45min高溫滅 菌的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，固體擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比為:豆粕25、大豆 粉30、糖蜜12、玉米粉10、、磷酸二氫鉀1、磷酸二氫鈉2、硫酸鎂0.8、 尿素2、無菌水17.2,在培養(yǎng)基中添加植酸質(zhì)0.2%為產(chǎn)物促進(jìn)劑，其 余同實(shí)施例l;
b、 同實(shí)施例l; 第四步粉碎添加載體
a .同實(shí)施例1
b. 添加載體將干燥后的產(chǎn)品按l: 0.03的比例添加載體，其中沸石粉 40%、碳酸鈣60%。，其余同實(shí)施例l;
c. 同實(shí)施例l: 其余同實(shí)施例1 一樣；
使用時(shí)按1-1.5%。比例添加到養(yǎng)殖動物飼料攪拌均勻后投喂，在動物發(fā)病期 間應(yīng)加大使用量，按2-3%。比例添加使用至發(fā)病癥狀消失為止，本產(chǎn)品需在干燥
通風(fēng)處密閉封存，開封后應(yīng)盡快使用。本發(fā)明產(chǎn)品已在上海市閔行區(qū)技術(shù)質(zhì)量監(jiān)
督局備案并生產(chǎn)銷售。在上海市科委領(lǐng)導(dǎo)的關(guān)心和支持下，于2002年開始在上 海市南匯區(qū)進(jìn)行青蟲下的立體衛(wèi)生養(yǎng)殖研究，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，試驗(yàn)塘各塘的 平均畝產(chǎn)量為147斤，而對照塘的平均產(chǎn)量僅為70斤，試驗(yàn)塘的產(chǎn)量提高了 110%,差異相當(dāng)明顯，佴料系數(shù)平均降低了 17.1%。養(yǎng)殖周期中對照塘平均病害 1.8次，而試驗(yàn)塘平均病害0. 5次。且各試驗(yàn)塘青蝦的個(gè)體比較大，體表光滑、 體色較青、賣價(jià)較高，而對照塘各塘青蝦體表毛糙、淤積物較多，體色較白，出 售價(jià)較低。
權(quán)利要求
1. 一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑，其特征在于，由以下重鼉百分比原料組成枯草芽孢桿菌40—55、植物乳桿菌25—35、干酪乳桿菌10—35。
2. —種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑的制備方法，其特征在于，生產(chǎn)菌種通 過微波誘導(dǎo)和射線誘導(dǎo)相結(jié)合，篩選產(chǎn)量高、產(chǎn)酶量大的生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)工藝 采用液體單獨(dú)培養(yǎng)和固體復(fù)合培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)基中添加產(chǎn)物促進(jìn)劑，其生產(chǎn)工藝為第一步發(fā)酵菌株選育a. 菌株傳代采用農(nóng)業(yè)部菌種保存中心提供的枯草芽孢桿菌菌株和植物乳桿菌、干酪乳桿菌，通過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，選育生長速度快、菌落特征明顯的菌種，在O'C—4'C溫度下保存菌種；b. 菌種的復(fù)合誘導(dǎo)將保存的枯草芽孢桿菌用0.9%的生理鹽水稀釋至10 一5—10—7,在微波爐中用低火處理菌懸液30S—50S,利用血球計(jì)數(shù)法計(jì) 數(shù)，將處理后的菌懸液在淀粉培養(yǎng)基的平板上涂布，在30—40C溫度下 倒置培養(yǎng)48小時(shí)，選育出培養(yǎng)基中透明圈直徑與菌落直徑的比值大于 0.8的菌落，接種至營養(yǎng)瓊脂試管中保存；將干酪乳桿菌、植物乳桿菌和微波處理后的枯草芽孢桿菌分別稀釋 至10—5—10—7，干酪乳桿菌、植物乳桿菌的懸浮液在40—50'C溫度下水 浴5邁in,在30cm處用功率為15—20W、波長為260nm的紫外燈處理10 一30分鐘，處理后的菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板中在30—40'C溫度下倒置 培養(yǎng)48小時(shí)，選出生長速度快的菌落進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，觀察菌種生長速 度；C、生產(chǎn)菌種的制作將篩選出的枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌 分別轉(zhuǎn)接入裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，在35—40'C溫度下培養(yǎng) 45—50小時(shí)，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時(shí)即可取出，然后放 入2—6X:的冰箱中保存； 第二步有益菌株的液體培養(yǎng) a. 按以下重量百分比稱取各菌種枯草芽孢桿菌40—55、植物乳桿菌25 — 35、千酪乳桿菌10—35;b. 乳酸菌的液體培養(yǎng)將稱取的植物乳桿菌和干酪乳桿菌混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)將植物乳桿菌和干酪乳桿菌的混合菌苔按l: 25—30的比例接種 于120—130'C、 30—45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中攪拌 30min,其轉(zhuǎn)速為220—240r/min，攪拌均勻后放入消毒后塑料桶中靜置5 一7天，靜置過程中每天測定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；發(fā)酵過程中抽樣 3次，顯微鏡下檢測菌體生長情況和測定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ral 濃度和Ph值達(dá)到3. 