專利名稱：卵泡刺激素受體特異結合區(qū)域多肽、表達載體及其制備方法和在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及卵泡刺激素受體特異結合區(qū)域多肽、表達載體及其制備方法和在制備雄性避孕藥中的應用。
背景技術：
根據聯(lián)合國的統(tǒng)計資料，1998年，全球約有7850萬婦女服用口服避孕藥(OC)。目前全球的OC使用人數可能已近億人。OC應用率因國家、地域不同而有很大的差異。其中以西歐最為普及，在該地區(qū)，一半左右的已婚女性都為OC使用者，而中國、印度和日本女性的OC應用率最低，如我國女性服用避孕藥的比例才3％左右。當然原因是多方面的，如沒有合適的避孕藥、認識缺乏、使用成本高、部分婦女存在副作用，而絕育手術和放置宮內節(jié)育器由于可靠性較高且費用低往往成為貧困地區(qū)和農村地區(qū)婦女的主要避孕措施。
我國每年約有1000萬例次人工流產，其中50％左右是由于沒有采用避孕措施，或者能夠察覺到的避孕失誤。
女性口服避孕藥是人工合成的甾體類激素，主要是雌激素和孕激素。女用口服避孕藥主要是通過抑制排卵、改變宮頸粘液的稠度、阻止精子穿過、影響精子的獲能、改變輸卵管的正常蠕動、使子宮內膜出現非典型分泌相不利于孕卵著床等方式達到避孕目的。
我國口服避孕藥市場只是初具規(guī)模，隨著人們對避孕藥了解的加深，必將有更多的人選擇這種避孕方式。據預測，我國口服避孕藥的市場容量約為3億～5億元，市場潛力巨大。
男性避孕的方法主要是使用安全套和輸精管結扎，但是安全套的使用會導致快感下降，部分男性不喜歡，輸精管結扎手術也很少有男性愿意采用。男性避孕藥的研究在幾十年里并沒有重大的突破性進展，目前尚無理想的男性避孕藥面世。
生精過程是由雄激素和FSH(Follicle stimulating hormone，卵泡刺激素)共同作用的結果，其作用機制到目前為止還不清楚，且在哺乳動物中隨種屬不同而變化。雄性激素在成年動物中是維持正常生理功能所必不可少的，如肌肉、成骨、神經等細胞的正常生理功能，同時也是維持性功能細胞的正常生理學功能。
目前男性避孕藥研究多數集中在激素類男性避孕藥領域，如睪酮類避孕藥物、雄-孕激素配伍、雄激素與雌激素配伍、雄激素與促性腺激素釋放激素(GnRH)類似物配伍，對睪酮類避孕藥臨床研究最多的為庚酸睪酮(TE)，它是一種激素酯，能抑制腦垂體，促進性腺激素釋放，從而使睪丸間質細胞分泌的內源性睪酮下降，最終達到阻斷精子發(fā)生的目的。絕大多數受試者在被注射了庚酸睪酮后，其精液檢查出現了無精或嚴重少精，而性能力并沒有受到太大影響。停藥后，所有受試者的正常生精能力都得到了恢復，不會影響性生活。但是，庚酸睪酮可引起睪丸體積縮小、痤瘡、性欲亢進、體重增加以及血紅蛋白增加等負反應。此外因其半衰期短，需要每周肌肉注射，令人難于忍受，而且肌注后峰谷波動明顯。戌酸睪酮在70年代即被用來治療性腺功能低下，由于其半衰期長，可每6個月注射一次。且可制成口服劑，易被人接受，早期研究表明它對性功能無影響。
另外，格拉斯哥的斯特拉斯克萊德大學在研制一種每年只需注射一次的避孕疫苗，以控制精子成長，使精子不能發(fā)展至可令女性受孕的成熟階段。而英國葛蘭素威康生物醫(yī)學研究所試圖通過化學方法，令負責把精子噴進精液的肌肉無法活動。澳洲悉尼康科德醫(yī)院專家也加入研制男性避孕藥的行列，其研制的注射式藥物，理論上只需每三周注射一次，便能有效減少男性精子的數量，達到避孕效果。還有另一種利用化學膠水堵塞輸精管的男性避孕法，預料10年內可面世。它比輸精管結扎手術更具優(yōu)勢的地方是膠水可由化學物質溶解，隨時恢復生殖功能。
隨著基因工程研究的深入，越來越多的科學家對運用基因工程研制避孕藥表現出濃厚的興趣。我國科學家從大鼠附睪頭部上皮細胞中成功地克隆到一個特異表達的新基因，并觀察到這個基因所編碼的多肽具有抗菌功能，并可能與生育有關。這一天然抗菌肽新基因有望發(fā)展成為特異的治療男性附睪炎的新型藥物，以減少男性不孕癥的發(fā)生，也可能成為一種用于男性的新型避孕藥物。
目前尚未有采用針對FSHR(Follicle stimulating hormone Receptor卵泡刺激素受體)的多肽疫苗制備的男性避孕藥問世。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對上述技術問題提供一種能夠抑制精子生成且對雄激素無影響的安全性好的卵泡刺激素受體特異結合區(qū)域多肽。
本發(fā)明另一個目的是提供含有上述多肽或該多肽表達載體的藥物組合物。
本發(fā)明還有一個目的是提供上述多肽或其表達載體的制備方法。
本發(fā)明再有一個目的是提供上述多肽或其表達載體在制藥中的應用。
