專利名稱：用抑肽酶為配基的親和層析純化糜蛋白酶的方法
用抑肽酶為配基的親和層析純化糜蛋白酶的方法技術(shù)領(lǐng)域-本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種糜蛋白酶制備中的親和層析方法。
背景技術(shù)：
糜蛋白酶能切斷蛋白質(zhì)肽鏈中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽鏈，因而能清創(chuàng)消膿， 消化膿汁和壞死組織，助長(zhǎng)新生肉芽的生長(zhǎng)。正常組織中分泌的血清含有蛋白酶抑 制物，能保護(hù)組織不受分解。常用于治療各種炎癥、潰瘍等。糜蛋白酶是來(lái)源于牛胰經(jīng)提取的一種蛋白水解酶，在動(dòng)物胰臟中含有多種蛋白 水解酶，以胰蛋白酵為主，其化學(xué)性質(zhì)相近分離難度較大。糜蛋白酶提純工藝以結(jié) 晶、活化為主，活化中又添加胰蛋白酶作為活化劑，在活化后又沒(méi)有分離工藝，所 以中國(guó)藥典規(guī)定糜蛋白酶800iu/mg以上、胰蛋白瞎含量每毫克糜蛋白酶不大于 25iu/mg。在糜蛋白酶成品中如果含有其他蛋白水解酶將影響其穩(wěn)定性，由于分離難 度較大將作為雜質(zhì)保留在糜蛋白酶成品中可增加用藥的不良反應(yīng)。因而，除去該雜 質(zhì)是研究人員所需關(guān)注的問(wèn)題。已有的牛胰提取的糜蛋白酶工藝流程為；絞碎 分級(jí) pH5 加胰蛋白酶牛胰一提取一一鹽析一一結(jié)晶(5次) 一一活化一凍干一成品 IO'C pH3 25°C 5'C但該方法存在一定的缺陷，因其含有少量的胰蛋白酶雜質(zhì)，會(huì)增加用藥的不良反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)純化糜蛋白酶的方法。本發(fā)明提供了一種純化糜蛋白酶的新方法，該法利用抑肽酶與胰蛋白酶、糜蛋白酶
和其他蛋白水解酶親和性的差異，使抑肽酶與水不溶性載體(S印harose CL-4B)的結(jié) 合，其結(jié)構(gòu)為S印harose-0-HN-C-HN-(CH2)5-CO-HN-抑肽酶。將糜蛋白酶與胰蛋白酶、其他蛋白水解酶分離，制得高純度產(chǎn)品。本發(fā)明提供了一種糜蛋白酶制備的親和層析方法。本發(fā)明牛胰提取的糜蛋白酶工藝流程為；絞碎 分級(jí) PH5 加胰蛋白酶過(guò)濾PH5-7牛胰一提取一鹽析一一結(jié)晶(5次)一^^活化一一親和層析一 10°C PH3 25'C 5°C 1-10°C--成品由于糜蛋白酶生產(chǎn)純化需要大量的牛胰，所以其純化的前段工藝(牛胰一提取一鹽析一一次結(jié)晶)在原產(chǎn)地加工，提供的粗品叫糜原(糜蛋白酶原結(jié)晶)。工廠生產(chǎn)糜蛋白酶多以此為原料糜蛋白酶原是通過(guò)市售購(gòu)買的。本發(fā)明人在驗(yàn)證親 和層析效果時(shí)，采用同一批號(hào)糜蛋白酶原操作至活化工藝后，再均分為兩部分進(jìn)行數(shù)據(jù) 對(duì)比。親和層析應(yīng)用的效果主要和pH有關(guān)，觀察不同pH條件的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)情況，然后制 定本發(fā)明方法。本發(fā)明的用抑肽酶為配基的親和層析純化糜蛋白酶的方法，包括下列步驟1、 糜蛋白酶原活化液制備糜蛋白酶原水溶液配制成硫酸銨飽和溶液，調(diào)節(jié)pH5.0，結(jié)晶，然后再重復(fù)結(jié)晶 得糜蛋白酶原結(jié)晶，加入硫酸溶液，磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH7.6，加入胰蛋白酶，5'C 冷卻活化后制得糜蛋白酶原活化液；2、 糜蛋白酶原活化液純化上述糜蛋白酶原活化液過(guò)濾，濾液調(diào)節(jié)pH5.0，進(jìn)入親和層析柱上樣，操作溫度 控制在0-10'C之間，上樣結(jié)束后(活化液己過(guò)柱)，用半個(gè)親和層析柱床體積 0.01MpH5.0磷酸緩沖液洗滌，合并上樣液和洗滌液，過(guò)濾取濾液凍干(2-3天)得糜蛋 白酶純化結(jié)晶。流出液 凍干脫鹽
