專利名稱：諾瓦克病毒和輪狀病毒多重rt－pcr檢測方法及試劑盒的制作方法
專利說明諾瓦克病毒和輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法及試劑盒 本發(fā)明涉及一種同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒的多重RT-PCR檢測方法和試劑盒，可應用于醫(yī)學、檢驗檢疫、質(zhì)量監(jiān)督等部門，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。諾瓦克病毒(norovirus)和輪狀病毒(rotavirus)是世界范圍內(nèi)病毒性胃腸炎的重要病因，近年來的研究表明，胃腸炎病毒可直接通過人接觸傳播或間接地通過被污染的水、食物等傳播，因此世界衛(wèi)生組織又將其命名為食源性胃腸炎病毒。食源性胃腸炎病毒的感染劑量非常低，10-100個病毒粒子即可引發(fā)感染。在離體條件下存活力很強，對各種理化因子有較強抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反復凍融、超聲波處理都不能使其失活。且這類病毒的序列變異較大，有多種血清型存在。根據(jù)VP7抗原特異性可將輪狀病毒分為14個G型，根據(jù)VP4抗原特異性又可分為18個P型，G型和P型組合后代表某一輪狀病毒的血清型；諾瓦克病毒已知有15個基因型，且這個數(shù)目還會不斷的增加。而在世界不同地區(qū)，不同的時間，食源性胃腸炎病毒的流行株存在很大的差異，胃腸炎病毒的感染常伴有混合感染的趨勢，而現(xiàn)今的檢測方法靈敏度不夠高，因此對于疾病的診斷和治療帶來了很大的困難。近年來，食源性胃腸炎病毒的流行在世界范圍內(nèi)有不斷上升的趨勢，且流行范圍廣，傳染性強，二次攻擊率高，常造成急性嚴重的嘔吐和腹瀉，雖然不同病毒感染的癥狀輕重不一，但一般患者都具有低燒、嘔吐、腹瀉、頭痛等嚴重的脫水樣胃腸炎的癥狀。人群對這幾種病毒普遍易感，兒童和老人最為嚴重，為胃腸炎病毒的危險人群。胃腸炎病毒的流行有一定的季節(jié)性，但全年均可發(fā)生，可呈暴發(fā)流行，也可呈散發(fā)流行，因此致使對其不能進行及時有效的防護。
腹瀉病毒歷來是威脅人類健康特別是嬰幼兒健康的重大傳染病，目前對食源性胃腸炎病毒的治療尚未有特效藥物。無論在發(fā)達國家或是發(fā)展中國家，由輪狀病毒引起的腹瀉均有較高的發(fā)病率，是嬰幼兒發(fā)病和致死的最主要病因，在我國，情況更加嚴重，由A型輪狀病毒引起的嬰幼兒腹瀉和由B型輪狀病毒引起的成人腹瀉都非常流行。據(jù)WHO1997年統(tǒng)計，全世界每年有14億輪狀病毒感染者，在發(fā)展中國家有87萬人因此而死亡。在美國，96％的嚴重非細菌性胃腸炎由NLV引起，其中24％為食源性的；1996年4月到1997年3月，我國北京的首都兒科研究所，利用桿狀病毒表達的諾瓦克類病毒衣殼蛋白作抗原，對各年齡組的人群諾瓦克類病毒的IgG抗體進行了檢測，發(fā)現(xiàn)人群中IgG抗體陽性高達89％，其中嬰兒陽性率很高，為99％，這一調(diào)查結(jié)果反映了諾瓦克類病毒的感染在人群十分普遍。
輪狀病毒、諾瓦克病毒是世界范圍內(nèi)通過食物傳播的重要食源性病毒。由于在患者或無癥狀的攜帶者的糞便中病毒被大量排放，常導致胃腸炎疾病的暴發(fā)流行。這些病毒既可通過糞口途徑傳播，又可通過食源性或水體途徑傳播。食品(尤其是貝類)和水體性的感染可導致地域性大范圍、大量人口的感染，因此對食品和水中病毒的檢測顯得尤為重要。迄今為止，由于高特異性和靈敏性，RT-PCR是檢測食源性病毒最為高效的方法。但是常規(guī)的PCR都是單一地擴增，即每個反應只能擴增一個模板，在實際應用中很難處理高通量的樣品，而且費時耗力、成本較大。為了克服這些缺點，提高PCR檢測法的能力，Chamberlain等人在1988年首次建立了多重PCR技術(shù)(m-PCR)。m-PCR是指在同一個反應體系中，加入多對特異性引物，如果存在與各引物對特異性互補的模板，即可同時在同一反應管中擴增出一條以上的目的DNA片段，實現(xiàn)了一次性檢測多個模板的目的。多重PCR已成功應用于細菌、病毒的檢測。但尚未見有從環(huán)境樣本如水、食品等樣品中直接進行食源性諾瓦克病毒和輪狀病毒多重PCR檢測研究的報告。
隨著環(huán)境的惡化，近年來，各種新型病毒相繼不斷出現(xiàn)和肆虐，SARS和禽流感的暴發(fā)流行，給人類的生活和健康帶來了極大的危害，也給國民經(jīng)濟和社會發(fā)展帶來極大的負面影響。因此，在現(xiàn)有檢測方法基礎(chǔ)上，發(fā)展快速有效的胃腸炎病毒診斷和檢測方法及研制相關(guān)試劑盒投入實際應用，對保障食品安全提高公共衛(wèi)生水平，未雨綢繆保障人類健康具有重大意義。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的不足之處，提供一種用于同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒的特異性強、靈敏度高的多重RT-PCR檢測方法，并在此基礎(chǔ)上研制出同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒，適用于處理大通量的樣品，可以推廣應用到環(huán)境檢測、食品衛(wèi)生領(lǐng)域、商品檢驗檢疫等領(lǐng)域。
