專利名稱：：檢測高危型人乳頭瘤病毒的方法及試劑盒的制作方法檢測高危型人乳頭癍病毒的方法及試劑盒所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中人乳頭瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測臨床樣品中高危型人乳頭瘤病毒，以為診斷宮頸癌、尖銳濕疣提供實驗室依據(jù)的臨床檢測方法及完成該方法所使用的試劑盒。發(fā)明背景宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年，隨著生活方式的改變，宮頸癌患者的發(fā)病年齡更趨年輕化，并且病例數(shù)有不斷上升的趨勢。宮頸癌是目前唯一一種發(fā)病原因比較清楚的的腫瘤，主要病因是由高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)或反復(fù)感染所致[Walb(還ers肌JacobsMV,ManosMM,eta丄H麗npapillomavirusisanecessarycauseofinvasivecervicalcancerworldwide.JPathol,1999:189(1):50-53]。目前確定的HPV型別約有80個，依其感染的上皮所在部位分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，其中約35個型別涉及生殖道感染。依據(jù)不同型別HPV與宮頸癌發(fā)生危險性的高低，又分為低危險型HPV和高危型HPV，約20個型別與腫瘤相關(guān)。在世界范圍內(nèi)，宮頸癌主要危害那些未進行高危型人乳頭瘤病毒篩查的婦女。研究表明，HPV16、18型與宮頸癌高度相關(guān)，31、33和35型中度相關(guān)。HPV型別分布有地域差別，在中國人群中，HPV16、52、58型相對多見。HPV的陰性預(yù)測價值達100%，即無HPV感染時可基本排除宮頸癌的發(fā)生。宮頸癌早期手術(shù)治療效果極佳，以預(yù)防為主的策略作為降低宮頸癌死亡率的主要途徑是簡單而有效的[NobbenhuisMAE，WalboomersJ固，HelmerhorstTJM，etal.Relationofhumanpapi1lomavirusstatus1.0cervicallesionsandconsequencesforcervical-cancerscreening:aprospectivestudy.Lancet，1999:354:20-25]。如果能早期檢查出并成功地治療(特別是癌前千預(yù)性治療)發(fā)生在宮頸組織的癌前病變(可以潛伏多年)，就可有效地阻斷癌前病變向?qū)m頸癌的發(fā)展。人乳頭瘤病毒感染病例的診斷主要依靠實驗室檢查。實驗室檢查包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測(測序、原位雜交、雜交捕獲、PCR等)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測方法靈敏度與特異性均較低，受操作者的主觀影響比較大；測序、原位雜交技術(shù)復(fù)雜，對操作者的要求較高，在臨床應(yīng)用中受到限制；雜交捕獲方法已被美國FDA批準(zhǔn)并已應(yīng)用于臨床，但該方法成本高、操作復(fù)雜、存在假陽性，因此也限制了其在宮頸癌普查中的大規(guī)模應(yīng)用；定性PCR方法雖然靈敏度高并能對病毒進行早期檢測，但是因其步驟繁瑣且容易造成污染，從而也限制了它的臨床使用。實時熒光定量PCR技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來的。與傳統(tǒng)的(終點檢測)PCR技術(shù)相比，實時定量檢測方法不僅實現(xiàn)了低拷貝數(shù)靶多核苷酸的定量分析，而且還具有特異性和精確度更強、自動化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點。實時熒光PCR技術(shù)是在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系中加入熒光標(biāo)記探針，使用一種帶有電荷偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR擴增儀，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán)的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴增曲線。通過對擴增曲線以及循環(huán)閾值(Ct)的分析，能夠?qū)Ρ粰z樣品進行定性和定量分析。TaqManPCR技術(shù)是實時熒光PCR的一種(MackayIMa/.Real-timePCRinvirology..NucleicAcidsRes.20025;30(6):1292-1305;Lie,Y.S.,Petropoulos,C丄，AdvancesinquantitativePCRtechnology:5'nucleaseassays.CurrentOpinioninBiotechnology1998.9,4348.)。與傳統(tǒng)的PCR相對比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時，熒光報告基團發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。如果擴增過程中有耙序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報告基團發(fā)出熒光信號。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現(xiàn)線性增強。在使用已知的實時熒光定量PCR技術(shù)檢測和定量分析臨床樣品中某特定耙核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結(jié)果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準(zhǔn)確性，一個關(guān)鍵性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計并制備適當(dāng)?shù)囊锖凸押塑账崽结?。