本發(fā)明技術方案的理論基礎FSH可以特異性地與睪丸間充質細胞的受體結合，應用分子克隆技術可將FSH受體特異結合區(qū)域的多肽(以下簡稱FSH受體多肽或FSHR多肽)進行克隆，在體外表達并作為抗原，通過其機體的免疫系統(tǒng)產生抗FSH受體多肽的抗體，從而阻斷性腺細胞的生精功能。應用噬菌體表達FSH受體多肽，從而得到了重組FSH受體多肽。在人類群體中，FSH受體多肽通過其機體自身免疫系統(tǒng)合成的抗體具有多樣性和不同免疫耐受性，而影響性細胞FSH受體生精作用的多肽約為30個氨基酸，這些氨基酸可組成20多種不同的多肽，從而產生各自不同的避孕效果，通過篩選最佳的多肽組合，從而達到理想的避孕效果。
本發(fā)明制備FSH受體特異結合區(qū)域的多肽，作為自身免疫多肽疫苗，通過機體自身免疫應答產生FSH受體多肽的抗體，與睪丸間充質細胞的FSH受體特異性結合，從而競爭性阻斷FSH與FSH受體的結合，阻止FSH的生物學功能，以達到阻斷FSH的生理功能，起到僅抑制精子生成卻不影響雄激素的目的。
本發(fā)明的目的是通過下列具體的技術措施來實現的一種卵泡刺激素受體多肽，該多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所述。
所述多肽的表達載體，這些表達載體包括但不限于質粒、噬菌體、細菌、宿主細胞。
含有治療有效量的上述多肽或其表達載體和藥學上允許的輔料組成的藥物組合物。
編碼所述多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所述。
所述核苷酸序列的表達載體，這些表達載體包括但不限于質粒、噬菌體、細菌、宿主細胞。
含有治療有效量的上述核苷酸序列或其表達載體和藥學上允許的輔料組成的藥物組合物。
所述的藥物組合物，其制劑采用藥學上允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑、口服液或脂質體。
所述多肽的制備方法，包括以下步驟a.分別將編碼人FSHR三組多肽的基因SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5導入噬菌體；b.將導入基因的噬菌體轉染大腸桿菌，培養(yǎng)該轉染大腸桿菌使其大量繁殖；c.從大腸桿菌中提取擴增的噬菌體，再從噬菌體中分離表達的FSHR多肽，純化即可。
所述多肽的制備方法，其中噬菌體采用含有抗生素抗性基因的噬菌體；培養(yǎng)轉染大腸桿菌的方法是將轉染含抗性基因噬菌體的大腸桿菌在添加了噬菌體所抵抗的抗生素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
所述多肽的制備方法，其中FSHR多肽純化的方法是采用柱層析的方法。
上述多肽、其核苷酸序列或它們的表達載體在制備男性避孕藥中的應用。
本發(fā)明的有益效果實驗一、對雄性動物的雄激素分泌的影響。
方法和結果1、編碼FSHR多肽基因的表達分別將編碼人FSHR三組多肽的基因(SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5)經由f88-4噬菌體(如無特別說明，本發(fā)明實驗中采用的噬菌體均為f88-4噬菌體，該噬菌體含四環(huán)素抗性基因)轉入大腸桿菌MC1061，該大腸桿菌在含四環(huán)素的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后得到四環(huán)素抵抗的菌落。挑選出單個菌落在四環(huán)素存在的情況下在NZY培養(yǎng)基(含NZ胺、氯化鈉、酵母提取物)中培養(yǎng)過夜。借助大腸桿菌內環(huán)境，噬菌體表達FSHR的蛋白多肽，分別得到表達三種FSHR多肽(其氨基酸序列對應為SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6)的噬菌體(簡稱FSHR多肽疫苗)。
2、免疫接種表達上述FSHR多肽的三種噬菌體作為疫苗可以單獨使用，也可以混合使用，混合使用時由于增加了結合位點，從而使競爭性抑制FSH的作用更加明顯，尤其是表現在這三種噬菌體混合使用時，本實驗即采用含有表達上述FSHR多肽的三種噬菌體的混合物作為疫苗進行免疫接種。接種動物選擇成年雄性冠毛獼猴，在第一天皮下注射1mg含有表達上述FSHR多肽的三種噬菌體的混合物(在弗氏完全佐劑中，用量不包括佐劑)，在25天和60天時分別再加強注射0.5mg和0.1mg(用量不包括佐劑)。
3、血清睪酮含量的測定自首次接種之日起按圖1所示天數從接種動物的股靜脈取血，采用放射免疫法(測量方法為本領域普通技術人員公知的技術)測定血清睪酮含量，結果見圖1。