上述方法中步驟(2)用0.01當(dāng)量的pH5.0磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH5.0。親和層析柱 為為抑肽酶作為配基，以瓊酯糖4B為骨架的親和層析柱(用羰基二咪唑或溴化氰活 化瓊酯糖4B，以0-HN-C-HN-(CH2)5-C0-HN-0H作為間隔臂，將抑肽酶連接上去)。除磷 酸緩沖液還可用醋酸鹽緩沖液。在本發(fā)明方法中，親和層析柱在使用后可用pH2.0~3.0的檸檬酸緩沖液處理后再 繼續(xù)使用。通過(guò)本發(fā)明純化方法制得的糜蛋白酶原結(jié)晶成品的單位效價(jià)》1200iu/mg (中國(guó) 藥典標(biāo)準(zhǔn)為》800iu/mg);并且其中的胰蛋白酶按中國(guó)藥典方法未檢測(cè)到。
具體實(shí)施例方式糜蛋白酶效價(jià)測(cè)定方法-底物溶液的制備取N-乙酰-L-酪氨酸乙酯23.7mg，置100ml容量瓶中，加磷酸 緩沖液(取0. 067mol/L磷酸二氫鉀溶液38. 9ml與0. 067mol/L磷酸氫二鉀溶液61. 1ml ， 混合，pH值為7.0)50ml，溫?zé)崾谷芙猓鋮s后再稀釋至刻度，搖勻。冷凍保存，但不 得反復(fù)凍融。測(cè)定法取0.0012mol/L鹽酸溶液0.2ml與底物溶液3.0ral，照紫外-可見分光光 度法，在25i:土0.5r，于237nm的波長(zhǎng)處測(cè)定并調(diào)節(jié)吸光度為0. 200。再取供試品溶 液0.2ml與底物溶液3.0ml,立即計(jì)時(shí)并搖勻，每隔30秒讀取吸光度，共5分鐘(重復(fù) 一次)，吸光度的變化應(yīng)恒定，恒定時(shí)間不少于3分鐘。若變化率不能保持恒定，可用 較低濃度另行測(cè)定。每30秒鐘的吸收度變化率應(yīng)控制在0.008-0.012，以吸收度為縱 坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，作圖，取在3分鐘內(nèi)呈直線的部分，按下式計(jì)算。P=(A2-A1)/0.0075TW，式中P為每lmg糜蛋白酶的效價(jià)，單位；A2為直線上開始 的吸光度；Al為直線上終止的吸光度T為A2至Al讀書的時(shí)間(分)；W為測(cè)定液中 含供試品的量,mg; 0.0075為在上述條件下，吸光度每分鐘改變0.0075，即相當(dāng)于1個(gè) 糜蛋白酶單位。 胰蛋白酶效價(jià)的檢測(cè)方法對(duì)照品溶液的制備取酪氨酸對(duì)照品，精密稱定，置乳缽中，加冷至5'C以下的 氯化鈣溶液(取氯化鈣1. 47g，加水500ml使溶解，用0. lmol/L鹽酸溶液或0. lmol/L氫 氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-6.2)少量，研磨均勻，置100ml量瓶中，加氯化鈣溶液 至刻度，藥勻；精密量取適量，加入冷至5'C以下的硼酸鹽緩沖液(取硼砂2.85g、硼 酸10. 5g與氯化鈉2. 50g,加水使溶解成1000ml,調(diào)節(jié)pH值至7. 5±0. 1 )，制成每lml 中含胰蛋白酶約0. 12活力單位的溶液。測(cè)定法取試管3支，分別精密量取供試品原液lml與上述硼酸緩沖液2ml，在40 'C水浴中預(yù)熱的酪蛋白溶液(取酪蛋白對(duì)照品1. 5g，加0. lmol/L氫氧化鈉溶液13ml與 水40ml，在60。C水浴中加熱使用溶解，放冷，加水稀釋至lOOml，調(diào)節(jié)pH至8. 0) 5ml ， 搖勻，立即置40°C±0. 5'C水浴中精確反應(yīng)30分鐘，再各精密加入5%三氯醋酸溶液5ml， 搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作供試品溶液；另精密量取供試品原液lml，加上述硼酸鹽緩沖 液2.0ml，在40'C水浴中保溫10分鐘，精密加入5X三氯醋酸溶液5ml，搖勻，置40°C 士0.5。