本發(fā)明人在以往多年從事PCR技術(shù)特別是實時熒光定量PCR技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，將該技術(shù)應(yīng)用于人乳頭瘤病毒的所有已知變異體之基因組多核苷酸的檢測和定量分析，成功地完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種使用實時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測樣品中HR-HPV病毒的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴增體系和熒光監(jiān)測體系在內(nèi)的反應(yīng)與檢測混合物，(2)通過擴增反應(yīng)循環(huán)擴增所說的耙多聚核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多聚核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團所產(chǎn)生的熒光量，并結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定靶多聚核苷酸的存在及其相對量(即靶核酸序列的拷貝數(shù))；其中核酸擴增系統(tǒng)包括可與靶聚多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光實時監(jiān)測系統(tǒng)包括一個可與靶多聚核苷酸特異性結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatcc-3，(SEQIDNO:1)、5，-gacaaaaacggaaatccagt-3，(SEQIDN0:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3，(SEQIDN0:3)和5，-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4),并且所使用的寡核苷酸探針是5，-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3,(SEQIDNO-5)禾口5，-accacgtecttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的樣品是可疑高危型HPV感染者的臨床樣品。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的高危型HPV選自中國人群中常見的、與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)系的各型HPV。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的高危型HPV選自HPV16、18、31、33、35、39、45、52、58、59、67型。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的靶多聚核苷酸來自高危型HPV。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的核酸擴增系統(tǒng)是聚合酶鏈反應(yīng)，并且所說的擴增反應(yīng)循環(huán)是大約重復(fù)40次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的核酸擴增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b)2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，和(d)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的熒光實時檢測體系包括能夠與耙多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的方法進一步包括(1)確定樣品中的靶多聚核苷酸經(jīng)擴增后所產(chǎn)生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將己確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量耙多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以計算出樣品中耙多聚核苷酸的量。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用實時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測臨床樣品中HPV的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、PCR擴增反應(yīng)液、稀釋液、陰性對照樣品、強陽性標(biāo)準(zhǔn)品和加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中濃縮液由PEG8000組成；DNA提取液由異硫氰酸胍、氫氧化鈉、SDS組成的溶液。PCR反應(yīng)管內(nèi)為PCR體系，由引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、H20和緩沖液組成；稀釋液為TE溶液。本發(fā)明的試劑盒中使用帶有目的基因片段的重組質(zhì)粒作為強陽性標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為lXl()S拷貝/ml，使用帶有目的基因片段的重組質(zhì)粒作為臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為lXl()S拷貝/ml，并使用生理鹽水作為陰性對照。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中用于耙多聚核苷酸擴增體系的正向和反向引物分別是5，一Ugatgaaaatggcaatcc一3'(SEQIDNO:1)、5'一gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)和5，-catcgtUtccttgtcctc-3，(SEQIDNO:4)。