專利名稱：早期診斷子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及早期診斷子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的方法。
背景技術(shù)：
子宮頸癌是婦女常見的惡性腫瘤，發(fā)病呈現(xiàn)上升和年輕化趨勢，死亡率高，死亡的主要原因是盆腔內(nèi)局部復(fù)發(fā)。子宮頸癌的主要轉(zhuǎn)移途徑是直接浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移，陰道、子宮旁組織、盆腔淋巴結(jié)是最常見的轉(zhuǎn)移區(qū)域，標(biāo)準(zhǔn)的廣泛全子宮切除和盆腔淋巴結(jié)清掃手術(shù)是其主要的治療方法，但是手術(shù)若未將累及的微小轉(zhuǎn)移癌灶完全切除，則成為術(shù)后復(fù)發(fā)之根源。顯然，準(zhǔn)確判斷是否已經(jīng)發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，不僅有助于預(yù)測預(yù)后，更有助于指導(dǎo)術(shù)后是否需要采用及時的鞏固治療。
準(zhǔn)確判斷手術(shù)切緣或盆腔淋巴結(jié)有或無癌細(xì)胞至關(guān)重要，但是目前常規(guī)的病理檢查方法對于微小轉(zhuǎn)移癌灶尚不易發(fā)現(xiàn)。主要原因有1、常規(guī)的病理檢查方法中無法辨別微量癌細(xì)胞的存在，轉(zhuǎn)移之初，少數(shù)癌細(xì)胞散在粘附種植于組織之中，病理醫(yī)師在為數(shù)有限的切片中判定癌細(xì)胞的存在如同大海撈針；2、病理醫(yī)師不能對全部的陰道切緣組織、子宮旁切緣組織、以及全部的淋巴結(jié)進(jìn)行連續(xù)切片、全面鏡下觀察，極可能造成取材不當(dāng)而漏診；3、病理醫(yī)師的制片技術(shù)、閱片技術(shù)和工作態(tài)度等均是影響準(zhǔn)確診斷的因素。
上述原因的存在，極大地限制了對于該疾病的轉(zhuǎn)移的早期診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足，提供一種早期診斷子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的方法，為預(yù)測子宮頸癌術(shù)后的愈后情況、指導(dǎo)術(shù)后是否需要采用及時的鞏固治療提供了可靠的參考依據(jù)。
本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為本發(fā)明方法的特點(diǎn)是將子宮頸癌手術(shù)中子宮旁切緣組織、陰道切緣組織和盆腔淋巴結(jié)分別制成細(xì)胞勻漿并充分混勻，利用HCII檢測細(xì)胞勻漿中的HPV(human papillomavirus，人乳頭瘤病毒)的亞型及載量、利用RT-PCR方法檢測細(xì)胞勻漿中的端粒酶活性，兩種檢測結(jié)果均為陽性，則判定子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的存在。
本發(fā)明方法可以按如下步驟進(jìn)行操作a、子宮頸癌手術(shù)中，在廣泛切除的子宮邊緣分別剪下陰道切緣組織、子宮旁左側(cè)切緣組織、子宮旁右側(cè)切緣組織各1g；左側(cè)盆腔淋巴結(jié)、右側(cè)盆腔淋巴結(jié)各取5～8個，所有標(biāo)本均放置在已經(jīng)標(biāo)記好的EP管中，將標(biāo)本用1×PBS洗滌，每個EP管中補(bǔ)加1×PBS 500μl，將組織剪碎制成懸液，每個EP管中取10μl移入新的EP管中并充分混勻，將該EP管中充分混勻的組織懸液分為兩等份一份放置到HC II裂解液中，一份提取RNA；b、對HCII裂解液標(biāo)本，進(jìn)行HPV檢測，通過組織中的DNA同時檢測13種高危型HPV，包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型，檢測到任何一種類型均判定結(jié)果為陽性；c、將提取的RNA取1μg，進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5倍稀釋，取5μl通過熒光定量PCR檢測組織中的端粒酶活性；若CT(Cycle threshold，閾值)≤38、端粒酶活性增高，判定結(jié)果為陽性；d、上述步驟b、c中的結(jié)果均為陽性則判定子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的存在。
