專(zhuān)利名稱(chēng)：一種通過(guò)xrcc1基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒的制作方法
—種通過(guò)XRCC1基因檢測(cè)肺痛易感性的試劑盒技聿領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢擁用的試劑盒，尤其是一神檢擁肺痛晷j^性的試擁盒，m^檢翻xit^交襟互補(bǔ)修復(fù)基因l (X-ray repair crote-<compleinentinggeneI, XRCC1)的單被苷餿多態(tài)性(SNP)位點(diǎn) 來(lái)瓖瀾個(gè)體對(duì)肺痛的易感性。背康技術(shù)原發(fā)性支氣管肺痛，,肺痛，為當(dāng)前世界各地最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是一種嚴(yán)重M人類(lèi)健康和生4r的疾病，腫痛細(xì)胞源于支氣蟹粘鵬或腺體，常有區(qū)域性淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移，早期常有刺 & 嗽、澳 中審血等呼吸道癥狀，病情進(jìn)展速度與細(xì)鬼的生物特性有關(guān)。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，世界各閨胂痛的發(fā)病率和病死率都有明顯塌高的趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組戟WHO)2Q00年報(bào) 告1997年全世界死于惡性腫痛的共706.5萬(wàn)人，占死亡人數(shù)的12.6%,其中肺癌占惡性腫痛死亡的19 %， ^Btt腫痛死因的第一位，我國(guó)1990 1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市人口的腫痛死亡中，肺癌由 原來(lái)的第4位上升為第1位，農(nóng)村上升最快的也是肺痛.云南銀礦的肺痛發(fā)病率在1954 1959年間為 28.02/10萬(wàn)，1960 1969年間為197.87/10萬(wàn)，1970~1979年間上升到219.10/10萬(wàn)，這在全世界也是罕見(jiàn) 的，.英理著名腫瘤學(xué)家ItPeto預(yù)言如果我國(guó)不及時(shí)控制吸煙和空氣污染，到2025年我頃每年腳痛將超 過(guò)柳萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)，病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未明確，一致認(rèn)為肺痛的發(fā)病與下列因素有關(guān)(D"gys (包括主動(dòng)吸 被動(dòng)吸知)②職業(yè)致痛因子，已被確認(rèn)的致人類(lèi)肺痛的職業(yè)因素包括石棉、無(wú)機(jī)9Nfc合物、二氣甲鵬、鉻及 其化合物、錁、氡、芥子氣、氣乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染)；④電離輻射⑤飲食與營(yíng)養(yǎng)，美國(guó)紐約和芝加哥開(kāi)展的簾膽性人群瑰條的結(jié)果說(shuō)明，食物中天然維生素A類(lèi)、e胡蘿卜素的攝入量與十幾年后痛癥的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，其中最夷出的是肺痛⑥其他，美國(guó)痛癥學(xué)會(huì)將結(jié)核列為肺痛的發(fā)病因素之一。有結(jié)核病者患肺癌的危險(xiǎn)性是 正常人群的10倍。其主要組織學(xué)類(lèi)型是腺痛.此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲霧)、機(jī)體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對(duì)肺痛的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺癌的發(fā)生與某些痛基因的活化及抑癌基因的失活密切相關(guān)。已經(jīng)證明的幾個(gè)痛基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C《B2、機(jī)制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 p16和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細(xì)敏肺痛中i&W過(guò)虔表達(dá)。 非小細(xì)胞肺痛中則?？梢?jiàn)ras族基因的過(guò)度表達(dá)。這些深入的研究將為基因預(yù)防和治療肺痛班供理論基礎(chǔ)。XRCC1位于第19號(hào)染色體1913.2-13.3位置，全長(zhǎng)32,3kb, mRNA全長(zhǎng)2087bp,共有17個(gè)外顯子， 編碼634個(gè)氨基酸的蛋白。XRCC1編碼的蛋白對(duì)因電離輻射和烷基化物引起的0NA單鏈斷裂能起到有效 的i^復(fù)作用。XRCCl編碼的蛋白與DNA連接,in、聚合酶P、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移籌交互作用，參與DNA 的鵬切除修復(fù)(Base Excision R印air， BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點(diǎn)的多態(tài)性， 與,發(fā)生有密切的關(guān)系。與XRCC1相關(guān)的痛癥主要有乳腺痛、頭頸部鱗狀細(xì)胞痛、食管痛、胄痛、 結(jié)鵬、胰腺癌、肺痛等。SNP(single nucleotide polymorphi柳〉，即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類(lèi)基于單械基變異引毎的DNA 多態(tài)牲，被逮傳學(xué)界稱(chēng)為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異弓l起的DNA序列多態(tài)性， 包^IMiyS轉(zhuǎn)換、頫換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中條為廣泛存在的一類(lèi)多態(tài)性標(biāo)記，占 大約90%,這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個(gè)體間表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病，特別是復(fù)雜疾病的易感 性、和對(duì)環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。