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中用于靶多聚核苷酸擴增和監(jiān)測體系的寡核苷酸探針是5'_accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)禾口5，-accacgtccttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。本發(fā)明涉及實時定量熒光PCR方法及試劑盒，特別是涉及實時定性定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法及其試劑盒在中國人群中常見的高危型HPV感染的實驗室診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種使用實時熒光定量PCR技術(shù)定性定量檢測臨床樣品中高危型HPV存在的方法，該方法包括(1)提供包括HPV基因組核酸的樣品、核酸擴增體系，和熒光監(jiān)測體系的反應(yīng)與檢測混合物，(2)通過擴增反應(yīng)循環(huán)擴增所說的靶多聚核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團與被擴增的耙多聚核苷酸間接結(jié)合，(4)4)確定熒光發(fā)生基團所產(chǎn)生的熒光量，并結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定耙多聚核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴增體系包括可與靶多聚核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光檢測體系包括可與靶多聚核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所說的擴增反應(yīng)中所使用的正向和反問寡核苷酸引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatec-3'(SEQIDNO:1)、5'-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5'-categgtgtctgcatcl,tc-3'(SEQIDNO:3)禾口5'-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4)，并且所使用的寡核苷酸探針是5'-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)和5，-accacgtccttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。與基于擴增反應(yīng)完成后進行單一終點檢測的傳統(tǒng)PCR方法不同，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)方法可以在擴增反應(yīng)的進程中隨時監(jiān)測擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而大大提高了定量檢測的準(zhǔn)確性和精密度。眾所周知，實時熒光定量PCR是在PCR擴增中同時加入引物和5'、3'末端分別標(biāo)記有熒光報告基團(例如6-FAMamidite羧基熒光素6)和熒光淬滅基團(例如6-羧基四甲基若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補結(jié)合，其序列保持完整，報告基團發(fā)射的熒光信號將被淬滅基團吸收，所以沒有熒光信號產(chǎn)生；而當(dāng)PCR擴增反應(yīng)進行時，DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將降解熒光探針，導(dǎo)致熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，因而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收并記錄到熒光信號。每擴增一條DNA鏈即有一個熒光分子產(chǎn)生，從而實現(xiàn)熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，實時地監(jiān)測整個PCR反應(yīng)進程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知靶多聚核苷酸(模板)進行定量分析。與通常的實時定量熒光PCR技術(shù)相似，本發(fā)明的檢測樣品中HPV病毒基因組雙鏈靶多聚核苷酸存在的方法中同樣包括U)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(c)2-脫氧核苷三磷酸(dNTP)的擴增反應(yīng)體系，以及包括(a)能夠與待檢雙鏈靶多聚核苷酸的第一條互補鏈結(jié)合的正向引物，(b)能夠與待檢雙鏈靶多聚核苷酸的第二條互補鏈結(jié)合的反向引物，以及(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的任一條鏈結(jié)合并且兩末端分別標(biāo)記有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針的熒光檢測體系；(2)通過一次或多次聚合酶鏈反應(yīng)擴增所說的靶多聚核苷酸；(3)退火后使所說的熒光發(fā)生基團通過探針與靶多聚核苷酸的結(jié)合并在Taq酶的外切活性作用下釋放熒光發(fā)生基團而產(chǎn)生熒光信號；(4)檢測并確定熒光發(fā)生基團所產(chǎn)生的熒光量；(5)分析一次或多次擴增循環(huán)所發(fā)出的熒光量，以檢測靶多聚聚核苷酸的存在；特征在于其中所說的靶多聚核苷酸是HPV基因組多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別5，-Ugatgaaaatggcaatec-3，(SEQIDNO:1)、5'-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5'-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)禾口5，-catcgttttccttgtcctc-3，(SEQIDNO:4)，并且所使用的寡核苷酸探針是5'-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'(SEQIDNO:5)和5'-accacgtecttgagaaaaaggatt-3'(SEQIDNO:6)。