專利名稱：一種同步擴增檢測肝炎及艾滋病毒核酸的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于診斷試劑核酸診斷技術領域，具體涉及一種靈敏度高、特異性強、適合于常規(guī)血液核酸篩查的同步提取和同步實時檢測肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)和艾滋病毒核酸的方法和試劑盒。
背景技術：
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，超過一半國家沒有對獻血者獻出的血液進行徹底檢驗，導致艾滋病、肝炎、瘧疾和梅毒等疾病在很多地方泛濫。全球每年增加的560萬名艾滋病毒攜帶者中，有5％至10％的人是經(jīng)由輸血或血液制品而感染的。在非洲兒童和婦女中病毒攜帶者，這一比例高達20％-25％。20世紀80年代以來，法國、日本、羅馬尼亞、美國、德國以及我國等都曾因血液篩查欠缺而導致過嚴重的后果。血液傳染病一旦在一個地方發(fā)生，往往會造成爆炸性傳播，因此輸血安全對人民的安全和社會的穩(wěn)定有著極其特殊的意義。臨床血液檢測也面臨日益劇增的檢測壓力。據(jù)WHO估計，我國艾滋病感染人數(shù)到2010年將達到1000萬，并持續(xù)高速增長。我國有60％以上的人曾受到乙肝病毒的感染，最終有1/10左右的人成為乙肝表面抗原陽性。另外，在所有肝炎中慢性化程度最高的丙肝，發(fā)病人數(shù)也達到4000萬左右。
與血液安全的極端重要性相比，目前的檢測手段還遠遠滯后于社會的需要。目前對輸血安全性構成嚴重威脅的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病(HIV)病毒主要采用酶免疫(EIA)法進行檢測。雖然經(jīng)過了幾代的改良，在靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性等方面取得了長足的進步，但作為一種間接滯后的檢測方法，它所檢測的是病毒所引發(fā)的人體抗體而不是病毒本身。故它不能夠消除對“窗口期”標本的漏檢，所謂“窗口期”即在被感染早期，體內還未產(chǎn)生抗體或抗體在檢測限以下，此時的血清學檢測一般為陰性。而HBV、HCV、HIV病毒感染產(chǎn)生抗體的窗口期又特別長，其中丙型肝炎病毒(HCV)的窗口期約為66-82天，乙型肝炎病毒(HBV)和人類免疫缺陷綜合癥病毒(即艾滋病)(HIV)的窗口期分別是大約59天和22天。另外，由于病毒的突變等事件的發(fā)生，也造成了部分免疫學方法檢測漏檢的可能。所以免疫學診斷方法存在固有的缺陷，不能杜絕漏檢。檢驗方法的滯后已給輸血安全和臨床檢驗帶來嚴重威脅。
近年來，核酸技術的發(fā)展和逐漸成熟為人們直接檢測病毒的存在提供了最有力的工具。核酸擴增技術(Nucleic acid AmplificationTechnology，NAT)就是這一類技術的統(tǒng)稱。核酸檢測的是病毒基因本身，是在最根本的層面上對病毒的檢測。核酸檢測大大縮短了病毒檢出的窗口期，并具有極高的靈敏度、特異性、精密度和穩(wěn)定性。事實證明NAT檢測可將HBV，HCV和HIV感染的平均“窗口期”分別縮短25天、59天和11天，分別縮短“窗口期”45％、89％和50％。正因為如此，越來越多的國家認識到血液核酸檢測的重要性，在西歐等國家作為強制性指標在臨床輸血及血制品中執(zhí)行，同時，美國，日本，歐盟已將NAT檢測納入獻血者的常規(guī)篩查項目。
國外已有多個單項核酸檢測產(chǎn)品投放市場。美國、澳大利亞、加拿大等國家相繼有產(chǎn)品問世。羅氏公司也開發(fā)了核酸診斷試劑盒。但這些試劑盒要么是開放型的PCR-ELISA檢測模式，要么操作繁瑣，易發(fā)生檢測污染，并且都是單個指標單次檢測，這些缺陷使之很難適應市場現(xiàn)狀的需要。分析這些核酸診斷試劑的現(xiàn)狀，存在著以下幾個嚴重不足1)試劑是開放式的，污染的可能性大；自動化程度低，而自動化和全封閉性是核酸檢測最關鍵的技術瓶頸。2)試劑為單項檢測的，沒有一個血篩試劑可以同步提取、同時實時檢測多種病毒核酸(如HBV，HCV，HIV)，如FDA批準的羅氏血液篩查試劑均為單項操作，使用的擴增程序各不相同，檢測過程也不盡相同；FDA批準的另一家GEN-PROBE公司所使用的TMA技術可以同時擴增HCV與HIV，但不能同時擴增HBV；另外檢測要么是不同管操作，各測各的；要么是同管操作，但一旦測定結果為陽性時卻不能分辨是HCV還是HIV。迄今為止，美國FAD只批準過上述兩個產(chǎn)品可用于血液核酸篩查。3)操作繁瑣，重復性差，通量低，不適于臨床檢驗和大規(guī)模的血液篩查。4)兼容性差，大多提供核酸提取試劑的廠家往往不提供擴增檢測試劑或者二者不能很好的匹配，需要用戶調整甚至優(yōu)化；有的能同時提供匹配的試劑，卻又不一定適用于特定的核酸自動提取儀；即使上述條件得到滿足，用戶還要根據(jù)擴增檢測試劑的要求選用指定的儀器如COBAS AMPLICOR等。5)試劑往往不是即用型的，例如使用前需要溶解干粉、在一些瓶瓶罐罐中加入指定量的乙醇或異丙醇等有機試劑，有的試劑使用前還有復雜的配制工作，稍有不慎就造成試驗的徹底失敗。不同人員的操作還引入試劑準備這一步驟的操作誤差；并且某些試劑一旦開封后或復溶后即使低溫保存有效期也只有幾天，尤不適于標本量較少情況下的多批次反復使用。前述的種種狀況嚴重阻礙了血液核酸篩查在血站以及檢驗檢疫等機構的大規(guī)模使用，也不利于核酸檢測在大中型醫(yī)院檢驗科室的廣泛應用，成為血液篩查和臨床核酸檢驗方法發(fā)展的瓶頸之一。
因此，本領域迫切需要開發(fā)適合于常規(guī)血液核酸篩查的自動化、高通量、多項目的同步核酸提取和實時擴增檢測技術平臺及可應用于規(guī)?；a(chǎn)的性能穩(wěn)定、可操作性強、即用型試劑的試劑盒，并有相關的儀器、耗材與之匹配。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種能同步提取HBV、HCV、HIV病毒的核酸、同步實時擴增檢測HIV、HBV、HCV病毒核酸的試劑盒，以克服傳統(tǒng)蛋白檢測固有的缺陷和不足，同時彌補現(xiàn)有國內外同類產(chǎn)品的諸多不足乃至方法學上無法解決的致命缺陷。
本發(fā)明提出一種能同步提取并同步實時測定血清或血漿標本中HIV(艾滋病)、HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)病毒核酸是否存在的方法和試劑盒。按照本發(fā)明所述的方法包括以下四項相對獨立又相互關聯(lián)的內容，并且提供了可選的組合以供完整實現(xiàn)本發(fā)明所述的試劑盒。①本發(fā)明公開了一種基于雜交原理選用磁珠作為自動化介質，使用磁珠分離儀實現(xiàn)特異性同步捕獲多種病毒核酸的方法及其改良方法以及試劑，其特征是選用了與后續(xù)擴增檢測中一條引物序列相一致的生物素修飾的寡核苷酸作為核酸提取試劑的捕獲探針，其優(yōu)點是既避免了漏檢又不干擾后續(xù)的PCR檢測。②本發(fā)明還公開一種新型RNA外標(即陽性對照)和RNA內對照(競爭性內標)的快速加端PCR構建及純化方法，尚未見于任何文獻報道或實例應用，其特點是快速、高效，優(yōu)點是RNA制品中沒有模板DNA的污染或其污染低到無法檢測，尤其適合作為質控全程監(jiān)測核酸提取、RT反應、PCR擴增檢測的有效性。③本發(fā)明還提出了設計綠色環(huán)保型試劑盒的基礎---陽性對照和內對照的基因工程構建法或PCR構建法，使試劑盒內的陽性對照和內對照均無傳染性。④最后也最為關鍵的是本發(fā)明公開了一種適合于血液篩查的一步法單管雙酶多項聯(lián)合檢測的TaqMan PCR擴增法，該體系含有UNG-dUTP“built-in”的防污染成分，所檢測的項目為HBV DNA、HCV RNA、HIVRNA三個病毒核酸，既有DNA，又有RNA，并且體系中帶有檢測假陰性發(fā)生與否的內對照組份，本項發(fā)明最突出的優(yōu)點在于該檢測試劑的優(yōu)秀的靈敏度和特異性及各亞型的覆蓋率，并且不同亞型擴增效率近似等效，使其能滿足血液核酸篩查極其苛刻的要求；其顯著的特點是使用廉價的雙酶(即含逆轉錄酶和耐熱DNA聚合酶)體系，區(qū)別于與Roche公司的r Tth或ZO5酶等單酶體系。顯而易見的，擯棄單酶體系原料昂貴的價格因素之外，單酶體系的優(yōu)化難度與雙酶體系的優(yōu)化難度是不可同日而語的。以往，使用相對廉價的雙酶體系用到對靈敏度、特異性、抗污染、多項目有要求的常規(guī)血液篩查中被多數(shù)人認為是不可行的。