HPV是人類癌癥發(fā)病中可以完全確認(rèn)的致癌病毒之一。幾乎100％子宮頸癌細(xì)胞中可以檢測到HPV的存在，HPV主要以整合狀態(tài)存在于子宮頸癌細(xì)胞中，并且隨著子宮頸癌細(xì)胞的增殖而存在于新生的癌細(xì)胞中，顯然，轉(zhuǎn)移的子宮頸癌細(xì)胞中也同樣攜有整合在DNA中的HPV，因此，HPV可以作為轉(zhuǎn)移的子宮頸癌細(xì)胞的標(biāo)志物。同時，由于HPV具有嗜粘膜的特性，子宮旁等“高危區(qū)域”組織不易感染HPV，所以，如果該區(qū)域組織中檢測出HPV的存在，則很可能來源于轉(zhuǎn)移的子宮頸癌細(xì)胞。簡言之，整合到癌細(xì)胞的HPV幾乎就是癌細(xì)胞的分子標(biāo)志，通過檢測子宮頸癌轉(zhuǎn)移高危區(qū)域組織中HPV，可以間接預(yù)測殘存微量癌細(xì)胞的存在，彌補(bǔ)病理診斷之不足。由于HPV的致癌機(jī)制主要與其激活端粒酶有關(guān)，而端粒酶的激活是HPV感染后導(dǎo)致子宮頸上皮內(nèi)瘤變和子宮頸癌的關(guān)鍵步驟，隨著子宮頸癌前病變的進(jìn)展，端粒酶的陽性表達(dá)率亦升高。因此HPV的檢測結(jié)果還需要輔以端粒酶活性的檢測結(jié)果，聯(lián)合檢測更有助于準(zhǔn)確判斷微小轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的存在。
與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明將HC II技術(shù)應(yīng)用于早期診斷子宮頸癌“危險區(qū)域”組織中微小轉(zhuǎn)移灶，具有理論基礎(chǔ)，經(jīng)臨床驗(yàn)證技術(shù)完全可行。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測端粒酶活性也是已經(jīng)成熟的技術(shù)，并且市場上有成品試劑盒出售，因此，HPV和端粒酶聯(lián)合檢測判定微小轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的存在完全可行。
2、本發(fā)明是對所獲取的陰道切緣組織、子宮旁切緣組織、盆腔淋巴結(jié)，在病理取材后，其余全部制成組織懸液混勻，取少量懸液檢測HPV、端粒酶，因此，檢測的標(biāo)本具有全面性和代表性，提高了診斷的敏感性和準(zhǔn)確性。
3、本發(fā)明根據(jù)HPV在子宮頸癌發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵性作用，利用HC II敏感、特異檢測HPV的優(yōu)勢，預(yù)測子宮頸癌手術(shù)切緣或盆腔淋巴結(jié)組織中微小癌灶的存在，有效彌補(bǔ)了病理診斷的不足。
4、本發(fā)明根據(jù)子宮頸癌發(fā)病機(jī)制與端粒酶激活的密切相關(guān)性，利用RT-PCR方法檢測端粒酶的活性，預(yù)測子宮頸癌手術(shù)切緣、淋巴結(jié)中微量癌細(xì)胞的存在，結(jié)合HPV的結(jié)果，極大地提高了診斷的準(zhǔn)確性。


附圖為本發(fā)明熒光定量RT-PCR方法檢測組織懸液中的端粒酶活性。
圖中a為組織懸液、b為陽性對照、c為陰性對照以下通過具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1患者，女，39歲，因陰道接觸性出血入院，病理診斷為“子宮頸癌IIA期”，手術(shù)行“廣泛性子宮切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)”。
檢測步驟操作如下1、組織懸液的制取術(shù)中將切下來的子宮邊緣分別剪下陰道切緣組織、子宮旁左側(cè)切緣組織、子宮旁右側(cè)切緣組織各1g；左側(cè)盆腔淋巴結(jié)、右側(cè)盆腔淋巴結(jié)各取5～8個，所有標(biāo)本均放置在已經(jīng)標(biāo)記好的EP管中，將標(biāo)本用1×PBS洗滌2次，每個EP管中補(bǔ)加1×PBS 500μl，將組織充分剪碎制成懸液，每個EP管中取10μl移入新的EP管中并充分混勻，將該EP管中充分混勻的組織懸液分為兩份一份放置到HC II裂解液中，一份提取RNA；2、HCII檢測組織懸液中的HPV①加5滴指示劑于裂解液中并充分混勻；②加1000ul裂解液至陰性對照，換蓋，混勻；加500ul裂解液至陽性對照，換蓋，混勻；加500ul裂解液至標(biāo)本，換蓋，混勻；③水浴65℃45分鐘，各管均呈紫色；④換手套，配備HPV Probe b(0.32ml探針稀釋液與12.8ul探針b充分混勻)；⑤先吸25μl已配好的探針b(Probe b)至96孔微孔板；吸75μl已裂解的質(zhì)控及標(biāo)本至各孔；貼上膠紙并放于振蕩器1100轉(zhuǎn)/分鐘，3分鐘；檢查所有孔變成黃色；放于加熱器65℃孵化60分鐘；立刻撕去膠紙，放置5分鐘冷卻。⑥將各孔液體(100μl)轉(zhuǎn)移至捕獲孔，貼上膠紙；離心1100轉(zhuǎn)/分鐘60分鐘；棄上清，在吸水紙上用力拍打扳至干；⑦吸75μl DR1(Detection Reagent 1)至各孔，蓋上膠紙；在20-25℃放置30分鐘；用吸水紙覆蓋，快速翻轉(zhuǎn)倒掉液體，用力拍打于紙上至于；⑧沖洗6次(垂直沖至底部，要有一定沖力)；于吸水紙上用力拍打，并置于紙上5分鐘至干，換手套；吸75μl DR2(DetectionReagent 2)至各孔；.置于黑暗處20-25℃15分鐘；在DML2000系統(tǒng)上判讀，分析演繹結(jié)果，檢測值為32.35pg/ml，(正常值為0-1pg/ml)，判定為陽性。