如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的高危型HPV病毒，并能夠準(zhǔn)確有效地將高危型HPV病毒感染與低危型HPV病毒、單純皰疹病毒2型、生殖支原體、巨細(xì)胞病毒、解脲脲原體、沙眼衣原體、淋病雙球菌及其他常見泌尿生殖道感染病原體鑒別開來，設(shè)計并制備實現(xiàn)這些目的的寡核苷酸引物和探針是一個非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。為此，我們在使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖σ阎狧PV病毒型的基因組核苷酸序列進行同源性比較，并在找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計軟件(例如PrimerPremier5.5)選擇并設(shè)計具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物1:5，-ttgatgaaaatggee.atec-3,(SEQIDNO:1)，引物2:5，-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDN0:2)，弓l物3:5'-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)禾U弓I物4:5'-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4);以及具有下示序列的寡核苷酸探針5'-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)和5'-accacgtecUgagaaaaaggatt-3'(SEQIDNO:6)。引物所對應(yīng)的擴增區(qū)段相當(dāng)于HPV病毒E1基因編碼序列的保守區(qū)，長度為107bp-120bp。所設(shè)計的這些引物和探針均具有互補于高危型HPV病毒基因組保守區(qū)的序列，而且與其他泌尿生殖道感染相關(guān)病原體的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內(nèi)切酶，所以大大減少甚至避免了HPV病毒檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準(zhǔn)確度?？墒褂肈NA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化并進行氨解處理。同樣合成所需的檢測探針，氨解處理后分別在其5，端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(報道基團)的6-FAMamidite，并在其3'端標(biāo)記帶有活性連接臂的、作為熒光淬滅或抑制基團的TAMRA。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，可使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。使用常規(guī)DNA提取方法或市售的DNA提取試劑盒，從得自受試者的宮頸脫落細(xì)胞樣品中提取DNA用于后繼的PCR擴增。在含有引物l、2、3和4(各10pmo1)、探針5和6(各3pmo1)、DNA模板(PCR擴增靶序列)、dNTPs(IOmM)、耐熱DNA聚合酶(PlantiniumDNA聚合酶)、PCR緩沖液和水的反應(yīng)體系中，使用ABI7000型或其他結(jié)構(gòu)類型的自動熒光檢測熱循環(huán)儀對如上得到的DNA序列進行PCR擴增。所使用的反應(yīng)條件是93'C預(yù)變性3分鐘后，93°C30秒，55°C45秒，共進行40次循環(huán)。反應(yīng)完成后，借助裝置上配有的自動分析系統(tǒng)進行結(jié)果分析。在本研究中，如果循環(huán)閾(Ct)值等于或大于25,結(jié)果即為陰性；如果Ct值小于25，結(jié)果則為陽性。其中以反應(yīng)的前10個循環(huán)所產(chǎn)生的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置為卜10個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般說來，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因為在擴增反應(yīng)的Ct值之前的階段，擴增系統(tǒng)中的酶、引物、探針和dNTPs均大大過量，而且系統(tǒng)的pH值和離子濃度等也相對穩(wěn)定，所以此時擴增反應(yīng)的效率是一個與模板數(shù)無關(guān)的飽和定值。與Ct值相關(guān)的只有起始模板數(shù)(多聚核苷酸樣品的拷貝數(shù))和與樣品無關(guān)的PCR系統(tǒng)效率?？衫靡阎鹗伎截悢?shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以耙多聚核苷酸起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，并以如上測得的Ct值為縱坐標(biāo)。獲得未知量靶多聚核苷酸的Ct值后，即可從基于平行實驗得到的數(shù)據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知其起始拷貝數(shù)的對數(shù)，然后計算出該靶多聚核苷酸的起始拷貝數(shù)(當(dāng)擴增循環(huán)達到Ct值即初始進入指數(shù)擴增期時，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一靶多聚核苷酸在不同時間擴增或同一時間在不同管內(nèi)擴增所得到的Ct值總是恒定的)。