1、本發(fā)明提供了一種基于雜交釣取原理，特異性同步捕獲提取HBV、HCV、HIV核酸的方法，其特征是選用了與后續(xù)擴增檢測中一條引物序列相一致的生物素修飾的寡核苷酸作為核酸提取試劑的捕獲探針，其優(yōu)點是既避免了漏檢又不干擾PCR檢測理論上凡是PCR可以擴增的片段均不會在標本提取這一步由于捕獲探針序列設計的缺陷而漏掉，不僅因為用于擴增的引物序列的保守性與特異性經(jīng)受過嚴格的篩選及臨床實踐檢驗，更重要的是，凡是PCR可以擴增的陽性標本，一定可以為該探針所捕獲；另一方面，基于雜交捕獲法核酸純化的最后一步是高溫洗脫，難以避免生物素探針與鏈親和素包裹的磁珠分離而進入洗脫液，有可能有μM級濃度的探針進入洗脫液，如果探針的序列不是引物部分，就有可能作為冗余的寡核苷酸干擾PCR擴增。反之，充其量不過是PCR反應中引物比例不是等比例而已，這種特定情況下的PCR基本和等比例下的PCR沒有區(qū)別。另外，本項發(fā)明還提供了一種變通的通用捕集方法，即設計一段中間探針，無修飾的普通寡核苷酸(與后續(xù)的熒光PCR體系中的一條引物序列相一致)其3’端接有一連串的A如Oligo(d A)18-25，作為中間雜交的主干探針，使用生物素修飾的Oligo(d T)25作為通用雜交捕獲探針；中間探針的5’端核酸序列作為特異性識別標本中的病毒核酸的“識別臂”，雜交并捕獲病毒核酸，而其3’端的Oligo(d A)18-25作為生物素化的Oligo(d T)25的識別位點，為其所捕獲，最后雜交形成的復合體為鏈親和素包裹的磁珠所吸附，經(jīng)過洗滌液A，B，C的依次清洗，除去非特異雜交物及PCR/RT-PCR抑制物諸如糖類，變性蛋白，脂肪，高鹽或重金屬等雜質，最后磁珠進入洗脫液經(jīng)過加熱，核酸模板從雜交復合體洗脫下來進入洗脫液.而仍吸附著生物素化Oligo(d T)25廢磁珠經(jīng)儀器自動移走，洗脫液即可作為熒光PCR檢測的模板。該方法的優(yōu)點是生物素標記的Oligo(d T)25是一致的，結合效率僅取決于設計的中間探針的雜交效率。本項發(fā)明還提供了另一種變通的方法，合成一條包含上述HBV、HCV、HIV特異探針序列的線形排列的寡核苷酸，作為一條三聯(lián)共同探針，中間可間隔有連接臂如3-8個T或A，生物素的修飾仍位于共同探針的5’端，這樣可以省去一些鏈親和素包裹磁珠的量，相應可提高磁珠的量至過量，有利于檢測靈敏度的進一步提高，尤其適合于磁珠使用量已經(jīng)飽和的測試(如多項目的提取)，因為磁鐵吸附磁珠是有一個飽和度的，多于一定量就無法吸附干凈。本項發(fā)明并不排除上述方法的組合或復合組合，如合成一條包含上述HBV、HCV、HIV特異探針序列的線形排列的寡核苷酸，其3’端接有一連串的A如Oligo(d A)18-25，作為中間雜交的主干探針，使用生物素修飾的Oligo(d T)25作為通用雜交捕獲探針等。
使用上述雜交原理特異性提取純化的最顯著優(yōu)點在于提高了檢測的特異性，避免了PCR的假陽性。雖然PCR作為一種特異性極高的檢測方法，但是仍有一定比例的非污染因素造成的假陽性報道，排除了引物序列設計不合理的因素之后，被認為與提取到的模板中含有大量的其它雜核酸有關。而特異性提取方法僅提取所研究的核酸從而避免了干擾因素。另外，該方法基于雜交原理，用于提取富含PCR抑制物質如高血脂、高度溶血、黃疸、甚至肝素化血標本均無干擾；而傳統(tǒng)的硅膠膜提取方法由于肝素與核酸相似均為富含負電荷的線形大分子，均易于吸附到硅膠膜上最后洗脫入洗脫液作為模板而抑制PCR/RT-PCR。常規(guī)血篩中由于日檢測標本多、工作量大，即使PCR假陽性低到萬分之一，富含抑制物的標本幾率為萬分之一，不到幾天就會遇到一個，這樣既浪費時間用于復測，又浪費血，還有可能由于PCR抑制物存在導致假陰性的發(fā)生。本項發(fā)明所公開的特異性同步提取方法結合下述的同步擴增檢測試劑為血液篩查提供了雜交提取與TaqMan探針法PCR的雙重特異性保障，并有效去除了極其罕見標本中可能含有的PCR抑制物，避免假陰性發(fā)生。
2、本發(fā)明還提供了一種新型RNA外標(即陽性對照)和RNA內對照(競爭性內標)的快速加端生物素修飾引物的PCR構建及純化方法，尚未見于任何文獻報道或實例應用。其特點是快速、高效，RNA制品中沒有模板DNA的污染或其污染低到無法檢測。用于構建RNA內對照的引物，其5’加端并修飾有生物素，其中一條引物5’加端為附加有T7 RNA聚合酶的轉錄啟動子識別位點序列?？梢钥焖僦苽銻NA內對照，當PCR/RT-PCR獲得含有靶序列的DNA后，將鏈親和素包裹的磁珠直接加入，結合帶有生物素化的PCR產(chǎn)物，棄去液體，用PCR緩沖液洗滌2次后，加入轉錄緩沖液及T7 RNA聚合酶在37℃反應50-60分鐘后用PCR緩沖液稀釋所得的轉錄出的RNA及原先的DNA模板復合物，熱變性后于冰上驟冷，DNA模板上帶有的生物素標記被牢固結合于鏈親和素包裹的磁珠，而轉錄出的RNA不帶有生物素標記而不能結合于磁珠，且由于變性使其與DNA模板完全分開，離心取上清或用磁鐵分離磁珠，剩下純凈的RNA制品，可以進一步用乙醇沉淀濃縮純化。本方法用于構建RNA外標及RNA內對照，只要一份陽性標本提取物，一次PCR/RT-PCR或兩次PCR/RT-PCR，加上兩個小時的純化工作，即可制得純凈的RNA制品用作質控。傳統(tǒng)的方法為PCR擴增得到片段，純化后接入載體如T載體，挑陽性克隆提取質粒并將重組質粒酶切線性化，再純化，進行體外轉錄，再用DNA酶消化，再純化RNA。整個過程需要基因工程實驗室的諸多設備，需要載體、感受態(tài)細胞、限制性內切酶，需要培養(yǎng)細菌，整個流程耗時長。相比之下本發(fā)明公開的方法要簡捷快速得多，本方法最大的優(yōu)點還在于提供的RNA制品要遠遠純于傳統(tǒng)方法。因為短片段的DNA模板消化總是不徹底的，經(jīng)過多次消化及純化甚至使用柱法純化仍無濟于事，無RT對照PCR試驗仍然檢測出數(shù)量可觀的DNA。而含有DNA的RNA對照很難真實地作為RNA病毒檢測的外對照或內對照，因其不能真實反應RT效率；如果以此為基礎建立定量對照，則存在定量不準確的風險，因為RNA病毒檢測的是其RNA，而定量對照中含有DNA/RNA，勢必造成檢測不同步趨于失真，而難以作為病毒載量的定量質控。
3、本發(fā)明還提出了設計綠色環(huán)保型試劑盒的基礎---陽性對照和內對照的基因工程構建法或PCR構建法陽性對照的制備和內對照的制備，陽性對照和內對照的單獨使用或者混合使用-----根據(jù)客戶群的要求、儀器設備等硬件條件設計。本發(fā)明在生物安全性方面有顯著優(yōu)勢。
本發(fā)明根據(jù)所檢測病毒的核酸類型，體外制備無傳染性的核酸片段作為試劑盒的陽性對照(RNA外標)及內對照(RNA內標)；陽性對照制備是將含有擴增靶序列的核酸片段(如HBV為含有HBV C區(qū)的質粒經(jīng)HCV為含有HCV 5’NCR區(qū)的質粒，HIV為含有HIV GAG區(qū)的質粒)經(jīng)酶切線性化DNA，再經(jīng)體外轉錄成RNA，并用DNA酶消化后純化得到RNA制品。當然可使用本發(fā)明所述的方法快速構建，這里只敘述一般的傳統(tǒng)方法的使用以強調作為綠色試劑盒的基礎不能在試劑盒中引入傳染性的因素，盡管其操作人員必須按照規(guī)程視為傳染性標本的來操作。上述的HBV、HCV、HIV陽性對照既可單獨使用，又可混合使用，還可使用基因工程的方法將上述的三個片段組裝到一個載體中再線性化，體外轉錄后根據(jù)需要使用其DNA或RNA，或二者混合使用。
內對照采用競爭性內標，也就是與陽性對照一樣擁有相同的引物結合區(qū)，但引物間隔區(qū)的核酸序列或排列不同，使其不能與檢測探針(陽性對照，可稱為外標探針)結合，但能與內標探針結合。該內對照可通過陽性對照模板的定點突變構建，也可使用嵌段PCR的方法構建。同樣，內對照根據(jù)檢測病毒的核酸類型構建成相應的DNA或RNA，可單獨使用，也可混合使用，還可通過基因工程的方法或加端PCR的方法將三個內對照片段組裝到一個片段中?？傊?，根據(jù)需要選擇最合適的方案，既講究內對照對整個核酸提取過程、RT過程、PCR擴增檢測過程的全程之有效監(jiān)控，又要講究它的引入不影響檢測的靈敏度；同時還要講究每個測試內對照的引入量過高則不能真實反應標本受抑制的情況，如輕微抑制看不出；過低則內對照的失敗率高，重復性差；一般選擇檢測靈敏度高2-20倍的內對照量作為監(jiān)控，具體到實踐操作可以有變化。那么具體到應用方案，將適當量的內對照加入到裂解液中參與核酸提取步驟中，這是一種標準的實施方案，但是并不排斥有的用戶直接在配置PCR反應液時將內對照加入，而在標本提取過程中并不引入內對照，這種作法也可實現(xiàn)標本提取物中是否含有PCR/RT-PCR抑制物的有效監(jiān)測，因此也應受到肯定。另外一些用戶由于熒光PCR儀為單通道檢測波長，無法使用內標探針檢測假陰性發(fā)生與否，雖然也可應用本發(fā)明所提供的試劑盒，但對結果的判定應當謹慎。
