專利名稱：雞胚原始生殖細胞的玻璃化冷凍方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對發(fā)育至第19期(孵化約3天)和第28期(孵化約5.5天)雞胚性腺原始生殖細胞進行玻璃化冷凍保存的方法。
背景技術(shù)：
玻璃化冷凍法是1985年由Rall和Fahy首先提出的一種超快速冷凍方法，玻璃化冷凍的基本原理是在細胞冷凍過程中添加高濃度的冷凍保護劑，固化脫水后直接投入液氮中，通過快速降溫，形成玻璃態(tài)，避免細胞內(nèi)外冰晶損傷，并以這種玻璃態(tài)在低溫下保存。盡管玻璃化冷凍保存在低溫保存技術(shù)和低溫生物學研究中起步較晚，但由于其良好的冷凍效果和潛在的發(fā)展前景而倍受關(guān)注，進展較快。至今，玻璃化冷凍保存已經(jīng)成功地應用于哺乳動物卵母細胞、淋巴細胞和胚胎，對皮膚、血管等組織也開展了玻璃化冷凍保存研究，人卵母細胞、人胚胎玻璃化冷凍保存也已經(jīng)獲得成功。然而，在禽類遺傳資源保存方面，關(guān)于玻璃化冷凍法的研究在國內(nèi)尚未有報道。禽類遺傳物質(zhì)傳統(tǒng)的保存形式主要有(1)活體保存，(2)精液冷凍保存，(3)DNA形式的保存(cDNA文庫、核苷酸序列數(shù)據(jù)庫等)，(4)胚胎的冷凍保存。其中，活體保存是遺傳物質(zhì)保存的最可靠方式，但受資金、地方性疾病、近交衰退等因素限制；精液冷凍保存，作為有效的種質(zhì)保存方式，僅是保存了成年公禽的基因組，而且復蘇后精液受精率較低(50％～70％)；以DNA形式保存的遺傳物質(zhì)，也只是特定基因或整個染色體組的一小部分；而禽類受精卵體積較大且含有大量卵黃，難以冷凍保存。
原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)，是成熟配子(精子、卵子)的前體細胞，在體內(nèi)或體外可誘導分化成有功能的配子，與精子、卵子相比，PGCs含有的遺傳信息更完整。在體外，PGCs細胞可以作為外源基因的載體，在性腺嵌合體的制備、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)、基因組印跡等研究中具有廣闊的應用前景。禽類原始生殖細胞遷移規(guī)律的深入研究，使得禽類PGCs的分離提取和體外操作成為可能。目前，慢速冷凍法保存雞胚PGCs細胞已經(jīng)獲得成功，但慢速冷凍法在操作過程中需長時間平衡和逐漸降溫，不便操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種操作簡單、快捷的雞胚PGCs細胞玻璃化冷凍保存方法。
本發(fā)明將雞胚原始生殖細胞(PGCs)加入玻璃化冷凍液后，移入冷凍管，于4℃±1℃下平衡5min±0.5min，液氮面上靜置1min±0.5min，最后，直接投入液氮。
本發(fā)明研究了玻璃化冷凍法的保存效應，建立了操作簡單、快捷的雞胚PGCs細胞玻璃化冷凍保存體系，為其它禽類PGCs細胞玻璃化冷凍體系的建立提供理論依據(jù)，進而為禽類遺傳資源多樣性的保存提供另一可靠途徑。同時，也可以為禽類PGCs細胞體外遺傳操作提供細胞來源。
上述玻璃化冷凍液優(yōu)選方案由5％～15％二甲基亞砜+5％～15％乙二醇+5％～15％聚乙烯吡咯烷酮+20％胎牛血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成。復蘇后活率可達到為84.15％。


圖1為復蘇后19期PGCs核型照片。
圖2為復蘇后28期PGCs核型照片。
圖3為復蘇后19期PGCs PAS染色照片。
圖4為復蘇后28期PGCs PAS染色照片。
圖5為復蘇后培養(yǎng)傳至第1代的19期PGCs形成的集落照片。
圖6為復蘇后培養(yǎng)傳至第1代的28期PGCs形成的集落照片。
具體實施例步驟1雞胚PGCs的分離、提取在PGCs的兩個聚集高峰期第19期(68-72h)、第28期(5.5d)分離PGCs。受精蛋孵化至第19期(孵化68～72h)，無菌采取雞胚，用無鈣鎂的胎牛血清(PBS)清洗3次，在解剖顯微鏡下去其頭尾，獲取性腺發(fā)生部位組織塊，PBS清洗3次，轉(zhuǎn)移入三角瓶中，Trypsin-EDTA細胞消化液室溫下消化3～4min，消化時用玻璃管輕輕吹打使其分散。以消化液用量的10％的FCS終止消化，100目網(wǎng)篩過濾，180g離心8min收集細胞。沉淀用0.1mL不含小牛血清的TCM-199培養(yǎng)液重新懸浮，移入含0.9mL濃度為16％Ficoll液的指形管(規(guī)格為2mL)中，混勻，形成濃度為14.4％的Ficoll與細胞混合液，再在其上緩緩加入0.2mL濃度為6.3％的Ficoll液，800g離心30min，PGCs聚集在14.4％與6.3％Ficoll層的交界處，吸取交界處富含PGCs的Ficoll液0.2mL到指形管中。加入1.5mL含10％小牛血清的TCM-199培養(yǎng)液，混勻，180g離心5min，重復此步驟2次。
步驟2玻璃化冷凍液的配制