4、結果分析圖1所示成年雄性冠毛獼猴免疫接種FSHR多肽疫苗后血清雄激素的濃度沒有明顯改變，表明本發(fā)明疫苗對雄性動物的雄激素分泌沒有影響。
實驗二、對雄性動物生育能力影響。
方法和結果取成年雄性冠毛獼猴12只，隨機分為三組，每組4只，第一組僅接種空白噬菌體，第二組接種表達人FSHR多肽的噬菌體，觀察時間在首次接種后第90-225天，第三組接種表達人FSHR多肽的噬菌體，觀察時間在首次接種后第570-700天(處于恢復期)。按實驗一中步驟1、2所述方法制備FSHR多肽疫苗并接種成年雄性冠毛獼猴，各組每只雄性冠毛獼猴在母猴的四個月經周期內至少與三只母猴進行交配。通過超聲波來檢測妊娠與否，結果見表1。
同時對成年雄性冠毛獼猴免疫接種FSHR多肽疫苗后FSHR抗體滴度進行監(jiān)測，監(jiān)測方法自首次接種之日起按圖2所示天數從四只接種表達人FSHR多肽的噬菌體的成年雄性冠毛獼猴的股靜脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法(測量方法為本領域普通技術人員公知的技術)測定血清FSHR抗體滴度，結果見圖2。
表1成年雄性冠毛獼猴免疫接種FSHR多肽疫苗后對生育能力的影響(n＝4)

結果分析如表1所示，接種FSHR多肽疫苗后的成年雄性冠毛獼猴使雌性獼猴的懷孕能力明顯低于僅接種空白噬菌體組；在恢復期雄性冠毛獼猴又能使雌性獼猴懷孕，表明雄性冠毛獼猴的生育能力可以恢復。
如圖2所示，四只獼猴接種FSHR多肽疫苗后都產生相應抗體，盡管反應的強度是不同的，這足以證明FSHR多肽作為外來抗原確實引起了機體免疫應答的發(fā)生。
實驗三、對雄性動物精子生成的影響。
方法和結果1、編碼FSHR多肽基因的表達方法同實驗一步驟1。
2、免疫接種接種成年雄性冠毛獼猴，接種方法同實驗一步驟2。
3、精子分析在研究過程中，每十五天一次運用電子射精法搜集到精液樣本進行精子記數。所謂電子射精法是將電極一頭連在陰莖體的基底部，另一頭連在陰莖頭位置，脈沖式地予以20伏的電壓刺激。精液在37℃保存。將精液用生理鹽水以1∶200稀釋后用Neubauer計數器測定精子濃度，結果見圖3。
4、結果分析如圖3所示，成年雄性冠毛獼猴在注射疫苗之前，每次射精的精液中精子計數一般都在200～350·106的范圍內。精子計數在接種后30天開始下降，到60天時下降有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。到105天所有獼猴都出現精子缺乏，接種后150天到225天精子計數仍較低，在20～25·106的范圍內，表明本發(fā)明疫苗對精子的生成具有抑制作用。


圖1放射免疫法檢測成年雄性冠毛獼猴免疫接種FSHR多肽疫苗后血清雄激素的濃度。
圖2酶聯(lián)免疫吸附法檢測成年雄性冠毛獼猴免疫接種FSHR多肽疫苗后FSHR抗體滴度。
圖3成年雄性冠毛獼猴免疫接種FSHR多肽疫苗后精子計數。
圖4抗FSHR血清對結合狀態(tài)下的125I-FSH的影響。
其中W代表對照組，*P＜0.05，**P＜0.01。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，但不限制本發(fā)明。
一般性說明實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的《分子克隆實驗指南(第3版)》(Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd ed.黃培堂等譯，科學出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進行，其它沒有詳細描述的技術相應于本領域人員來說是熟知的標準方法。
本發(fā)明的材料本申請中提及的微生物、細胞系、質粒、噬菌體或其他表達載體以及培養(yǎng)基均有商品供應或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。
實施例11、表達FSH受體多肽的噬菌體的構建。
取編碼人FSHR三組多肽(SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6)的雙鏈寡核苷酸(分別對應為SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5)，分別將這三對寡核苷酸鏈接入PstI和HindIII限制性內切酶的酶切位點。用上述兩種限制性內切酶處理f88-4噬菌體，37℃30分鐘，分別加入上述三對寡核苷酸鏈，42℃2小時，使三對寡核苷酸鏈接入f88-4噬菌體，分別命名為PhA，PhB和PhC。
2、噬菌體轉染感受態(tài)大腸桿菌MC1061。