4、本發(fā)明還提出一種實時同步多項檢測的基于TaqMan探針的RT-PCR擴增法，其特點是使用單管的一步法RT-PCR雙酶體系試劑，多項檢測的項目既含DNA，又含RNA，所選用的抗污染體系為經(jīng)典的UNG-dUTP系統(tǒng)。所使用的一步法RT-PCR試劑為雙酶體系，即含逆轉錄酶和耐熱DNA聚合酶，逆轉錄酶不耐熱，RT溫度不能高于60℃，優(yōu)選方案為45-55℃，尤其是50℃。而該溫度下常規(guī)的基因工程制備的UNG(如目前市售的絕大多數(shù)的UNG)具有降解逆轉錄出來的含U的DNA(稱為U-DNA)，因此不能使用該UNG，優(yōu)選方案為不耐熱的UNG如來自于嗜寒的海洋細菌BMTU3346(熱不穩(wěn)定的UNG/heat-labile UNGEC3.2.2.3Roche-來源于嗜寒菌BMTU3346、USB--源于Gadus morhau、Epicenter--源于Gadus morhau等，這些公司均有產(chǎn)品出售)。其特點是儲存于一定基質中長期穩(wěn)定而一旦在PCR緩沖液中溫度為40℃時其半衰期僅兩分鐘，應用時不需做特定的程序設置，因為在RT-PCR試劑和RNA模板的準備工作中(混和時)該酶就起作用，迅速將上次RT-PCR污染如殘留的U-DNA降解，最佳的反應為20--30℃5-20分鐘。開始執(zhí)行RT-PCR時，該UNG迅速失活而不影響RT或PCR。本發(fā)明的同步多項檢測試劑最突出的優(yōu)點在于該檢測試劑的優(yōu)秀的靈敏度和其特異性及各亞型的覆蓋率并且不同亞型擴增效率近似等效。目前尚無一種報道使用雙酶單管RT-PCR體系引入抗污染方案并且能成功地用于多項對靈敏度有要求的同步檢測(即有DNA又有RNA)，經(jīng)檢索只有一篇日本羅氏公司關于自動化的多檢Z05酶單酶RT-PCR TaqMan體系用于血篩的初步應用報道，而其使用的為單酶體系，其缺點是顯而易見的，該體系價格昂貴且為該公司專利所有，難以推廣應用；雙酶體系由于使用兩種廉價酶，由于兩種酶各自互成獨立體系，最優(yōu)反應條件各不相同，而靈敏度高的雙酶單管RT-PCR體系一直在業(yè)界被公認為具有一定難度的課題，同時其相對廉價的成本使得近年來相關學者研究的熱點之一。多項同檢同樣被認為具有挑戰(zhàn)性的難題。
本發(fā)明優(yōu)秀的品質很大程度上取決于所選用的HBV引物，HBV TaqMan探針；HCV引物，HCV TaqMan探針；HIV引物，HIV TaqMan探針序列。因此，本發(fā)明所公布的引物、探針序列毫無疑問應當受到所申請要求的權利保護之內。
綜上所述，本發(fā)明在于提出一種測定HIV(艾滋病)、HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)病毒核酸的試劑盒，包括同步提取HBV-HCV-HIV核酸的磁珠提取試劑及一次性耗材，其中含有去抑制劑、裂解液、磁珠懸液、洗滌液A、洗滌液B、洗滌液C、洗脫液等，和HBV-HCV-HIV核酸擴增試劑，其中含有RT-PCR反應液、探針、酶混合物、陽性對照、陰性對照，和內對照等。匹配儀器可使用上?？迫A試驗儀器系統(tǒng)所制造的KHB DP-1000、KHB DP-2000等，但不局限于這些，可能還有ROCHE的MagNA pure LC儀器、TECAN的與之相當?shù)膬x器、ThermoLabsystem公司與之相當?shù)膬x器、Beckman-Coulter與之相當?shù)膬x器、ABI公司與之相當?shù)膬x器等。
上述所提到的裂解液為裂解血清、血漿等體液標本中病毒顆粒的硫氰酸胍溶液，具體為4-6M硫氰酸胍，20-50mM Tris，PH6.0-8.0，1-20％NP-40，1-20％TritonX-100，0.1-10％SDS，0.01-1μM生物素化探針(捕獲探針)，1-10％聚合物等。其中捕獲探針為5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(對HBV)(SEQ.ID.NO.28)，5’BIOTIN-agtacc aca agg cct ttcg-3’(對HCV)(SEQ.ID.NO.29)，5’BIOTIN-cta tgt cac ttcccc ttg gtt ctc tc-3’(對HIV)(SEQ.ID.NO.30)，可以委托上海生工或大連寶生物合成，純度為PAGE或HPLC；所述磁珠懸液為鏈親和素包裹的磁珠，具體為含有TWEEN20的超順磁材料的磁珠，表面包有均勻一層鏈親和素，直徑為0.1-10μM，含有BSA、NaN3等成分，如E.Merck公司、Roche公司、Invitrogen公司、Toyabo公司、Agowa公司、Chemogen公司、Promega公司、Seradyn公司生產(chǎn)的磁珠；所述洗滌液A、B、C均為含氯化鋰的緩沖溶液，具體為洗滌液ALiCI，Tris PH7.0，十二烷基磺酸鋰，防腐劑及Tween 20等分散劑，色素如品紅或其它染料等，其中LiCI的濃度可以從0.15M-3M，Tris濃度可以是10-100mM，PH可以為6.0-8.0，十二烷基磺酸鋰的濃度可以從1％，防腐劑可以是疊氮鈉或PROCLIN300、PROCLIN150、硫柳汞、抗生素等，Tween 20的濃度可以從0.001-0.1％；洗滌液B成分與洗滌液A相仿但不含十二烷基磺酸鋰，色素不同或不含色素；洗滌液C成分與洗滌液B相仿但LiCI的濃度降低(如為0.1-1M)且不含色素等；所述去抑制劑為含有蛋白酶的醇溶液，去抑制劑含有蛋白酶和甘油等；所述洗脫液為低鹽緩沖液或水，洗脫液DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液，加有Tween 20等分散劑和EDTA、NaN3、DTT等。
本發(fā)明中，標本提取(裂解液中含有)所用的中間探針為5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(SEQ.ID.NO.15)和5’Biotin-Oligo(d T)25(SEQ.ID.NO.16)。
所述的引物乙肝病毒檢測引物針對乙型肝炎病毒核心區(qū)(C區(qū))的編碼基因中的一段基因片段，BF5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.1)，BR5’-ttc tgc gacgcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.2)。丙肝病毒檢測引物針對丙型肝炎病毒基因序列的5’非翻譯區(qū)，兩段引物序列為CF5’-cgg gag agc cat agt gg-3’(SEQ.ID.NO.4)，CR5’-agtacc aca agg cct ttc g-3’(SEQ.ID.NO.5)。艾滋病毒檢測引物針對HIV gag區(qū)的基因序列，兩段引物序列為IF5’-gac atc aag cag cca tgc aaa t--3’(SEQ.ID.NO.7)，IR5’-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(SEQ.ID.NO.8)。
所述探針為Taqman探針，包括內標(即內對照)探針和三種病毒的檢測探針，分別由不同的熒光基團標記或相同的熒光基團標記，但是至少內標探針的熒光基團不同于檢測探針的熒光基團，而優(yōu)選的TaqMan探針為TaqMan-MGB探針或非熒光淬滅基團的TaqMan探針，如BHQ-1或BHQ-2等。由于常規(guī)的TAMRA淬滅基團為熒光淬滅基團，自身帶有熒光，在多重反應中這種熒光干擾會相互疊加，而且其本身為一熒光基團占據(jù)了儀器的一個通道，使多重檢測少去一重檢測；本發(fā)明中采用的探針序列為HBV探針為5′FAM(Ned)-cgacga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′(SEQ.ID.NO.3)；HCV探針為5’FAM(Vic)-ctg cggaac cgg tga gta cac-NFQ-3’(SEQ.ID.NO.6)；HIV探針為5’FAM(Fam)-cca tca atg aggaag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’(SEQ.ID.NO.9)；內標探針為ICP5′Vic(Rox)-aac cttgga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’(SEQ.ID.NO.14)。
所述RT-PCR反應液為含有d ATP、d CTP、d GTP、d UTP、緩沖液、KCI、防腐劑和穩(wěn)定劑、上述引物等；所述酶混合物為多酶組份體系，具體含有逆轉錄酶、DNA聚合酶、RNasin、熱不穩(wěn)定的UNG、RT-PCR促進劑(如熱休克蛋白、gp32蛋白等)和酶穩(wěn)定劑(如各種糖類分子和表面活性劑，DTT，蛋白酶抑制劑)等；具體為RT-PCR反應液buffer中含1.8Mm d NTPs(含d UTP)，3.6mM DTT，3.5mM MgCl2，各0.4μM各引物(BF、BR、CF、CR、IF、IR)等；酶混合物0.6U/μl AMV逆轉錄酶，0.6U/μl熱啟動Taq DNA聚合酶，1U/μl RNasin；0.1U/μl UNG(heat-labile)等；探針10μM探針HBV Probe，HCV Probe，HIV Probe，5μM內標探針，穩(wěn)定劑及緩沖液。