C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘，立即精密加入酪蛋白溶液5ml，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾 液作空白對(duì)照；照紫外-可見分光光度法，在275nm的波長(zhǎng)處，測(cè)定并計(jì)算供試品溶液 吸光度的平均值(A)。另用0.2mol/L鹽酸溶液作空白對(duì)照，在275nm的波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì) 照品溶液的吸光度(As)。按下式計(jì)算每lg含胰蛋白酶活力(單位)=(A/As) X (Ws/181. 19) X (13/30) X (n/W)式中Ws為對(duì)照品溶液每lnil含酪氨酸的量,ug;W為供試品取樣量,g;n為供試品的稀釋倍數(shù)(500)。在上述條件下，每分鐘水解酪蛋白生產(chǎn)三氯醋酸不沉淀物(肽及氨基酸等)在275nm 波長(zhǎng)處與lu mol酪氨酸的酶量，為1活力單位。供試品溶液測(cè)得的A值在O. 15-0.6，否則應(yīng)調(diào)整濃度，另行測(cè)定。實(shí)施例一100克糜蛋白酶原加入7倍量冷蒸餾水(v/w)，滴加2.5mol/L硫酸6.6 ml溶 液使pH2.0左右，使溶解，加入2倍量(v/w)的飽和硫酸銨溶液使成達(dá)到0.25飽和度， 滴加5mol/L氫氧化鈉5.4 ml使pH達(dá)5.0，在25'C條件下結(jié)晶48小時(shí)，過(guò)濾得結(jié)晶。 再按上述步驟重復(fù)結(jié)晶三次。將濾干的糜蛋白酶原結(jié)晶按其重量126g加入3倍量 (v/w)冷蒸餾水378ml，滴加lml的2.5mol/L硫酸溶液使溶解，再加入1倍量 (v/w)pH7.6、 0.5mol/L磷酸緩沖液再加入3.5ml的5mol/L氫氧化鈉使pH達(dá)7.6,再 按每100ml溶液加入5mg胰蛋白酶，置5t冷處活化48小時(shí)左右?；罨壕譃锳、 B，均為412ml。A:(已有技術(shù)工藝的純化方法)412ml的A活化液滴加3.2ml的2.5mol/L硫酸溶液使PH達(dá)4.0左右，加入21 lg 固體硫酸銨使成0.7飽和度鹽析。過(guò)濾收集鹽析品，重102g,加入濾餅重量的1.3倍 (v/w)蒸餾水溶解，裝入透析袋中，每包小于100ml，置于5'C冷水中透析48-72小時(shí)。 過(guò)濾取清液，共計(jì)166ml凍干，得成品A。重量25.0克，902iu/mg，共0.226億iu。 含有少量胰蛋白酶。B:(親和層析——本發(fā)明方法)412ml的B活化液過(guò)濾至澄清，濾液滴加2.6ml的2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié) pH5.0，進(jìn)入親和層析柱上樣，上樣結(jié)束后再用200ml的0.01MpH5.0磷酸緩沖液洗 滌，合并上樣液和洗滌液共608ml，滴加5.6ml 2.5mol/L硫酸溶液使PH達(dá)4.0左右， 加入固體硫酸銨3O4g使成0.7飽和度鹽析。過(guò)濾收集鹽析品，重98g，加入濾餅重量 的1.3倍(v/w)蒸餾水溶解，裝入透析袋中,每包小于100ml，置于5'C冷水中透析48-72 小時(shí)。過(guò)濾取清液152ml凍干，得成品B。重量18.7克，1150iu/mg，共0.217億iu。 胰蛋白酶微量檢出(數(shù)據(jù))。親和層析柱再用pH2.0—3.0緩沖液處理待用。實(shí)施例二100克糜蛋白酶原加入7倍量冷蒸餾水(v/w),滴加2.5mol/L硫酸溶液6.0ml 使pH2.0左右，使溶，加入2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液使成達(dá)到0.25飽和度，滴加 5mol/L氫氧化鈉4.7ml使pH達(dá)5.0，在25。