DMSO即二甲基亞砜(Sigma)EG即乙二醇(Sigma)PVP即聚乙烯吡咯烷酮(Sigma)FBS即胎牛血清(杭州四季青)DMEM即基礎(chǔ)培養(yǎng)液上述產(chǎn)品在一般的生物公司均可購得。
其中，玻璃化冷凍液配方I中，由5％～15％二甲基亞砜+5％～15％乙二醇+5％～15％聚乙烯吡咯烷酮+20％胎牛血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成。
步驟3雞胚PGCs的冷凍和復蘇方法分離提純后的PGCs細胞，離心收集細胞，細胞懸液分兩步加入組成最終玻璃化冷凍液，調(diào)整細胞密度，移入冷凍管；4℃平衡5min，液氮面上靜置1min，直接投入液氮。
(1)解凍液離心管(規(guī)格15ml)中加入10ml無血清DMEM，再緩慢加入2ml FBS于離心管底部，可見明顯的分層，DMEM、FBS使用前37～38℃預熱。
(2)液氮中凍存2周后，取出冷凍管，投入37～38℃水浴中，并迅速晃動，約2/3融解時即可取出，并繼續(xù)晃動使其完全融解。細胞液從解凍液上層面緩慢加入，可見細胞下沉至DMEM和FBS分界面處，1000r/min離心5min，去上清(離心過程重復一次)，收集細胞，PGCs培養(yǎng)液懸浮細胞沉淀，臺盼藍染色計算細胞存活率，調(diào)整細胞密度，飼養(yǎng)層接種培養(yǎng)、傳代。
步驟3雞胚PGCs的培養(yǎng)傳代接種PGCs至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液組成DMEM+10％FBS+5～10ng/mLhSCF+5～10UI/mL mLIF+5～10ng/mL bFGF。培養(yǎng)溫度38.5℃，飽和濕度，5％的CO2濃度。
步驟4PGCS的鑒定(1)PAS染色收集PGCs細胞懸液，加入細胞懸液體積10％的固定液(75％酒精)，吹打均勻，1500r/min離心10min，棄上清，加入固定液，吹打均勻，固定30min，1500r/min離心10min，棄上清。重復此步驟一次，滴片。過碘酸酒精氧化10min，70％的酒精脫水15min，Schiff試劑染色15min，亞硫酸水分三缸洗三次，每次兩分鐘，除去非特異性染色，流水沖洗，干燥，觀察拍照。
(2)形態(tài)學鑒定單個PGCs細胞較大，核偏中央，有的有偽足，細胞周圍有明顯的光環(huán)；克隆狀PGCs細胞結(jié)合緊密，邊緣整齊，細胞間界限不清。
(3)核型分析收集PGCs細胞懸液，1500r/min離心10min，收集細胞；加入0.4％的KCL低滲處理40min；加入固定液(預固定)，吹打，1500r/min離心10min，去上清液；加固定液(第一次固定)，吹打，重復一次(第二次固定)，1500r/min離心10min，去上清；加固定液，吹打，滴片。固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)，現(xiàn)配現(xiàn)用。
步驟5結(jié)果(1)玻璃化冷凍液10％DMSO+10％EG+10％PVP+20％FBS+DMEM最適合第19期和第28期PGCs的玻璃化冷凍保存，復蘇后活率分別為84.15％和82.79％。
不同玻璃化冷凍液條件下PGCs復蘇后活率(％)(n＝8)

注相同*之間表示差異顯著(p＜0.05)，相同字母之間表示差異不顯著(p＞0.05)(2)PGCs細胞具有正常的二倍體核型是其進行體外操作的重要前提條件。復蘇后的PGCs仍保持正常的二倍體核型。如圖1、2所示。
(3)PGCs細胞質(zhì)中含有大量的糖原顆粒沉積，PAS(過碘酸雪夫特異性染色)可特異性地將PGCs染成品紅色，復蘇后的的第19期和第28期PGCs細胞PAS染色呈陽性，仍保持其特異性。如圖3、4所示。
(4)PGCs細胞復蘇后接種培養(yǎng)，在飼養(yǎng)層上保持正常的生長增殖行為，5.5～6天后，細胞集落中細胞排列緊密，呈典型的圓盤或橢圓狀克隆。如圖5、6所示。
本發(fā)明的優(yōu)點1、操作簡單、快捷，克服了常規(guī)慢速冷凍保存方法中需長時間平衡和逐步降溫的特點；2、保存效果穩(wěn)定、可靠，可以作為傳統(tǒng)的禽類遺傳資源保存方式的拓展。
權(quán)利要求
1.雞胚原始生殖細胞的玻璃化冷凍方法，其特征在于將雞胚原始生殖細胞加入玻璃化冷凍液后，移入冷凍管，于4℃±1℃下平衡5min±0.5min，液氮面上靜置1min±0.5min，最后，直接投入液氮。
2.根據(jù)專利要求所述雞胚原始生殖細胞的玻璃化冷凍方法，其特征在于所述玻璃化冷凍液由5％～15％二甲基亞砜+5％～15％乙二醇+5％～15％聚乙烯吡咯烷酮+20％胎牛血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成。
全文摘要
雞胚原始生殖細胞的玻璃化冷凍方法，涉及對發(fā)育至第19期(孵化約3天)和第28期(孵化約5.5天)雞胚性腺原始生殖細胞進行玻璃化冷凍保存的方法。將雞胚原始生殖細胞加入玻璃化冷凍液后，移入冷凍管，于4℃±1℃下平衡5min±0.5min，液氮面上靜置1min±0.5min，最后，直接投入液氮。本發(fā)明操作簡單、快捷，克服了常規(guī)慢速冷凍保存方法中需長時間平衡和逐步降溫的特點，保存效果穩(wěn)定、可靠，可以作為傳統(tǒng)的禽類遺傳資源保存方式的拓展。
文檔編號C12N5/06GK1821393SQ20061003861
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者李碧春, 韓威 申請人:揚州大學