所述陽性對照為含有部分HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA片段的混合物，均為擴增目的基因外側的一段基因DNA或RNA，其中HBV陽性對照僅由一段DNA不含HBV RNA，HCV陽性片段僅有一段RNA不含HCV DNA，HIV陽性片段僅有一段RNA不含HIV DNA，三者混合物適當稀釋后保存于核酸穩(wěn)定液中作為試劑盒的陽性對照；所述的內對照為競爭性內標RNA，包含有檢測項目相同的引物結合區(qū)，但與檢測項目的探針結合區(qū)不同，不能結合檢測探針，卻能結合內標探針。例如內對照可以是含有一段HIV引物結合區(qū)的體外轉錄RNA，但是探針區(qū)域經(jīng)過突變(PCR突變法或其它基因工程手段)不能識別HIV探針，而可以識別試劑盒中的內標探針，該內對照為RNA，不含DNA；所述的內標探針為一段人工合成的與檢測項目毫無關系的寡核苷酸，其5’的TaqMan修飾熒光基團不同任一陽性對照的檢測探針的熒光基團，便于區(qū)分同一份標本的檢測結果和內對照結果，并且要求標本檢測結果為陰性時內對照的結果必須為陽性。所述陰性對照為正常獻血員的血漿。
本發(fā)明試劑盒的標本處理所采用的是磁珠提取法。該技術使用鏈親和素磁珠(基于核酸雜交原理)，由于DNA和RNA均有相同的雜交性能，所以一般認為該方法對DNA及RNA有相同或近似的得率，通過多次洗滌后去除雜質，最后將核酸在低鹽或水中洗脫下來作為核酸擴增檢測的模板?？墒褂肒HB DP-1000或2000儀器，同時也不排除其它自動化儀器上的使用。將該技術應用于本診斷試劑盒后，一方面避免了傳統(tǒng)方法中使用酚、氯仿、異戊醇等有毒試劑，另一方面引入機械化操作，高通量自動化操作或半自動化操作，減少了人為操作因素對結果的影響。本領域技術人員通過短時間的培訓可以很快掌握其操作流程并領會其技術要領，還可以根據(jù)本發(fā)明提供的內容，加以少許的修改變通形成新的技術流程及試劑盒，但這些均落入本發(fā)明所聲稱的權利保護范圍以內。
本發(fā)明的試劑盒中擴增檢測所使用的為單管的一步法RT-PCR TaqMan雙酶體系，該技術采用逆轉錄酶如AMV或MMLV或SuperscriptI/SuperscriptII/SuperscriptIII或Ominiscript，耐熱DNA聚合酶采用Taq酶或金牌Taq酶或所謂的熱啟動Taq酶(如帶有其單克隆抗體的或化學修飾的或配基寡核苷酸預先失活的Taq酶)，還可選用其它耐熱聚合酶如Tfl酶等。選用的PCR buffer為TRIS-HCI或TRIS-H2SO4或TRIS-HOAc或Good’s緩沖液Bicine、Tricine，含有氯化鉀，還可含有硫酸銨、二甲亞砜、甲酰胺、甘油、TMAC、尿素、gp32蛋白、甜菜堿、牛血清白蛋白、非離子表面活性劑、TWEEN-20、TRITON X-100、NP-40、Brij-35、聚乙二醇、PVP、DTT、Aptamer、魚精蛋白、HSA、SSB、Alpha Casine、拓撲異構酶1和2、蔗糖、甘露糖、山梨醇、海藻糖、阿拉伯糖、聚蔗糖、糖原、明膠、鮭精DNA、小牛胸腺DNA、rRNA、tRNA、PolyA RNA、OLIGO(dT)、自行合成劑MP等附加劑。
本發(fā)明設計的用于實時同步多項檢測、基于TaqMan探針的RT-PCR擴增法，其特點是設計引物和探針序列特征為艾滋病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒所特有。其中，乙肝病毒的兩段引物序列為BF5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.1)，BR5’-ttctgc gac gcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.2)，探針采用Taqman探針類型，即在探針堿基兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團，HBV探針序列為5′FAM(Ned)-cga cga ggc agg acccct aga aga a-NFQ3′(SEQ.ID.NO.3)。
丙型肝炎病毒的兩段引物序列為CF5’-cgg gag agc cat agt gg-3’(SEQ.ID.NO.4)，CR5’-agt acc aca agg cct ttc g-3’(SEQ.ID.NO.5)，探針采用Taqman探針類型，即在探針堿基兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團，HCV探針序列為5’FAM(Vic)-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ-3’(SEQ.ID.NO.6)。
艾滋病毒的兩段引物序列為IF5’-gac atc aag cag cca tgc aaat--3’(SEQ.ID.NO.7)，IR5’-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(SEQ.ID.NO.8)。探針采用Taqman探針，即在探針堿基兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團。Taqman探針序列為5’FAM(Fam)-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’(SEQ.ID.NO.9)。內標探針為ICP5′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag agagaa-NFQ3’(SEQ.ID.NO.14)。
在PCR擴增時，熒光PCR儀對每個反應管產(chǎn)生的熒光信號進行檢測，信號強度超過檢測器閥值的報告為陽性，此時的PCR擴增循環(huán)次數(shù)(稱為CT)與標本中模板含量有負對數(shù)的關系，為儀器所自動紀錄。實時熒光PCR儀可實現(xiàn)標本模板擴增整個過程的熒光信號變化圖，可以十分形象地判斷標本的陰、陽性并能區(qū)分其強弱。
由于核酸檢測操作復雜，整個流程易受多種因素影響而可能使擴增失敗，使試劑盒操用人員可能由此得出檢測標本為陰性的錯誤結論。為避免此種情形的發(fā)生，必須在每個檢測管中設立對照即內對照，這樣即使由于極罕見的錯誤如某一標本管忘加模板了，內對照即可監(jiān)測出，或者PCR儀某一孔溫度效率有問題，內對照也可監(jiān)測出來。
本發(fā)明的試劑盒最優(yōu)組成中使用內對照質控系統(tǒng)，即在裂解液中加入特定序列的內對照RNA，與標本共同經(jīng)過裂解、純化、逆轉錄、擴增、TaqMan檢測各步驟。該內對照序列含一與待測標本無關的核酸片斷(如完全人工設計的隨即序列片斷或檢測項目探針序列的重排或一段質粒如PUC18序列等)，兩端含試劑盒中所用的引物序列，故可與待測標本共用同一對引物擴增。所用內對照探針為特異性針對該段無關序列的Taqman探針。如果試驗結果為標本、內對照均為陰性，則表明試驗失敗，試驗結果無效；試驗結果的其它情形則可以發(fā)生而且試驗結果有效。不含內對照的試劑盒盡管缺少了一道質控標準，但不影響正常使用。
本發(fā)明的試劑盒作為一種定性檢測的試劑，但并不排除可以作為定量檢測的試劑。由于本發(fā)明所采用的方法為TaqMan PCR，只需引入外標準品即可成為定量分析的試劑盒，雖然血液核酸篩查的意義在于定性分析，側重于試劑的靈敏度和特異性；臨床檢測及藥物療效監(jiān)控則側重于定量，載量試驗考究定量的準確性。
本發(fā)明的試劑盒需配合核酸磁珠提取儀及熒光PCR儀使用。
本發(fā)明具有以下幾方面的優(yōu)勢(1)封閉性檢測，自動化程度高，減少了人工操作，避免了可能的污染和人為的誤差；(2)多種核酸病毒的同步提取，同步實時檢測；(3)靈敏度高，特異性好，精密度高，穩(wěn)定性好，便于操作；(4)適用于大規(guī)模高通量的血液篩查，如血液中心和血液制品生產(chǎn)企業(yè)開展核酸篩查，也可適用于大容量高效率的臨床核酸檢驗。(5)整個流程時間短，能效比高。96個測試僅幾個小時就快速完成并報告可信度極高的結果。


圖1為Streptavidin磁珠捕獲核酸原理圖。
其中(A)為結合了生物索探針的磁珠結構圖；(B)為雜交復合物為Streptavidin磁珠所捕獲，雜交復合物-磁珠被磁鐵所富集的示意圖；(C)為整個雜交捕獲磁珠的原理圖。
圖2為快速的DNA/RNA對照品構建的示意3為快速的內對照DNA/RNA質控品構建的示意圖
具體實施例方式