0-4. 0時(shí)停止發(fā)酵；c. 枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)將稱去的枯草芽孢桿菌按l: 25—30的比例接 種于120—130'C、 30—45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加 0.1%-0.2%的吐溫作產(chǎn)物促進(jìn)劑，發(fā)酵時(shí)通氣量維持在l: 1，發(fā)酵時(shí)間24 一35小時(shí)；第三步菌種的固體擴(kuò)大培養(yǎng)a. 將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合后按1: 25—30的比例接入120—130'C、 30—45min高溫滅菌的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加0.05%—0.2% 的植酸質(zhì)作產(chǎn)物促進(jìn)劑，攪拌30—45min至均勻，倒入消毒雙層飼料袋中 密封發(fā)酵，溫度30—35°C,時(shí)間8—IO天；b、 發(fā)酵過程中取樣三次，測定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測定水分為 35-40% 、 Ph值為4.5—6.0;第四步粉碎添加載體a. 干燥:將步驟3發(fā)酵完全的產(chǎn)品按時(shí)間先后放入培養(yǎng)箱干燥，溫度控制 在40—45'C，時(shí)間14一16小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在《12%;b. 添加載體將干燥后的產(chǎn)品按1: 0. 02-0. 03的比例添加載體，倒入攪 拌機(jī)中攪拌均勻，然后轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，物料溫度控制在45C以 下，粉碎后的物料過50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新粉碎；c. 過篩后裝入帶有內(nèi)袋的桶或袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識牌，轉(zhuǎn)入成品庫 有序堆放；取樣檢測，主要參數(shù)水份《12%、活菌數(shù)20—30億/g、總 蛋白量》68%;物理性狀深黃色粉末狀固體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑的制備方法，其 特征在于，所述的步驟2液體培養(yǎng)基為無菌水再加豆粕粉、大豆粉、硫酸銨、玉米淀粉、糖蜜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、無菌水的至少三種混合物，其重量百分比為豆粕粉2-6、大豆粉1一3、硫酸銨0—0.8、玉米淀 粉1一8、糖蜜8—20、磷酸二氫鉀0—1、磷酸二氫鈉0—2、硫酸鎂0—1、 無菌水60—87。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑的制備方法，其 特征在于，所述的步驟3的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基為無菌水再加豆粕粉、大豆粉、 糖蜜、玉米粉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、尿素中的至少四種混合 物組成，其重量百分比為豆粕20—25、大豆粉25—30、糖蜜8—12、玉米 粉8—10、、磷酸二氫鉀0.5—1、磷酸二氫鈉1一2、硫酸鎂0.4—1、尿素l —2、無菌水16.7—36。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑的制備方法，其 特征在于，所述的載體由沸石粉、碳酸鈣組成，其重量百分比為沸石粉40 —50、碳酸鈣50—60。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用枯草芽孢桿菌和乳酸菌生產(chǎn)微生物多肽制劑的制備方法，其特征在于，生產(chǎn)菌種通過獨(dú)創(chuàng)的微波誘導(dǎo)和射線誘導(dǎo)相結(jié)合，篩選產(chǎn)量高、產(chǎn)酶量大的生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)工藝采用液體單獨(dú)培養(yǎng)和固體復(fù)合培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)基中添加特殊產(chǎn)物促進(jìn)劑，生產(chǎn)大豆多肽含量高，同時(shí)富含肽聚糖、微生物抗氧化物、代謝酶等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)品，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)成本低、周期快，養(yǎng)殖后動物吸收快、日增重提高，免疫力增強(qiáng)，應(yīng)激性提高，養(yǎng)殖效果作用明顯。是一種安全、高效的新型飼料添加劑。
文檔編號A23J3/00GK101120724SQ200610029870
公開日2008年2月13日 申請日期2006年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者瀚 江 申請人:上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司