本發(fā)明以輪狀病毒VP7基因的高保守區(qū)段設(shè)計各血清型通用的引物，堿基序列分別為上游引物5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；下游引物5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；以諾瓦克病毒RNA多聚酶高保守區(qū)為靶序列設(shè)計諾瓦克病毒GI、GII型的通用引物，堿基序列分別為上游引物5’-GAT TAC TCC AAG TGG GAC TCC AC-3’；下游引物5’-GAC AAT GTA ATC ATC ACC ATA-3’本發(fā)明的目的具體可按如下方案來實現(xiàn)1.提取病毒核酸(1)取一定量的樣品，加900ul Trizol試劑，用移液器反復混勻幾次后靜置5min；(2)加入200ul氯仿，用力振搖15S，再靜置2～3min；(3)4℃，12000g，離心15min，棄去上層液體；(4)加入500ul異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；(5)4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；(6)加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；(7)4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；(8)充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無RNA酶的水中。
2.PCR擴增將反轉(zhuǎn)錄和擴增反應的所需試劑一次性加入反應管內(nèi)，兩次反應在一個反應管內(nèi)完成，整個實驗過程無須開蓋。
多重PCR反應體系10×PCR緩沖液2.5μL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV 1uL、2mmol/LdNTP 2.5uL、0.3-0.5μmol/L輪狀病毒引物各1μL、0.3-0.5μmol/L諾瓦克病毒引物各1μL、1.5U TaqE 1.5uL、25mmol/L MgCl22.5uL、模板2.5μL，加DEPC水至25μL。
擴增條件采用降落PCR進行擴增，條件為變性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃-50℃ 1min，72℃ 40S，退火溫度每降低1℃2個循環(huán)，10個循環(huán)后退火溫度降至為50℃進行20個循環(huán)，共30個循環(huán)后，72℃延伸10min。
3.電泳、PCR產(chǎn)物序列測定取擴增產(chǎn)物5ul，制備1.4％的瓊脂糖凝膠直接進行電泳，以Gold view染料替代0.5μg/mLEB，凝膠成像分析系統(tǒng)UV I觀察結(jié)果。
4.結(jié)果分析4.1多重RT-PCR特異性諾瓦克病毒和輪狀病毒在多重擴增中均得到了清晰特異的預期擴增條帶，與100bp標準分子量對照，輪狀病毒的預期條帶為392bp，諾瓦克病毒的預期條帶為319bp。以混合模板單引物、單模板混合引物、混合模板混合引物三種反應模式驗證了本發(fā)明所涉及引物的特異性，三種模式的擴增均有特異的預期帶，而引物之間及引物與模板之間沒有交叉反應發(fā)生，每一個RT-PCR反應都產(chǎn)生了清晰的大小為318bp和392bp的條帶。陰性對照無擴增條帶出現(xiàn)，見附

圖1。
4.2多重RT-PCR靈敏度將經(jīng)10倍梯度系列稀釋的病毒核酸進行多重RT-PCR擴增，輪狀病毒可檢測到的最高靈敏度為50pg，諾瓦克病毒可檢測到的最高靈敏度為100pg，見附圖2。
本發(fā)明的同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒多重RT-PCR檢測試劑盒由以下試劑構(gòu)成輪狀病毒上游引物、輪狀病毒下游引物、諾瓦克病毒上游引物、諾瓦克病毒下游引物、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶、20U Rnasin、1.5U TaqE、2mmol/L dNTP、25mmol/L MgCl2、10×緩沖液、DEPC水組成。一次檢測所用的組分量為輪狀病毒上游引物1uL；輪狀病毒下游引物1uL；諾瓦克病毒上游引物1uL；諾瓦克病毒下游引物1uL；MLV反轉(zhuǎn)錄酶1uL；Rnasin 0.5uL；TaqE 1.5uL；2mmol/L dNTP 2.5uL；25mmol/L MgCl22.5uL；10×緩沖液2.5uL；DEPC水補足剩余體積至25uL。圖1多重RT-PCR特異性分析。M100bpDNA分子標準；N陰性對照；1-2諾瓦克病毒(319bp)；3-4輪狀病毒(392bp)；5諾瓦克病毒和輪狀病毒。
圖2多重RT-PCR靈敏度分析。M100bpDNA分子標準；N陰性對照；1-6諾瓦克病毒(319bp)和輪狀病毒(392bp)的多重PCR靈敏度檢測，所對應的核酸量依次為10ng，5ng，1ng，100pg，50pg，10pg。