w25487是位于第19號(hào)染色體XRCC1基因上的一個(gè)G/A多態(tài)，引起XRCC1基因 {9的蛋白第399 個(gè)M酸由A堪變?yōu)镚ln。 Aig399GIn位于第10號(hào)外顯子，XRCC1蛋白BCRTI區(qū)域.在世界人群中的該 多態(tài)的頻率分布，G占0.72， A占0,28左右。中國(guó)人群中的分布G為O.幼，A為0.32。分子生物，究表 明，XRCC1基因上第399號(hào)豕基酸A屯"Gln的替代加強(qiáng)XRCC1蛋白與DNA-致痛物加合物的結(jié)合能力， 從面彩響個(gè)體的腫痛易感性。通過(guò)大ft對(duì)于大規(guī)模人群的肺癌病例對(duì)照研究，XRCC1的399氨基酸突變 位點(diǎn)在傲單因素分析時(shí)與肺痛發(fā)生相關(guān)，但是分層分析后發(fā)現(xiàn)在大童吸煙的人群中，肺痛發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低， ra25487位點(diǎn)攜帶A型即為肺痛易感型..發(fā)明內(nèi)容基于XRCC1基因上的is25487號(hào)SNP位點(diǎn)可用來(lái)評(píng)估個(gè)體對(duì)肺痛的易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一 種植測(cè)胂痛易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)XRCC1基因SEQ ID NO: 1中第156位SNP的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、 T叫,、dNTP混合液、MgCl,溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，麟異性擴(kuò)增 出SEQ ID NO: 1中包含第156位SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)，設(shè)計(jì)這類(lèi)引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能壤 輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī) 的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對(duì)引物.本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對(duì)SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光 定懸PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這個(gè)SNP位點(diǎn)肺痛易感基因型的探針。設(shè)計(jì)這類(lèi)探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕 易完成的，優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫man探針。特異性熒光探針可用常規(guī) 的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這條探針，所有可用 f熒光定1: PCR檢測(cè)SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含董包括10 X熒光定楚PCR反應(yīng)緩沖液， O.lfil 25nM dNTP混合液， 0.6|il 25nM MgCl,溶液， 0.025(il (5units/|U) T叫咖A聚合酶， 幼HM特異性引物對(duì)(兩條)各0.225!11. 10nM特異性熒光探針0.25ji1, 去離子水5. 575|U。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20iC。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠(chǎng)商所建議的條件，實(shí)簾例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步 1: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組咖A。 步，2:熒光定1;PCR反應(yīng)使用可檢擁肺癌易感性的熒光定JtPCR檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探針 有義引物5， - TAACTGGCATCTTCACTTCT -3'(SEQ ID NO: 2)加值為56卩 反義引物5' - TCCAGATTCCTGGCATTGC -3' (SEQ ID NO: 3) Tn值為581C 熒光探針5' - CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3' (SEQ ID NO: 4) Tta值為641C熒光定i PCR反應(yīng)體系為總體積10 il，包含濃度為20ng/jil的DNA模板2ji1、 10 X熒光定量PCR 反應(yīng)級(jí)沖液、0. 25aM cfl4TP泡合液、0.6^1 25nM l^Cl, JfiFfK、 0. 025fil (5units/(il) T叫IMA'聚合,、 20HM的有義引物和反義引物各0.225ni、 10|Ui的熒光探針0.25jU，去離子水5* 575jil。在ABI9700型PCR擴(kuò)増儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為501C、 2分鐘，訴1C、 10分鐘，進(jìn)行抑個(gè)循環(huán)的 訴1C、 30秒，601C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在旭I7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。 