用MC1061大腸桿菌培養(yǎng)液中的MC1061大腸桿菌在基本培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，于37℃溫育24-36小時，制備成感受態(tài)大腸桿菌MC1061。分別取預冷至0度的滅菌5ml培養(yǎng)管，各加50μl感受態(tài)大腸桿菌MC1061(OD260為0.5～0.6)，并立即加入5μl連接反應液(0.05mol/L TrisCl，10mmol/L MgCl2，10mmol/L二硫蘇糖醇，50μg/ml牛血清白蛋白)，分別加入5pg噬菌體PhA，PhB和PhC，輕彈管外壁使其混勻，冰浴30分鐘。將培養(yǎng)管放入42℃水浴90秒，立即放回冰浴，2分鐘后加入175μl不含鎂的SOB培養(yǎng)液，輕輕振蕩混勻，噬菌體轉染感受態(tài)大腸桿菌MC1061完成。在含四環(huán)素的NZY培養(yǎng)基中分別將這些大腸桿菌大量繁殖后可得到大量噬菌體顆粒。
3、FSH受體多肽的收集及純化。
將所得的噬菌體顆粒加入磷酸鹽緩沖液，于15000rpm離心15分鐘，取沉淀物(噬菌體顆粒)分別提取三段FSH受體多肽(提取的方法是本領域普通技術人員公知的)后，經過下述步驟純化每段多肽提取物在0.5M乙醇胺、0.5M NaCl、pH8.3緩沖液的環(huán)境下流過葡聚糖柱Sephadex G-50，分子量大于30KD的多肽被排出葡聚糖柱，然后用由0.1M乙酸鈉、0.5M NaCl、pH4組成的緩沖液沖洗葡聚糖柱，這樣即可得到純化的FSH受體多肽A、B、C。將純化的FSH受體多肽保存在pH7.0的0.4％疊氮化鈉中。對所得到的三種FSH受體多肽進行測序分析，結果分別與SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6相符。
4、驗證純化后FSH受體多肽的可靠性。
用制得的三段FSH受體多肽(A、B、C)分別皮下注射免疫豬(免疫的方法是本領域普通技術人員公知的)，獲得三種抗FSHR血清。CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)隨機分為A、B、C、W(空白對照組)四組，培養(yǎng)環(huán)境中加入125I-FSH，A、B、C組分別加入不同滴度(1∶10000，1∶1000，1∶100，1∶10，1∶1，10∶1)的抗血清(分別為抗A、抗B、抗C)，空白對照組加入等體積的生理鹽水，測定結合狀態(tài)下的125I-FSH。結果見圖4。結果顯示，隨著各組加入的抗血清滴度不斷提高，結合狀態(tài)下的125I-FSH量在A和B組下降最明顯。
實施例2FSHR多肽的重組表達在知道了本發(fā)明公開的編碼特定FSHR多肽的核苷酸序列(SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.5)后，就可以采用該核苷酸與編碼其他蛋白(如宿主的蛋白或其片斷)的核苷酸鏈接在一起用來表達融合蛋白。用來表達蛋白的載體有很多，表達的方法也是本領域普通技術人員公知的方法，在此不一一敘述。
本發(fā)明公開的編碼特定FSHR多肽的DNA可被轉染真核細胞內，如人和其他哺乳動物的細胞。其轉染方法已成為標準方法，在此不再敘述。
實施例3藥物組合物的制備將治療有效量的本發(fā)明FSHR多肽(SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6)或其表達載體(包括但不限于質粒、噬菌體、大腸桿菌或哺乳動物的細胞，下同)，或者編碼該FSHR多肽的核苷酸(SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5)或者其表達載體單獨或者相互混合后與藥學上允許的輔料組成藥物組合物，該藥物組合物可單獨使用，亦可與其他不影響該藥物組合物功能的藥物混合使用。這些藥物組合物的制劑可以是藥學上允許的任意劑型，包括但不限于片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑、口服液或脂質體。這些制劑的制備方法是本領域普通技術人員公知的技術。這些藥物組合物可以用于男性避孕。
<110>南京醫(yī)科大學<120>卵泡刺激素受體特異結合區(qū)域多肽、表達載體及其制備方法和在制藥中的應用<160>6<210>1<211>30<212>DNA<213>編碼人FSHR多肽18-27位的核苷酸序列<400>
agc aag gtg aca gag att cct tct gac ctc 30Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu15 10<210>2<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>
Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu15 10<210>3<211>30<212>DNA<213>編碼人FSHR多肽25-34位的核苷酸序列<400>
tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa ctg 30Ser Asp Leu Pro Arg Asn Ala Ile Glu Leu
1 5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>
Ser Asp Leu Pro Arg Asn Ala Ile Glu Leu1 5 10<210>5<211>30<212>DNA<213>編碼人FSHR多肽29-38位的核苷酸序列<400>
agg aat gcc att gaa ctg agg ttt gtc ctc 30Arg Asn Ala Ile Glu Leu Arg Phe Val Leu1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>
Arg Asn Ala Ile Glu Leu Arg Phe Val Leu1 5 10
權利要求
1.一種卵泡刺激素受體特異結合區(qū)域多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列如SEQID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所述。
2.權利要求1所述多肽的表達載體。
3.根據權利要求2所述的表達載體，其特征在于這些表達載體是質粒、噬菌體、細菌、宿主細胞。
4.含有治療有效量的權利要求1所述多肽或其表達載體和藥學上允許的輔料組成的藥物組合物。
5.編碼權利要求1所述多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQID No.5所述。
6.含有權利要求5所述核苷酸序列的表達載體。
7.根據權利要求6所述的表達載體，其特征在于這些表達載體是質粒、噬菌體、細菌、宿主細胞。
8.含有治療有效量的權利要求5所述核苷酸序列或其表達載體和藥學上允許的輔料組成的藥物組合物。
9.根據權利要求4或8所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的制劑采用藥學上允許的任意一種劑型。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其劑型是片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑、口服液或脂質體。
11.權利要求1所述多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟a.分別將編碼人FSHR三組多肽的基因SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5導入噬菌體；b.將導入基因的噬菌體轉染大腸桿菌，培養(yǎng)該轉染大腸桿菌使其大量繁殖；c.從大腸桿菌中提取擴增的噬菌體，再從噬菌體中分離表達的FSHR多肽，純化即可。
12.根據權利要求11所述多肽的制備方法，其特征在于噬菌體采用含有抗生素抗性基因的噬菌體；培養(yǎng)轉染大腸桿菌的方法是將轉染含抗性基因噬菌體的大腸桿菌在添加了噬菌體所抵抗的抗生素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
13.根據權利要求11所述多肽的制備方法，其特征在于FSHR多肽純化的方法是采用柱層析的方法。
14.權利要求1所述多肽、其核苷酸序列或它們的表達載體在制備男性避孕藥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種卵泡刺激素受體特異結合區(qū)域多肽、表達載體及其制備方法和在制藥中的應用。該多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所述。該多肽能夠抑制精子生成且對雄激素無影響，安全性好，該多肽、編碼該多肽的核苷酸以及它們的表達載體可作為基因疫苗制備男性避孕藥。
文檔編號C12N15/63GK1803838SQ200610037929
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月23日 優(yōu)先權日2006年1月23日
發(fā)明者王心如, 德偉, 拉提法·阿波得尼比, 樂米·讓·雅克 申請人:南京醫(yī)科大學