圖3多重RT-PCR檢測貝類樣本結(jié)果。M100bpDNA分子標準；N陰性對照；1-5在貝類樣本中100pg的諾瓦克病毒(319bp)和輪狀病毒(392bp)核酸的多重擴增檢測結(jié)果。實施例1多重RT-PCR檢測方法用于同時檢測貝類樣品中輪狀病毒和諾瓦克病毒(1)病毒的生物富集從本地的水產(chǎn)市場購買貝類，將其放養(yǎng)于一個盛有海水的容器中，然后投放諾瓦克病毒和輪狀病毒樣本于容器中，模擬自然水體的環(huán)境，使貝類自然富集。同時，以同樣的條件(不投毒)設(shè)立陰性對照。每隔8h換水及重新投毒一次，整個生物富集時間為24h。
(2)貝類中病毒的活化和濃縮將上面經(jīng)過生物富集的貝類，五只貝為一個樣，剝殼，取其胃和消化道1.5g，然后轉(zhuǎn)入50ml的Falcon管中，加入15ml冷的經(jīng)滅菌的0.05mol/L甘氨酸～0.14mol/L氯化鈉(pH7.5)，然后用Waring blender在冰上高速勻漿。為了防止交叉污染，應用70％的酒精對Waring blender消毒，并在每個樣品勻漿后用Bursen beuner加熱1min。具體的過程如下(a)4℃，5000g，離心20min，收集上清，4℃存放；(b)把沉淀重新懸浮于15ml，pH7.5的0.5mol/L的蘇氨酸-0.14mol/L的氯化鈉中，渦旋60s；(c)4℃，5000g，離心20in。將兩次上清液混合，置于另一Falcon管中，棄去沉淀；(d)向上清液中加入15mlPEG6000(120g/L，即PEG6000，0.3mol/L的氯化鈉)，在4℃下放置2h；(e)8000g，4℃，離心30min，棄上清。將沉淀重新懸浮于15ml的PBS中(pH7.5)，再加入15ml的氯仿，渦旋60s；(f)4℃，2000g離心30min，取上清；(g)再加7.5ml 120g/L的PEG，4℃下放置兩小時；(h)4℃，14000g，離心15min，取上清；(i)PEG沉淀小球再用1ml，6mol/L的異硫氰酸胍溶液再懸浮，室溫放置10min；(j)4℃，12000g離心10min，取上清，用于RNA抽提。
(3)RNA抽提用美國生命技術(shù)公司生產(chǎn)的Trizol試劑盒，抽提貝類濃縮物中的病毒RNA。取200～300ul樣品，加900ul Trizol試劑，用移液器反復混合均勻，離心15min，棄去上層液體后加入500ul異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無RNA酶的水中。在分光光度計上測定所提取的RNA濃度和純度。
(4)多重RT-PCR檢測多重PCR反應體系10×PCR緩沖液2.5uL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶1uL、2mmol/L dNTP 2.5uL、0.3-0.5μmol/L輪狀病毒上下游引物各1uL、0.3-0.5μmol/L諾瓦克病毒上下游引物各1uL、1.5U TaqE1.5uL、25mmol/L MgCL22.5uL、模板2.5μL，加DEPC水至25μL。
擴增條件采用降落PCR進行擴增，條件為變性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃ 1min，72℃ 40S，退火溫度每降低1℃2個循環(huán)，10個循環(huán)后退火溫度降至為50℃進行20個循環(huán)，共30個循環(huán)后，72℃延伸10min。
(5)電泳、PCR產(chǎn)物序列測定取擴增產(chǎn)物5ul，制備1.4％的瓊脂糖凝膠直接進行電泳，以Gold view染料替代0.5μg/mLEB，凝膠成像分析系統(tǒng)UV I觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物測序由上海博亞生物公司完成。
(6)貝類中諾瓦克病毒和輪狀病毒多重RT-PCR檢測結(jié)果與100bp標準分子量對照，輪狀病毒的擴增條帶為392bp，諾瓦克病毒的擴增條帶為319bp。電泳結(jié)果如圖3，在1.5g貝類組織中，諾瓦克病毒和輪狀病毒檢測的核酸最高靈敏度均達到了100pg。
實施例2一種同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒多重RT-PCR試劑盒該試劑盒由以下試劑組成輪狀病毒上游引物50uL、輪狀病毒下游引物50uL、諾瓦克病毒上游引物50uL、諾瓦克病毒下游引物50uL、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶45uL、20U Rnasin 25uL、1.5U TaqE 60uL、2mmol/L dNTP 150uL、25mmol/L MgCl2150uL、10×緩沖液2mL、DEPC水2mL。
權(quán)利要求