實施例1 生物素修飾引物加端PCR法快速制備內對照及陽性對照(綠色環(huán)保型試劑盒的基礎)，1、HIV內對照及陽性對照的制備如下1.1陽性對照的快速構建委托上海生工合成以下引物，序列為5’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’(5’端斜體部分為T7 RNA pol啟動子區(qū)，3’端為HIV GAG區(qū)的上游引物)(SEQ.ID.NO.10)5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(HIV GAG區(qū)的下游引物)(SEQ.ID.NO.11)取臨床上HIV核酸強陽性的標本一份(或含HIV GAG基因的質粒一份)，用QIAamp ViralRNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸，嚴格按其使用說明書要求操作。抽提產(chǎn)物經(jīng)本發(fā)明建立的一步法RT-PCR試劑，用上述兩條引物擴增，按下述循環(huán)參數(shù)操作50℃30分鐘---94℃4分鐘---94℃20秒、55℃20秒、循環(huán)30-40次，最后72℃5分鐘末延伸。
72℃30秒、可以取部分反應產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條160bp大小的條帶。擴增產(chǎn)物中加入十倍體積的1XPCR Buffer，加入100-500μg的鏈親和素包裹的磁珠，混勻后室溫10分鐘，低速離心去上清，加入1XPCR Buffer 400μl洗滌磁珠2次，收集磁珠，使用RiboMAXTM Large ScaleRAN Production Systems-T7試劑盒(Promega公司)中的轉錄試劑如NTPs、Rnasin、DTT、轉錄緩沖液、T7 RNA Pol按照說明書加樣后，37℃轉錄1小時，取出后同樣以1XPCRBuffer稀釋，但不洗滌而需要變性處理，可采用90℃熱變性或NaOH變性還可選用硫氰酸胍變性，最后離心將結合在磁珠上的模板DNA去除，取其上清于一新的潔凈離心管中，加入無水乙醇沉淀RNA，將轉錄基質如NTPs等去除干凈，溶于RNA保護劑中。當然還可使用DNA酶進一步消化。所得到的RNA即為HIV RNA陽性對照母液，將其梯度稀釋于一定的液體中即可參與核酸提取、RT反應、PCR TaqMan擴增檢測全過程，作為試劑盒的生物安全的綠色的陽性對照。
1.2內對照的構建以上述構建的陽性對照DNA為基礎(也可以一份臨床上HIV核酸強陽性的標本為基礎)，委托上海生工合成以下引物，序列為5’-AAC CTT GGA ACC TTG GAA CTG GAG AGA GAA gagtgcatccagtgcatgcag-3’(SEQ.ID.NO.12其5’端為HIV檢測探針序列重排而來，與檢測探針有相同的GC％，相似的Tm值；3’端為HIV陽性對照上毗鄰檢測探針3’端位置的核酸序列)5’-TTC TCT CTC CAG TTC CAA GGT TCC AAG GTT tct ctt taa tta aca ttt gc-3’(SEQ.ID.NO.13其5’端與SEQ.ID.NO.12的5’端互補；3’端與HIV陽性對照上毗鄰檢測探針5’端位置的核酸序列互補)以陽性對照DNA為PCR模板，分別以SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.13為一對引物和SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12為另一對引物去擴增，使用的循環(huán)參數(shù)為94℃2分鐘---94℃10秒、45℃15秒、循環(huán)20次，最后72℃5分鐘末延伸。
72℃10秒、將上述兩種擴增產(chǎn)物純化后混和并梯度稀釋，分別作為下一輪PCR的模板。該輪PCR使用SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.11作為引物對擴增，程序同上，循環(huán)數(shù)增加到30-40個。此輪擴增產(chǎn)物即為內對照DNA，可以取部分產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條160bp(含有的HIVDNA134BP，另含T7RNA啟動子序列27BP)大小的條帶。同樣其磁珠純化、轉錄、保存均同上述的陽性對照(RNA)，最后制備得HIV內對照RNA純品?？蓞⒖嫉腍IV序列如下，可參考的原理圖如附圖3。
gaca tcaagcagcc atgcaaatgt taattaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatagagtgcatcca gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatag(SEQ.ID.NO.25)2、HCV內對照及陽性對照的制備如下2.1陽性對照的快速構建委托上海生工合成以下引物，序列為5’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG cgg gag agc cat agt gg-3’(5’端斜體部分為T7 RNA pol啟動子區(qū)，3’端為HCV NCR區(qū)的上游引物)(SEQ.ID.NO.17)5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’(HCV NCR區(qū)的下游引物)(SEQ.ID.NO.18)取臨床上HCV核酸強陽性的標本一份(或含HCV 5’NCR的質粒一份)，用QIAamp ViralRNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸，嚴格按其使用說明書要求操作。抽提產(chǎn)物經(jīng)本一步法RT-PCR試劑，用上述兩條引物擴增，按下述循環(huán)參數(shù)操作50℃30分鐘---94℃4分鐘---94℃20秒、50℃20秒、循環(huán)30-40次，最后72℃5分鐘末延伸。
72℃30秒、可以取部分反應產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條187bp亮帶。同1.1操作制備得到生物安全的綠色的陽性對照。
2.2內對照的構建以上述構建的陽性對照DNA為基礎，委托上海生工合成以下引物，序列為5’-AAC CTT GGA ACC TGG ACC GGG CGGAATTGCCAGGACGACCGGG-3’(SEQ.ID.NO.19其5’端為HCV檢測探針序列重排而來，與檢測探針有相同的GC％，相似的Tm值；3’端為HCV陽性對照上毗鄰檢測探針3’端位置的核酸序列)5’-CCC GGT CCA GGT TCC AAG GTT accactatggctctcc-3’(SEQ.ID.NO.20其5’端與SEQ.ID.NO.19的5’端互補；3’端與HCV陽性對照上毗鄰檢測探針5’端位置的核酸序列互補)以陽性對照DNA為PCR模板，分別以SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.20為一對引物和SEQ.ID.NO.18、SEQ.ID.NO.19為另一對引物去擴增，使用的循環(huán)參數(shù)為94℃2分鐘---94℃10秒、45℃15秒、循環(huán)20次，最后72℃5分鐘末延伸。
72℃10秒、將上述兩種擴增產(chǎn)物純化后混和并梯度稀釋，分別作為下一輪PCR的模板。該輪PCR使用SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18作為引物對擴增，程序同上，循環(huán)數(shù)增加到30-40個。此輪擴增產(chǎn)物即為內對照DNA，可以取部分產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條187bp大小的條帶。同樣其磁珠純化、轉錄、保存均同上述的陽性對照(RNA)，最后制備得HCV內對照RNA純品?？蓞⒖嫉腍CV序列如下，可參考的原理圖如附圖3。
C GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAGGACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCCGCGAGACTGC TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACT(SEQ.ID.NO.26)3、HBV內對照及陽性對照的制備如下3.1陽性對照的快速構建委托上海生工合成以下引物，序列為5’AGG GAG acc acc aaa tgc ccc tat-3’(SEQ.ID.NO.21)(5’端斜體部分為無關序列，防止DNA降解從5’開始致使陽性對照的引物結合區(qū)降解，3’端為HBV的上游引物)5’AGG GAG ttc tgc gac gcg gcg a-3’(SEQ.ID.NO.22)(5’端斜體部分為無關序列，3’端為HBV的下游引物)