C條件下結(jié)晶48小時(shí)，過(guò)濾得結(jié)晶。再 重復(fù)結(jié)晶三次。將濾干的糜蛋白酶原結(jié)晶122g按其重量加入3倍量冷蒸餾水366ml， 滴加1.5ml的2.5mol/L硫酸溶液使溶解，再加入1倍量pH7.6、 0.5mol/L磷酸緩沖液 再加入2.9ml的5mol/L氫氧化鈉使pH達(dá)7.6，按照每100ml溶液加入5mg胰蛋白酶， 置5'C冷處活化48小時(shí)左右。活化液均分為A、 B，均為402ml。 A:(同例l)402ml A活化液滴加2.5mol/L 3.1ml硫酸溶液使pH達(dá)4.0左右，加入固體硫酸 銨201g使成0.7飽和度鹽析。過(guò)濾收集鹽析品重125g,加入濾餅重量的1.3倍(v/w)蒸餾水溶解，裝入透析袋中，每袋小于100ml，置于5。C冷水中透析48-72小時(shí)。過(guò) 濾取清液201ml凍干，得成品A。重量25.6克，908iu/mg，共0.232億iu。含有少量 胰蛋白酶。B- (親和層析——本發(fā)明方法) 402ml的B活化液過(guò)濾至澄清，加入0.8ml的2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH6.0， 進(jìn)入親和層析柱上樣，上樣結(jié)束后再用200ml的0.01MpH6.0磷酸緩沖液洗滌，合并 上樣液和洗滌液共605ml，滴加2.5mol/L硫酸溶液5.9ml使pH達(dá)4.0左右，加入固 體硫酸銨302.5g使成0.7飽和度鹽析。過(guò)濾收集鹽析品106g,加入濾餅重量的1.3 倍(v/w)蒸餾水溶解，裝入透析袋中，每包小于100ml，置于5'C冷水中透析48-72小 時(shí)。過(guò)濾取清液208ml凍干，得成品B。重量18.0克，1250iu/mg，共0.225億iu。 胰蛋白酶檢測(cè)不出。親和層析柱再用pH2.0—3.0緩沖液處理待用。實(shí)施例三100克糜蛋白酶原加入7倍量冷蒸餾水(v/w)，滴加2.5mol/L硫酸溶液5.9ml使 pH2.0左右，使溶，加入2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液使成達(dá)到0.25飽和度，滴加5mol/L 5.2ml氨氧化鈉使PH達(dá)5.0，在25'C條件下結(jié)晶48小時(shí)，過(guò)濾得結(jié)晶。再重復(fù)結(jié)晶 三次。將濾干的糜蛋白酶原結(jié)晶152g，按其重量加入3倍量(v/w)456ml冷蒸餾水， 滴加lml的2.5mol/L硫酸溶液使溶解，再加入1倍量pH7.6、 0.5mol/L磷酸緩沖液 再加入2.8ml的5mol/L氫氧化鈉使pH達(dá)7.6，加入5mg胰蛋白酶，置5匸冷處活化 48小時(shí)左右?；罨壕譃锳、 B，均為516ml。A:(同例1)516ml的A活化液滴加3.7ml的2.5mol/L硫酸溶液使PH達(dá)4.0左右，加入208g 固體硫酸銨使成0.7飽和度鹽析。過(guò)濾收集鹽析品，重112g，加入濾餅重量的1.3倍 (v/w)蒸餾水溶解，裝入透析袋中，每包小于100ml，置于5'C冷水中透析48-72小時(shí)。 過(guò)濾取清液192ml凍干，得成品A。重量24.0克，910iu/mg，共0.218億iu。含有少量胰蛋白酵。B:(親和層析一一本發(fā)明方法)516mlB活化液過(guò)濾至澄清，加入0.2ml 2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH7.0，進(jìn)入親 和層析柱上樣，上樣結(jié)束后再用200ml的0.01MpH7.0磷酸緩沖液洗滌半個(gè)親和層析 柱床體積，合并上樣液和洗滌液，共702ml，滴加3.5ml的2.5mol/L硫酸溶液使pH達(dá) 4.0左右，加入351g固體硫酸銨使成0.7飽和度鹽析。過(guò)濾收集鹽析品，共105g， 加入濾餅重量的1.3倍(v/w)蒸餾水溶解，裝入透析袋中，每包小于100ml，置于5'C 冷水中透析48-72小時(shí)。過(guò)濾取清液184ml,凍干，得成品B。