也就是說，為了基于上述的擴增反應(yīng)結(jié)果推算出靶多聚核苷酸的量(起始拷貝數(shù))，本發(fā)明的方法還應(yīng)進一步包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴增后所產(chǎn)生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，從而計算出樣品中靶多聚核苷酸的量。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用實時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測臨床樣品中高危型HPV病毒的試劑盒，該試劑盒包括(l)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、含有本領(lǐng)域已知的常規(guī)成分的PCR擴增反應(yīng)液、稀釋液、陰性對照樣品、強陽性標(biāo)準(zhǔn)品和DNA陽性對照品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中濃縮液用于濃縮液態(tài)待檢樣品。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中稀釋液用于稀釋陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中用于靶多核苷酸擴增體系的正向和逆向引物引物分別5'—Ugatgaaaatggcaatcc-3'(SEQIDNO:1)、5'—gficaaaaacggaaatccagt-3，(SEQIDNO:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)和5'—catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4)。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中用于靶多聚核苷酸擴增和監(jiān)測體系的寡核苷酸是5，-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'(SEQIDNO:5)禾口5，-accacgtecttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)?？砂凑杖缟纤龅牟襟E或試劑盒中所附使用說明書中指出的方法使用本發(fā)明的試劑盒。如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的高危型HPV病毒，并準(zhǔn)確有效地將高危型HPV病毒感染與低危型HPV病毒、單純皰疹病毒2型、生殖支原體、巨細(xì)胞病毒、解脲脲原體、沙眼衣原體、淋病雙球菌及其他常見泌尿生殖道感染病原體鑒別開來，本發(fā)明基于對不同型別HPV和相關(guān)病毒基因組核苷酸序列的同源性比較，特別設(shè)計了適用本發(fā)明試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實時定量檢測，大大減小了高危型HPV病毒多核苷酸檢測的假陽性和假陰性。我們的實驗證明，本發(fā)明檢測高危型HPV病毒基因組核苷酸的精確度幾乎為100c/。，靈敏度達到102個拷貝。值得特別說明的是，為了確保本發(fā)明的高危型HPV病毒檢測方法的準(zhǔn)確性，我們還使用攜帶有HPV病毒核苷酸序列的重組質(zhì)粒作為DNA定量檢測標(biāo)準(zhǔn)品。借助這些標(biāo)準(zhǔn)品并使用本發(fā)明的試劑盒，在相同條件下進行平行檢測并制作所謂的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以進一步驗證本發(fā)明試劑盒的檢測精確度和準(zhǔn)確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒的附加的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。圖l顯示(Stdcurve)窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。針對模板數(shù)為102107拷貝的反應(yīng)體系進行T叫ManPCR分析。當(dāng)拷貝數(shù)為100時，被檢樣品的Ct值在25左右，即檢測下限靈敏度可到達100拷貝。圖2顯示強中弱三份陽性標(biāo)本的檢測曲線。三份標(biāo)本的Ct值分別是25.95、21.45和13.47;結(jié)合擴增曲線呈S形，即可判定三份樣品均為陽性。圖3顯示陰性標(biāo)本的檢測曲線。三個標(biāo)本的擴增曲線為較平直的折線，與熒光檢測閾值線沒有交點，或者顯示Ct值在2530之間的范圍內(nèi)，并且擴增曲線不具有S形特征。圖4顯示HPV16、18、31、33、52、58型等標(biāo)本的檢測曲線，標(biāo)本均經(jīng)反向斑點雜交和測序確認(rèn)為相應(yīng)型別。擴增曲線呈S形，可判定被檢樣品均為陽性。圖5顯示陽性標(biāo)本重復(fù)性實驗的檢測曲線，可看出不同的曲線均在同一CT值范圍內(nèi)，此結(jié)果表明試劑盒具有良好的重復(fù)性。具體實施方式實施例l:高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑盒及其使用(1)制備包括下列組成成分的試劑盒DNA提取液(500pl/管)l管、PCR反應(yīng)管(未貼標(biāo)簽管)IO管、H20(2000pl/管)l管、強陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)l管、臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50ulZ管)l管、陰性對照(50pl/管)l管。(2)標(biāo)本采集、運送和保存以無菌棉拭子或?qū)m頸刷取疑似人乳頭瘤病毒感染患者的宮頸脫落細(xì)胞，以及用于活檢的組織標(biāo)本或疣組織，置于低溫冰箱(一70'C或一20°C)內(nèi)冷凍保存。如集中檢驗，標(biāo)本需在(TC以下環(huán)境中運送并于24小時內(nèi)送達實驗室。