取臨床上HBV核酸強陽性的標本一份(或含HBV DNA的質粒一份)，用QIAamp ViralMini Kit(QIAGEN公司)提取病毒核酸，嚴格按其使用說明書要求操作。抽提產(chǎn)物經(jīng)本試驗室建立的PCR試劑，用上述兩條引物擴增，按下述循環(huán)參數(shù)操作94℃2分鐘---94℃20秒、50℃20秒、循環(huán)30-40次，最后72℃5分鐘末延伸。
72℃30秒、可以取部分反應產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條131bp亮帶。使用膠回收純化試劑盒將電泳條帶回收純化即為HBV陽性對照母液，以DNA/RNA保存液梯度稀釋制備得到生物安全的綠色穩(wěn)定、合適濃度的陽性對照。
3.2內對照的構建以上述構建的陽性對照DNA為基礎，委托上海生工合成以下引物，序列為5’-TACGACGACGACGACGACGACGAGA gaactccc tcgcctcgc-3’(SEQ.ID.NO.23其5’端為HBV檢測探針序列重排而來，與檢測探針有相同的GC％，相似的Tm值；3’端為HBV陽性對照上毗鄰檢測探針3’端位置的核酸序列)5’-TCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTA tctaacaacagtagtttc-3’(SEQ.ID.NO.24其5’端與SEQ.ID.NO.23的5’端互補；3’端與HBV陽性對照上毗鄰檢測探針5’端位置的核酸序列互補)以陽性對照DNA為PCR模板，分別以SEQ.ID.NO.21、SEQ.ID.NO.24為一對引物和SEQ.ID.NO.23、SEQ.ID.NO.22為另一對引物去擴增，使用的循環(huán)參數(shù)為94℃2分鐘---94℃10秒、45℃15秒、循環(huán)20次，最后72℃5分鐘末延伸。
72℃10秒、將上述兩種擴增產(chǎn)物純化后混和并梯度稀釋，分別作為下一輪PCR的模板。該輪PCR使用SEQ.ID.NO.21和SEQ.ID.NO.22作為引物對擴增，程序同上，循環(huán)數(shù)增加到30-40個。此輪擴增產(chǎn)物即為內對照DNA，可以取部分產(chǎn)物電泳檢測觀察為一條131bp大小的條帶。使用膠回收純化試劑盒將電泳條帶回收純化即為HBV內對照DNA母液，以本公司的DNA/RNA保存液梯度稀釋制備得到生物安全的綠色穩(wěn)定、合適濃度的HBV內對照DNA?？蓞⒖嫉腍BV序列如下，可參考的原理圖如附圖3。
tatagaccac caaatgcccc tatcttatca acacttccgg aaactactgttgttagacga cgaggcagga cccctagaag aagaactccc tcgcctcgca gacgaaggtctcaatcgccg cgtcgcagaa gatctcaatc
(SEQ.ID.NO.27)實施例2 標本處理單元核酸提取的磁珠法及試劑配制基于雜交原理的標本處理單元試劑組成包括裂解液4.8M硫氰酸胍，50mM Tris，PH7.0，NP-40，Triton X-100，SDS，生物素化探針，聚合物等。其中捕獲探針為5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’(HBV)5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’(HCV)5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(HIV)磁珠懸液1mg/ml鏈親和素包裹的磁珠，含有防腐劑及Tween 20等分散劑洗滌液ALiCI，Tris PH7.0，十二烷基磺酸鋰，防腐劑及Tween 20等分散劑，色素等洗滌液BLiCI，Tris PH7.0，防腐劑及Tween 20等分散劑，色素等洗滌液CLiCI，Tris PH7.0，防腐劑及Tween 20等分散劑，色素等去抑制劑含有蛋白酶和甘油等洗脫液DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液，加有Tween 20等分散劑和EDTA、NaN3、DTT等內參照約含有40000拷貝/ml內參照RNA的溶液，使用時將其以1∶20的比例加入到裂解液中，在裂解液中的內對照的濃度約為2000拷貝/ml，每個測試加入0.1ml的裂解液也就是200拷貝內對照參與提取。擴增由于僅取1/5的模板量參與RT-PCRTaqMan檢測，所以每個檢測管中內對照RNA的參入量低于40拷貝。
操作流程取六塊專用96孔板(試劑盒提供)，編號為①②③④⑤⑥。
在板①中用排槍或普通移液器加入20μl去抑制劑，加入待測標本血清或血漿100μl，反復吸打1次左右，每加一個標本換一個吸頭，注意應使用帶濾芯的吸頭；最后加入裂解液100μl。
在板②中用排槍或普通移液器加入100μl磁珠懸液，注意使用磁珠懸液前一兩分鐘將其上下顛倒數(shù)次直到磁珠分散均勻不形成任何肉眼可見的沉淀為止。
在板③中用排槍或普通移液器加入200μl洗滌液A；板④中加入200μl洗滌液B；板⑤中加入200μl洗滌液C；板⑥中加入80μl洗脫液。
將上述六塊板分別按編號順序移入KHB DP-2000儀器操作艙的1-6號位，并在第4位的板④上移入專用板的深孔Tip Comb。
啟動KHB DP-2000儀上的“Start”鍵，使其執(zhí)行程序。
運行大約需要70分鐘，結束后取出板①-⑥，其中板⑥中的液體即為核酸模板，板①-⑤為廢板，經(jīng)消毒后統(tǒng)一廢棄。
實施例3 核酸擴增檢測單元單管的雙酶一步法RT-PCR TaqMan探針多檢體系的模式及試劑配制核酸擴增檢測單元采用熒光TaqMan PCR，要求配合熒光PCR儀使用。其組份包括如下RT-PCR反應液buffer中含1.8Mm d NTPs(含d UTP)，3.6mM DTT，3.5mM MgCl2，引物BF、BR、CF、CR、IF、IR各0.4μM。
酶混合物0.6U/μl AMV逆轉錄酶，0.6U/μl熱啟動Taq DNA聚合酶，1U/μl RNasin；0.1U/μl UNG(heat-labile)等。
探針10μM探針HBV Probe，HCV Probe，HIV Probe，5μM內標探針，穩(wěn)定劑及緩沖液。
試劑配比及配制按照每測試RT-PCR反應液∶酶混合物∶探針＝8∶6∶1的比例配制成15μl/測試，加入核酸模板15μl即可上機擴增實時檢測。
以ABI7500為例，儀器的擴增參數(shù)設置如下循環(huán)參數(shù)設定(可參照各類儀器的操作軟件進行設置)

實施例4 檢測模式之一的應用根據(jù)實際實驗硬件條件，本實例的用戶所使用的熒光PCR儀為雙通道的MJ Opticon2熒光PCR儀，優(yōu)選的檢測探針均用FAM熒光標記，內標探針使用HEX標記，內對照優(yōu)選加入到RT-PCR試劑配制中而不在裂解液里加入。而RT-PCR/PCR反應液中僅含各個檢測項目的引物，探針則每個項目為該項目的檢測探針和內標探針的混合物，內對照選用包含三個檢測項目引物結合區(qū)、中間探針結合區(qū)為內標探針結合序列的共同的內對照RNA。
待測標本編號為P1，P2，P3..PN，另有2個對照品(陰性對照和陽性對照)參與平行實驗。待測標本中含有很低拷貝數(shù)的HBV DNA或HCV RNA或HIV RNA。其中弱陽性標本P1為HBV DNA 1000拷貝/ML、P2為HCV RNA 1000拷貝/ML、P3為HIV RNA 1000拷貝/ML、P4系P1用陰性血漿十倍稀釋而來，P5系P2用陰性血漿十倍稀釋而來，P6系P3用陰性血漿十倍稀釋而來；P7系P1用陰性血漿二十倍稀釋而來，P8系P2用陰性血漿二十倍稀釋而來，P9系P3用陰性血漿二十倍稀釋而來；P10系P1用陰性血漿四十倍稀釋而來，P11系P2用陰性血漿四十倍稀釋而來，P12系P3用陰性血漿四十倍稀釋而來。

結果檢測標本的內對照均為陽性，而HBV標本在載量為1000拷貝/ML、100拷貝/ML、50拷貝/ML、25拷貝/ML時均為陽性，而陰性對照、稀釋血漿等檢測結果為陰性。HCV標本在載量為1000拷貝/ML、100拷貝/ML、50拷貝/ML時均為陽性，而25拷貝/ML、陰性對照、稀釋血漿等檢測結果為陰性。HIV標本在載量為1000拷貝/ML、100拷貝/ML、50拷貝/ML、25拷貝/ML時均為陽性，而陰性對照、稀釋血漿等檢測結果為陰性。
實施例5 檢測模式之二的應用本檢測模式為本發(fā)明的最佳體現(xiàn)選用四色乃至五色的熒光PCR儀如ABI7500，檢探針分別用FAM、VIC、NED熒光標記，內標使用ROX標記。內對照在裂解液里加入。T-PCR反應液中含各個檢測項目的引物，探針含各個項目的檢測探針和內標探針。內對照選用包含HIV引物結合區(qū)、中間探針結合區(qū)為內標探針結合序列的內對照RNA。標本同實施例3，實驗結果也與實施例3相同，但質控更為嚴格，操作更為方便，檢測模式與標本提取更加匹配，檢測通量更高。