1.一種同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒的檢測方法，主要包括以下步驟(1)提取病毒核酸a.取一定量的樣品，加900uL Trizol試劑，用移液器反復混勻幾次后靜置5min；b.加入200ul氯仿，用力振搖15S，再靜置2～3min；c.4℃，12000g，離心15min，棄去上層液體；d.加入500uL異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；e.4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；f.加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；g.4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；h.充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無RNA酶的水中。(2)PCR擴增多重PCR反應體系為10×PCR緩沖液2.5μL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV 1μL，2mmol/L dNTP 2.5μL，0.3-0.5μmol/L輪狀病毒上游引物和下游引物各1μL，0.3-0.5μmol/L諾瓦克病毒上游引物和下游引物各1μL，1.5U TaqE1.5μL，25mmol/L MgCL22.5μL，模板2.5μL，加DEPC水至25μL。將反轉(zhuǎn)錄和擴增反應的所需試劑一次性加入反應管內(nèi)，兩次反應在一個反應管內(nèi)完成，整個實驗過程無須開蓋。擴增條件采用降落PCR進行擴增，條件為變性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃-50℃ 1min，72℃ 40S，退火溫度每降低1℃2個循環(huán)，10個循環(huán)后退火溫度降至為50℃進行20個循環(huán)，共30個循環(huán)后，72℃延伸10min。(3)電泳、PCR產(chǎn)物序列測定取擴增產(chǎn)物5ul，制備1.4％的瓊脂糖凝膠直接進行電泳，以Gold view染料替代0.5μg/mL EB，凝膠成像分析系統(tǒng)UV I觀察結(jié)果。(4)結(jié)果分析如果出現(xiàn)392bp擴增條帶，證明該樣品存在輪狀病毒；如果出現(xiàn)319bp擴增條帶，則證明該樣品存在諾瓦克病毒。
2.權(quán)利要求1所述的同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒的檢測方法，其特征在于所述的輪狀病毒上游引物、輪狀病毒下游引物、諾瓦克病毒上游引物、諾瓦克病毒下游引物分別為5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；5’-GAT TACTCC AAG TGG GAC TCC AC-3’；5’-GAC AAT GTA ATC ATC ACC ATA-3’。
3.一種權(quán)利要求1所述的同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成0.3～0.5μmol/L輪狀病毒上游引物、0.3～0.5μmol/L輪狀病毒下游引物、0.3～0.5μmol/L諾瓦克病毒上游引物、0.3～0.5μmol/L諾瓦克病毒下游引物、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶、20U Rnasin、1.5U TaqE、引物、2mmol/L dNTP、25mmol/L MgCl2、10×緩沖液、DEPC水組成。
4.權(quán)利要求3所述的同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒的檢測試劑盒由以下試劑組成輪狀病毒上游引物50uL、輪狀病毒下游引物50uL、諾瓦克病毒上游引物50uL、諾瓦克病毒下游引物50uL、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶45uL、20U Rnasin 25uL、1.5U TaqE 60uL、2mmol/LdNTP 150uL、25mmol/L MgCl2150uL、10×緩沖液2mL、DEPC水2mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒的多重RT－PCR檢測方法和試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過提取樣品病毒核酸，經(jīng)PCR擴增、電泳及PCR產(chǎn)物序列測定，結(jié)果如出現(xiàn)392bp擴增條帶，證明該樣品存在輪狀病毒；如果出現(xiàn)318bp擴增條帶，則證明該樣品存在諾瓦克病毒。本發(fā)明還相應地建立了檢測試劑盒，可特異性強、靈敏、高效地同時檢測諾瓦克病毒和輪狀病毒，適用于處理大通量的樣品，可以推廣應用到環(huán)境檢測、食品衛(wèi)生領(lǐng)域、商品檢驗檢疫等領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1876839SQ200610032890
公開日2006年12月13日 申請日期2006年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月17日
發(fā)明者吳清平, 寇曉霞, 張菊梅, 郭偉鵬 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司