重量17.0克，1223iu/mg， 共0.208億iu。檢測(cè)后沒(méi)胰蛋白酶活力。親和層析柱再用pH2.0—3.0緩沖液處理待 用。從上述對(duì)照實(shí)例顯示，本方法生產(chǎn)的糜蛋白酶檢測(cè)后沒(méi)胰蛋白酶活力，要優(yōu)于 不進(jìn)行親和層析的傳統(tǒng)方法。 親和層析柱的制備方法1) 用羰基二咪唑或溴化氰活化瓊酯糖4B填料，引入間隔臂a.用羰基二咪唑活化瓊 脂糖填料在沙芯漏斗中充分清洗瓊脂糖500ml，以除去有機(jī)相；用濃度遞增 (0-50%)的二氧六環(huán)逐漸轉(zhuǎn)入有機(jī)相；將羰基二咪唑50ml溶于二氧六環(huán)中，同瓊 脂糖混合攪拌；引入30ml的HO-HN-C-HN-(CH2)5-CO-HN-0H間隔臂混合攪拌; 再用濃度遞減的二氧六環(huán)洗滌(50%-0)，最后置換到水相中；b.用常規(guī)的溴化氰方 法活化瓊脂糖填料；2) 采用抑肽酶作為親和層析樹脂的配基將抑肽酶5g和縮合劑l-乙基-3-碳二亞胺 鹽酸鹽5g溶解在500ml的NaHC03溶液中，然后與活化后已連接 O-HN-C-HN-(CH2)5-CO-HN-0H間隔臂的瓊脂糖填料按體積比1 : IO混合，于室溫 下振蕩2hr偶聯(lián)，使配基連接到瓊脂糖填料上，反應(yīng)結(jié)束后，將填料抽干，充分洗 滌，再用Tris-HCl緩沖液4L和乙酸鹽緩沖液4L交替洗滌2次(每次各2L)以上， 抽干，待用。
權(quán)利要求
1、一種糜蛋白酶的親和層析純化方法，其特征在于該純化的方法采用親和層析技術(shù)，利用抑肽酶與胰蛋白酶、糜蛋白酶和其他蛋白水解酶親和性的差異，使用化學(xué)反應(yīng)使抑肽酶作為配基與瓊酯糖4B結(jié)合，將胰蛋白酶去除；包括下列步驟1)糜蛋白酶原活化液制備糜蛋白酶原水溶液配制成硫酸銨飽和溶液，調(diào)節(jié)pH5.0，結(jié)晶，然后再重復(fù)結(jié)晶4次得糜蛋白酶原結(jié)晶，加入硫酸溶液，加第四次結(jié)晶1倍量v/w的磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH7.6，加入胰蛋白酶，5℃冷卻活化后制得糜蛋白酶原活化液；2)糜蛋白酶原活化液純化上述糜蛋白酶原活化液過(guò)濾，濾液調(diào)節(jié)pH5.0，進(jìn)入親和層析柱上樣，上樣結(jié)束后，用半個(gè)親和層析柱床體積0.01MpH5.0磷酸緩沖液洗滌，合并上樣液和洗滌液，過(guò)濾取濾液凍干得糜蛋白酶純化結(jié)晶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的糜蛋白酶制備的親和層析方法，其特征在于步驟(2) 的親和層析柱為抑肽酶作為配基，以瓊酯糖4B為骨架的親和層析柱。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的糜蛋白酶制備的親和層析方法，其特征在于步驟(2) 的緩沖液為0.01當(dāng)量的pH5.0磷酸或pH5.0醋酸鹽緩沖液。
4、 權(quán)利要求l所述方法制得的糜蛋白酶成品，單位效價(jià)》1200iu/mg，并且其中 的胰蛋白酶按中國(guó)藥典方法未檢測(cè)到。
全文摘要
一種采用抑肽酶為配基的親和層析純化糜蛋白酶的方法，利用抑肽酶和胰蛋白酶、糜蛋白酶、其他蛋白酶水解酶親和力的差異，純化糜蛋白酶的方法，本發(fā)明方法可提高糜蛋白酶的純度，并且對(duì)提高糜蛋白酶的穩(wěn)定性，減少其用藥副反應(yīng)有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N9/64GK101126084SQ20061003012
公開日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2006年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月16日
發(fā)明者章海峰 申請(qǐng)人:上海第一生化藥業(yè)有限公司