實施例6 檢測模式之三的應用本檢測模式為實施例3與4的折衷方案儀器可用雙色熒光PCR儀，檢測的通量及嚴謹?shù)馁|控與實施例4相同，但一旦出來陽性擴增結果，不能區(qū)分哪個檢測項目為陽性。其優(yōu)選的要點為檢測探針均用FAM熒光標記，內標使用HEX或VIC或NED或JOE或TET等標記。內對照在裂解液里加入。RT-PCR反應液中含各個檢測項目的引物，探針含各個項目的檢測探針和內標探針。內對照選用包含HIV引物結合區(qū)、中間探針結合區(qū)為內標探針結合序列的內對照RNA。
標本同實施例3，實驗結果也與實施例3相同，質控嚴格，操作方便，檢測模式與標本提取相匹配，檢測通量高，但是HBV陽性或HCV陽性或HIV陽性或兩種同時陽性乃至三種共同陽性均不能知道。然而這在血液篩查中并不算得什么缺點，因為血篩的目的在于篩選出不合格的血液，不管哪種病毒核酸陽性或聯(lián)合陽性均為淘汰的血液。
實施例7 檢測模式之四的應用合成下列核酸作為HBV、HCV、HIV、內對照RNA的共同中間(捕獲)探針5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(99bp)純度PAGE或HPLC(SEQ.ID.NO.15)生物素化探針5’Biotin-Oligo(d T)25(SEQ.ID.NO.16)。
上述兩種探針同時配制在裂解液中，且有固定的比例，共同中間(捕獲)探針的量的優(yōu)化對提取靈敏度有決定性的作用。
試劑均同本發(fā)明的實施例2.1檢測流程同實施例2(標本提取)，檢測模式按實施例4，結果與實施例4檢測結果完全相同。
根據(jù)本發(fā)明的公開內容，本領域的熟練技術人員無需過多實驗即可對本發(fā)明所要求保護的血液篩查項目的試劑盒進行實施，并達到預期效果。本發(fā)明公開的實施例僅是對本發(fā)明進行描述，但并不構成對本發(fā)明的限制。本領域的熟練技術人員用顯而易見的相似替代物或改造，或用某些在化學上或生物上結構功能相關的制劑替代在此描述的制劑，或對本發(fā)明的有關內容進行變動，但不超出本發(fā)明的精神、范圍和思想，均落入本發(fā)明要求保護的范圍。
序列表SEQ.ID.NO.15’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’，SEQ.ID.NO.25’-ttc tgc gac gcg gcg a-3’，SEQ.ID.NO.35′FAM-cga cga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′，SEQ.ID.NO.45’-cgg gag agc cat agt gg-3’，SEQ.ID.NO.55’-agt acc aca agg cct ttc g-3’，SEQ.ID.NO.65′FAM-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ3′，SEQ.ID.NO.75′-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’，SEQ.ID.NO.85′-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’，SEQ.ID.NO.95′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’，SEQ.ID.NO.105’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’，SEQ.ID.NO.115’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’，SEQ.ID.NO.125’-AAC CTT GGA ACC TTG GAA CTG GAG AGA GAA gagtgcatccagtgcatgcag-3’，SEQ.ID.NO.135’-TTC TCT CTC CAG TTC CAA GGT TCC AAG GTT tct ctt taa tta aca ttt gc-3’，SEQ.ID.NO.145′Vic(Rox)-aac ctt gga acc ttg gaa ctg gag aga gaa-NFQ3’，
SEQ.ID.NO.155’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′，SEQ.ID.NO.165’Biotin-Oligo(d T)25SEQ.ID.NO.175’BIOTIN-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG cgg gag agc cat agt gg-3’SEQ.ID.NO.185’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’SEQ.ID.NO.195’-AAC CTT GGA ACC TGG ACC GGG CGGAATTGCCAGGACGACCGGG-3’，SEQ.ID.NO.205’-CCC GGT CCA GGT TCC AAG GTT accactatggctctcc-3’，SEQ.ID.NO.215’AGG GAG acc acc aaa tgc ccc tat-3’，SEQ.ID.NO.225’AGG GAG ttc tgc gac gcg gcg a-3’，SEQ.ID.NO.235’-TACGACGACGACGACGACGACGAGA gaactccc tcgcctcgc-3’，SEQ.ID.NO.245’-TCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTA tctaacaacagtagtttc-3’，SEQ.ID.NO.25gaca tcaagcagcc atgcaaatgt taattaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatagagtgcatcca gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatagSEQ.ID.NO.26C GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAGGACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCCGCGAGACTGC TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACTSEQ.ID.NO.275′FAM-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’，SEQ.ID.NO.28
5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’，SEQ.ID.NO.295’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttcg-3’，SEQ.ID.NO.305’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’。
權利要求
1.一種同步擴增檢測肝炎及艾滋病毒核酸的方法，其特征在于包括基于雜交原理，選用磁珠作為自動化介質，采用磁珠分離儀進行特異性同步捕獲HIV、HBV和HCV病毒核酸的方法，其中，選用與后續(xù)擴增檢測中一條引物序列相一致的生物素修飾的寡核苷酸作為核酸提取試劑的捕獲探針；或者，設計一段中間探針，與后續(xù)的熒光PCR體系中的一條引物序列相一致的無修飾的寡核苷酸，在其3’端連接一串Oligo(dA)18-25，作為中間雜交的主干探針，使用生物素修飾的Oligo(dT)25作為通用雜交捕獲探針；或者，合成一條包含上述HBV、HCV、HIV特異探針序列的線形排列的寡核苷酸，作為一條三聯(lián)共同探針，其中間間隔連接3-8個T或A，生物素的修飾仍位于共同探針的5’端。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于還包括RNA外標和RNA內對照的快速加端PCR構建和純化方法，其中，用于構建RNA內對照或RNA外標的引物，其5’加端并修飾生物素，其中一條引物5’加端為附加有T7 RNA聚合酶的轉錄啟動子識別位點序列，當PCR/PT-PCR獲得含有靶序列的DNA后，將鏈親和素包裹的磁珠直接加入，結合帶有生物素的PCR產(chǎn)物，棄去液體，用PCR緩沖液洗滌2次后，加入轉錄緩沖液及T7 RNA聚合酶，在37℃反應50-60分鐘，然后用PCR緩沖液稀釋所得的轉錄出的RNA及原先的DNA模板復合物，熱變性后于冰上驟冷，DNA模板上帶有的生物素標記被牢固結合于鏈親和素包裹的磁珠，而轉錄出的RNA不帶有生物素標記而不能結合于磁珠，且由于變性使其與DNA模板完全分開，離心取上清或用磁鐵分離磁珠，剩下純凈的RNA制品，進一步用乙醇沉淀濃縮純化。