3、RT-PCR方法檢測組織懸液中的端粒酶活性提取RNA1ml Trizol充分裂解組織懸液，然后加入氯仿200μl抽提1次，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清，用0.5ml異丙醇沉淀，75％乙醇洗2次，干燥后用DEPC處理的無菌去離子水溶解RNA。紫外分光光度儀測定其濃度。
將提取的RNA取1μg，以O(shè)ligo(dT)為起始引物，加入定量好的RNA 2μg，72℃水浴10分鐘，冰浴5分鐘，依次加入無核酶水、2μ1 10×RT緩沖液、4μl 25mM Mgcl2、2μl250μM dNTPs、15U RNA酶抑制劑和200U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為20μl，42℃水浴60分鐘，加去離子水至100μl，以此做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，取5μl做模板，分別取上述RT反應(yīng)管中的RT產(chǎn)物及參比品2μl，加入PCR反應(yīng)液23μl。在PE7700PCR熱循環(huán)儀上設(shè)定如下程序

在PE7700定量PCR儀上，選定檢測熒光為FAM；在FTC-2000上“Dye selection”選項(xiàng)中選“1”，并在PCR循環(huán)第二步61℃時收集熒光數(shù)據(jù)。參比品分別設(shè)定為400，40，4，0.4pg/ml，用于獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便推導(dǎo)各檢測標(biāo)本的濃度。閾值設(shè)定以剛好高于陰性對照品的擴(kuò)增曲線最高點(diǎn)，結(jié)果組織懸液中的CT＝30，(CT≤38為陽性)。判定結(jié)果為陽性。
4、結(jié)果判定HPV陽性、端粒酶活性為陽性?；颊叽嬖谖⑿∞D(zhuǎn)移灶，需要進(jìn)一步放療、化療。
權(quán)利要求
1.早期診斷子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的方法，其特征是將子宮頸癌手術(shù)中子宮旁切緣組織、陰道切緣組織和盆腔淋巴結(jié)分別制成細(xì)胞勻漿并充分混勻，利用二代雜交捕獲(HCII)檢測細(xì)胞勻漿中的HPV的亞型及載量、利用RT-PCR方法檢測細(xì)胞勻漿中的端粒酶活性，兩種檢測結(jié)果均為陽性，則判定子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是按如下步驟操作a、子宮頸癌手術(shù)中，在廣泛切除的子宮邊緣分別剪下陰道切緣組織、子宮旁左側(cè)切緣組織、子宮旁右側(cè)切緣組織各1g；左側(cè)盆腔淋巴結(jié)、右側(cè)盆腔淋巴結(jié)各取5～8個，所有標(biāo)本均放置在已經(jīng)標(biāo)記好的EP管中，將標(biāo)本用1×PBS洗滌，每個EP管中補(bǔ)加1×PBS 500μl，將組織剪碎制成懸液，每個EP管中取10μl移入新的EP管中并充分混勻，將該EP管中充分混勻的組織懸液分為兩等份一份放置到HCII裂解液中，一份提取RNA；b、對HCII裂解液標(biāo)本，進(jìn)行HPV檢測，通過組織中的DNA同時檢測13種高危型HPV，包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型，檢測到任何一種類型均判定結(jié)果為陽性；c、將提取的RNA取1μg，進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5倍稀釋，取5μl通過熒光定量PCR檢測組織中的端粒酶活性；若CT≤38、端粒酶活性增高，判定結(jié)果為陽性；d、上述步驟b、c中的結(jié)果均為陽性則判定子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的存在。
全文摘要
早期診斷子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的方法，其特征是將子宮頸癌手術(shù)中子宮旁切緣組織、陰道切緣組織和盆腔淋巴結(jié)分別制成細(xì)胞勻漿并充分混勻，利用HC II檢測細(xì)胞勻漿中的HPV的亞型及載量、利用RT－PCR方法檢測細(xì)胞勻漿中的端粒酶活性，兩種檢測結(jié)果均為陽性，則判定子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶的存在。本發(fā)明診斷方法敏感、準(zhǔn)確，可以早期診斷子宮頸癌微小轉(zhuǎn)移灶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對判定臨床的預(yù)后、進(jìn)一步治療提供了可靠的依據(jù)。
文檔編號C12Q1/25GK1850990SQ20061003864
公開日2006年10月25日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者凌斌, 周穎, 許恬怡, 趙衛(wèi)東, 陳崢崢, 姚鳳球, 沈國棟, 馮定慶, 高婷, 石永云, 王梅梅, 陳敏, 朱園園 申請人:安徽省立醫(yī)院