步驟3: SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對(duì)照相對(duì)比，熒光探針^的熒光倌號(hào)明顯離于正 常對(duì)照，說(shuō)明被檢測(cè)DNA的XRCC1基因上ra25487號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有A型，為肺痛易鵬，實(shí)旌例2.指導(dǎo)人們主動(dòng)，腫痛的服務(wù)目前在上海主鏈生物工程有限公司已經(jīng)開(kāi)展了這項(xiàng)服務(wù)。 步，l: DNA提取對(duì)被檢9H者進(jìn)行股務(wù)前咨詢(xún)，由被檢測(cè)者簽署知情同意書(shū)，填寫(xiě)生活飲食習(xí)憤問(wèn)巻調(diào)査表，依照取樣盒中的指示使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅am附法進(jìn)行口腔上飾通的咖A抽提.步驟2:基因分型檢新使用本發(fā)明提供的試劑盒,對(duì)被檢測(cè)者DNA的XRCC1基因上的rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR 檢翻，確定該SNP位點(diǎn)的基因型。步驟3:指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺痛通過(guò)對(duì)被檢潿者SNP基因型的分析，出具基因分型檢測(cè)報(bào)吿和被檢測(cè)者個(gè)體化ttiK掛導(dǎo)報(bào)吿，基因檢 淵挺吿詳細(xì)說(shuō)明了被檢淵者肺癌易感程度的布低以及患病的概率大小。個(gè)體化tt康賴(lài)導(dǎo)報(bào)告以lfett翻者的 基困分型檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問(wèn)巻調(diào)査結(jié)果，評(píng)估被檢測(cè)者M(jìn)i痛逮傳易感的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)， 同時(shí)制定出針對(duì)于被檢淵者的個(gè)性化健康行動(dòng)方案，方案包括在飲食習(xí)慣、生活方式上的改進(jìn)建議等，并 為被檢測(cè)者普及預(yù)防肺癌的健康知識(shí)。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<1加> 一種通過(guò)XRCC1基因檢測(cè)肺痛易感性的試劑盒〈160> 4<210> <211> <212> <213>1300 咖A 人屬,<柳> 1agatcacaccccccaagtacggactgtcacctgctccttagc卿cggag人種(Homo sapiens, human)taactggcat cttcacttct gccccccacc agctgtgcct ttgcc幼cac 60agccaggtcc t鄉(xiāng)cctggg aggccgcatc gtgcgta鄉(xiāng)agtgggtgct 120cgcatgcgtc ggcggctgcc ctcccggagg taaggcctca cacgccaacc 180tcctgtgctg ggcaatgcca gg幼tctgga ggggagtcag actggggcct 240幼cacaggtg gtcccagccc agagccagca gactactgag鄉(xiāng)agcgggg 300<210> <211> <212> <213>2加 DNA人工序列<220><223>引物 <柳> 2taact鵬at cttcacttct 20<210> <211> <212> <213>319DNA人工序列<220> <223>引物<柳> 3tocagattcc tggcattgc 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列<2加><223>探針 <柳> 4cggctgccct cccag鄉(xiāng) 18
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)XRCC1基因SEQ ID NO1中第156位SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)SEQIDNO: 1中第156 位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，麟異性擴(kuò)増出包含SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對(duì)SEQ IDNO, 1中第 156位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定愛(ài)PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出該SNP位點(diǎn)肺痛易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQIDNO: 2和3所 示序列的引物對(duì)，
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的特異性熒光探針選自.具有SEQ IDN(h 4所示 序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括IOX熒光定量FCR反 應(yīng)緩沖液，0. l(il 25nM dNTP泡合液，0.6fil 25oM MgCl,溶液，0.025ril (5units/ il) T叫DNA豳合糖， 20一特異性引物對(duì)(兩條〉各0.225(il， 10jiM特異性熒光探針0.25ji1,去離子水5.575jxl。本試劑盒供 —人份檢擁應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-201C.
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)XRCC1基因SEQ ID NO1中第156位SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)分析個(gè)體的XRCC1基因上SNP位點(diǎn)基因攜帶型來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)肺癌的易感性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101130811SQ20061003038
公開(kāi)日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司