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于還包括試劑盒的RNA外標和RNA內對照的基因工程構建法或PCR構建法；其中，RNA外標制備是將含有擴增靶序列的核酸片斷經(jīng)酶切得到線性化DNA，再經(jīng)體外轉錄成RNA，并用DNA酶消化后經(jīng)純化得到RNA制品，這里的核酸片段，對于HBV為含有HBV C區(qū)的質粒，對于HCV為含有HCV 5’NCR區(qū)的質粒，對于HIV為含有HIV GAG區(qū)的質粒；上述的HBV、HCV和HIV的陰性對照單獨使用或者混合使用，或者使用基因工程方法將上述3個核酸片段組裝到一個載體中再線性化，體外轉錄使用其DNA或RNA，或者2者混合使用；RNA內標采用陽性對照模板的定點突變構建，或使用嵌段PCR方法構建；并根據(jù)檢測病毒的核酸類型構建成相應的DNA或RNA，單獨使用或混合使用，或通過基因工程方法或加端PCR方法將3個內對照片段組裝到一個片段中。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的方法，其特征在于還包括實時同步多項檢測的基于TaqMan探的RT-PCR擴增法，其中使用單管的一步法RT-PCR雙酶體系試劑，多項檢測的項目含有DNA和RNA，所選用的抗污染體系的為經(jīng)典的UNG-dUTP系統(tǒng)；這里的雙酶體系為含有逆轉酷和耐熱DNA聚合酶。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述構建RNA外標和RNA內對照的引物如下(1)HIV的陽性對照引物為SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.11，內對照引物為SEQ.ID.NO.12和SEQ.ID.NO.13；(2)HCV的陽性對照引物為SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18，內對照引物為SEQ.ID.NO.19和SEQ.ID.NO.20；(3)HBV的陽性對照引物為SEQ.ID.NO.21和SEQ.ID.NO.22，內對照引物為SEQ.ID.NO.23和SEQ.ID.NO.24。
6.一種檢測艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎核酸的試劑盒，其特征在于包含去抑制劑、裂解液、磁珠懸液、洗滌液、洗脫液、內對照、RT-PCR反應液、酶混合物、熒光探針、陽性對照、陰性對照，其中，所述的去抑制劑為含蛋白酶的醇溶液；所述裂解液為裂解血清、血漿標本中病毒顆粒的硫氰酸胍溶液；所述洗滌液為含氯化鈉的溶液；所述洗脫液為低鹽緩沖液或水；所述磁珠懸液含鏈親和素包裹磁珠；所述RT-PCR反應液含HBV、HCV、HIV引物和dNTP及緩沖鹽溶液；所述熒光探針為Taqman探針；所述酶混合物為多酶組份體系；所述陽性對照為含有HBV、HCV、HIV擴增目的基因外側的一段DNA或RNA；所述陰性對照為正常獻血員的血漿；所述內對照為競爭性內標RNA，包含有檢測項目相同的引物結合區(qū)，但與檢測項目的探針結合區(qū)不同，不能結合檢測探針卻能結合內標探針；其中PT-PCR反應液中HBV引物為5’-acc acc aaa tgc ccc tat-3’，5’-ttc tgc gac gcg gcg a-3’，HBV的Taqman探針為5′FAM-cga cga ggc agg acc cct aga aga a-NFQ3′，HCV引物為5’-cgg gag agc cat agt gg-3’，5’-agt acc aca agg cct ttc g-3’，HCV的Taqman探針為5′FAM-ctg cgg aac cgg tga gta cac-NFQ3′，HIV引物為5′-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’，5′-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’，HIV的Taqman探針為5′FAM-cca tca atg agg aag ctg cag aat ggg ata-NFQ3’，內標探針為SEQ.ID.NO.14。
7.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于使用與后續(xù)PCR檢測引物一致的生物素化寡核苷酸序列作為探針以雜交原理去同步提取純化血清或血漿標本中的HBV DNA、HCVRNA、HIV RNA的磁珠法標本處理試劑。
8.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于使用逆轉錄酶、耐熱DNA聚合酶雙酶單管一步法RT-PCR的TaqMan多項同檢體系，檢測項目包含DNA及RNA病毒；含有UNG-dUTP防污染組分；還含有內對照作為每個測試的全程監(jiān)測質控。
9.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于使用生物素修飾的加端引物快速構建、純化內對照RNA、陽性對照RNA純RNA。
10.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所說的裂解液中含有標本提取所用的生物素探針對于HBV為5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’，對于HCV為5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttc g-3’，對于HIV為5’BIOTIN-cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc-3’。
11.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所說裂解液中含有標本提取所用的中間探針5’-acc acc aaa tgc ccc tat ttt ttt agt acc aca agg cct ttc g aaaaaa cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc tc aaa aaa aaa aaa aaa aaaaaa aaa-3′(SEQ.ID.NO.15)和5’Biotin-Oligo(dT)25(SEQ.ID.NO.16)。
12.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于裂解液的組成為4-6M硫氰酸胍，20-50mM Tris，PH6.0-8.0，1-20％NP-40，1-20％Triton X-100，0.1-10％SDS，0.01-1μM生物素化探針，1-10％聚合物；其中捕獲探針為5’BIOTIN-acc acc aaa tgc ccc tat-3’對HBV，5’BIOTIN-agt acc aca agg cct ttcg-3’(對HCV)，5’BIOTIN-cta tgt cacttc ccc ttg gtt ctc tc-3’(對HIV)，純度為PAGE或HPLC；所述磁珠懸液為含有TWEEN20的超順磁材料的磁珠，表面包有均勻一層鏈親和素，直徑為0.1-10μM，含有BSA、NaN3成分，所述去抑制劑為含有蛋白酶的醇溶液；所述洗脫液為低鹽緩沖液或水，洗脫液DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液，加有Tween 20分散劑和EDTA、NaN3和DTT。
13.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述RT-PCR反應液為buffer中含1.8Mm d NTPs，3.6mM DTT，3.5mM MgCl2，引物BF、BR、CF、CR、IF、IR各0.4μM。
14.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的酶混合液含有逆轉錄酶、DNA聚合酶、RNasin、熱不穩(wěn)定的UNG、RT-PCR促進劑和酶穩(wěn)定劑。
全文摘要
本發(fā)明屬診斷試劑核酸診斷技術領域，具體為一種同步提取并同步擴增均相檢測肝炎和艾滋病毒核酸的方法和試劑盒。該方法包括以磁珠作為自動化介質，特異性同步捕獲HBV、CHV、HIV核酸的方法。RNA外標和RNA內標快速加端生物素引物的PCR構建和純化，實時同步多項檢測的基于Tagman探針的T－PCR擴增法等。相應的試劑盒包括去抑制劑、裂解液、磁珠懸液、洗滌液、洗脫液、內對照、RT－PCR反應液、酶混合物、熒光探針、陽性對照、陰性對照。本發(fā)明的的特點是單管操作，封閉性檢測，自動化程度高，多種病毒核酸同步提取，同步實時檢測；靈敏度高，特異性好，精密度高；適用于大規(guī)模血液篩查和大容量的臨床檢測。
文檔編號C12Q1/70GK1940087SQ200610030229
公開日2007年4月4日 申請日期2006年8月18日 優(yōu)先權日2006年8月18日
發(fā)明者周科隆, 華錦彪, 王縵 申請人:上?？迫A生物工程股份有限公司