(3)檢測步驟和結(jié)果分析-宮頸刷、宮頸拭子加入lml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子。吸取全部液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，12，000離心5分鐘。去上清，沉淀直接加入50n1DNA提取液充分混勻(由于提取液內(nèi)含有不溶于水的物質(zhì)，故取樣時需先用加樣器充分混勻；如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪掉一截)。10(TC加熱處理10分鐘(誤差不超過1分鐘)后，12,000rpm離心5分鐘，取上清液2y1用于PCR反應(yīng)。組織活檢、切片標(biāo)本用適量滅菌生理鹽水洗去送檢組織沾帶的血液，取約50mg組織，加1ml滅菌生理鹽水用勻漿器研磨成組織勻漿并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中.12，000rpm離心5分鐘后，去上清，向沉淀物中加入50ulDNA提取液充分混勻，IO(TC恒溫處理10分鐘(誤差不超過1分鐘)。12,OOOrpm離心5分鐘后，收集上清液2ii1用于PCR反應(yīng)。將強陽性標(biāo)準(zhǔn)品6000rpm離心15秒，加入稀釋液450ul，充分混勻后標(biāo)示為105。然后另取3支新的0.5ml離心管，對標(biāo)準(zhǔn)品依次進行10倍梯度稀釋(分別標(biāo)示為104、103、]02)，-2(TC保存?zhèn)溆?。然后分別取待檢樣品(每份2ul)、同體積的定量標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照品，加樣于PCR反應(yīng)體系中進行PCR擴增。PCR循環(huán)條件是93。C預(yù)變性3分鐘，93°C45秒，55'C60秒，進行10次循環(huán)，此!O個循環(huán)內(nèi)不檢測熒光信號；93°C30秒，55。C45秒，進行30次循環(huán)，在反應(yīng)的延伸階段檢測熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。調(diào)節(jié)分析參數(shù)，使標(biāo)準(zhǔn)曲線(Stdcurve)窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達到最佳(即相關(guān)性數(shù)值<-0.95)(參見圖l)。由圖2和圖3可分別看出，陽性標(biāo)本的熒光曲線與設(shè)定的閾值線有一交點，而陰性標(biāo)本的熒光曲線則低于閾值。最后由儀器自動分析裝置計算出未知標(biāo)本的測定數(shù)值(Qty)，即標(biāo)本中HPV病毒的DNA含量(參見圖2和3)。實施例2:對確定HPV型別的標(biāo)本進行檢測具體步驟同實施例l，不同的是所用標(biāo)本均經(jīng)反向斑點雜交和測序確認(rèn)為HPV16、18、31、33、52、5趣，HPV16、18、31、33、52、58型是中國人群感染最多的型別。標(biāo)本提取核酸后用本發(fā)明的試劑盒進行PCR擴增，在擴增的同時由儀器自動監(jiān)測并收集熒光信號的變化。反應(yīng)結(jié)束后分析，應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒均能檢測出已知型別的標(biāo)本(參見圖4)。實施例3:臨床標(biāo)本檢測的重復(fù)性測試具體步驟同實施例l，不同的是所用標(biāo)本為確定陽性的標(biāo)本。提取核酸后用本發(fā)明的試劑盒進行PCR擴增，每一份標(biāo)本設(shè)置多個復(fù)管。在擴增的同時由儀器自動監(jiān)測并收集熒光信號的變化。反應(yīng)結(jié)束后分析，應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測結(jié)果顯示同一標(biāo)本不同的曲線均在同一CT值范圍內(nèi)，此結(jié)果表明試劑盒具有良好的重復(fù)性。(參見圖5)。實施例4:20份臨床標(biāo)本檢測并與其他藥盒的比較20例臨床標(biāo)本取自廣東省人民醫(yī)院，具體步驟同實施例l，不同的是所用標(biāo)本同時用西班牙BIOTOOLS國Labs,S.A.公司BIOPAPQTS試劑盒檢測，該試劑盒已經(jīng)通過歐盟CE認(rèn)證，能夠檢測常見的高危型人乳頭瘤病毒。BIOPAPQTS試劑盒使用熒光染料的方法對臨床標(biāo)本進行實時定量檢測。通過比較本發(fā)明中所說的試劑盒與BIOPAPQTS試劑盒在臨床標(biāo)本檢測所得的結(jié)果，來鑒定本發(fā)明所說試劑盒在臨床檢測中的有效性。表1:本發(fā)明中的試劑盒與BI0PAPQTS試劑盒檢測結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>上表中'一'表示試劑盒檢測均為陰性，CT值表示標(biāo)本中的靶多核苷酸經(jīng)擴增后所產(chǎn)生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)次數(shù)。如上表，兩種方法得到的結(jié)果進行對比，顯示了良好的一致性，說明了本發(fā)明試劑盒的高可信性。由于本發(fā)明使用熒光探針，較染料法有更高的特異性；本發(fā)明的試劑盒較目前市場上使用的美國Digene公司雜交捕獲(hybridcapureII，HCII)方法在對儀器和操作人員的要求方面更易應(yīng)用，檢測的靈敏度也高于雜交捕獲方法。序列表<U0>中山大學(xué)安達基因股份有限公司<120>檢測高危型乳頭瘤病毒的方法及試劑盒<140><141><160>6<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。<400>1ttgatgaaaatggcaatcc<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。<400>2geicaaaaacggsaatccagt<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。<400>3catcggtgtctgcatcttc<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。<400>4catcgttttccttgtcctc<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增過程中檢測熒光信號增長的探針。<400>5accatgtcctttcaaaaaaacatttc<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增過程中檢測熒光信號增長的探針。<400>6accacgtccttgagaaaaaggatt權(quán)利要求1一種使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測樣品中常見高危型HPV病毒存在的方法，該方法包括(1)提供包括HPV病毒基因組核酸的樣品、核酸擴增體系，和熒光監(jiān)測體系的反應(yīng)與檢測混合物，(2)通過擴增反應(yīng)循環(huán)擴增所說的靶多聚核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多聚核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團所產(chǎn)生的熒光量，并結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定靶多聚核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴增體系包括可與靶多聚核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光檢測體系包括可與靶多聚核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所說的擴增反應(yīng)中所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5’-ttgatgaaaatggcaatcc-3’(SEQIDNO1)、5’-gacaaaaacggaaatccagt-3’(SEQIDNO2)、5’-catcggtgtctgcatcttc-3’(SEQIDNO3)和5’-catcgttttccttgtcctc-3’(SEQIDNO4)，并且所使用的寡核苷酸探針是5’-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3’(SEQIDNO5)和5’-accacgtccttgagaaaaaggatt-3’(SEQIDNO6)。2、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的核酸擴增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b)2，-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，和(d)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物。3、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熒光檢測體系包括能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針。4、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所說的方法進一步包括(1)確定樣品中的靶多聚核苷酸經(jīng)擴增后所產(chǎn)生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量耙多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以計算出樣品中靶多聚核苷酸的量。5、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的高危型HPV病毒是中國人群中常見的宮頸癌相關(guān)人乳頭瘤病毒。6、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說的高危型人乳頭瘤病毒選自16、18、31、33、35、39、45、52、58、59和67型人乳頭瘤病毒。7、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說的靶多聚核苷酸來自中國人群中常見的高危型人乳頭瘤病毒。8、使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測臨床樣品中高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、擴增反應(yīng)液、稀釋液、陰性對照樣品、強陽性標(biāo)準(zhǔn)品和加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，特征在于其中用于靶多聚核苷酸擴增體系的正向和反向引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatcc-3，,5，_gacaaaaacggaaatccagt-3，，5'-catcggtgtctgcatcttc-3'，5'-catcgtUtccttgtcctc-3;其中用于耙多聚核苷酸擴增和監(jiān)測體系的寡核苷酸是5'-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'禾口5'-accacgtecttgagaaaaagga1t_3'。全文摘要本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中宮頸癌、尖銳濕疣的病原體—高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)診斷HR-HPV感染的方法及所使用的試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101130824SQ200610037188公開日2008年2月27日申請日期2006年8月25日優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日發(fā)明者何蘊韶,王偉毅,王方金,鋼程申請人:中山大學(xué)達安基因股份有限公司