專利名稱：基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用軟刻蝕方法進(jìn)行表面圖案復(fù)制工藝，特指基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞分選是從復(fù)雜環(huán)境中獲取性質(zhì)單一的目標(biāo)細(xì)胞的必要手段?，F(xiàn)階段實現(xiàn)細(xì)胞分選的重要儀器是流式細(xì)胞儀。現(xiàn)有的商品化流式細(xì)胞儀已經(jīng)深入到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等各個分支領(lǐng)域，得到了廣泛的應(yīng)用。但是現(xiàn)有的流式細(xì)胞儀也有明顯的缺點價格昂貴、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不易普及。
軟刻蝕是形成微納表面圖案的一種方便快速而經(jīng)濟(jì)的方法，軟刻蝕方法的關(guān)鍵技術(shù)有彈性模印章、在鑄模、微傳遞成模、毛細(xì)管成模、溶劑輔助成模，可以實現(xiàn)圖案的柔性復(fù)制。其中再鑄模法是常用的一種工藝，即在母模的表面澆鑄聚二甲基硅氧烷(PDMS)預(yù)聚物，并經(jīng)固化成型，可以在數(shù)小時之內(nèi)形成具有表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的均勻性良好的表面。利用軟刻蝕方法制作具有拓?fù)湫蚊驳谋砻妫ㄟ^細(xì)胞與不同表面形貌基底間的粘附、脫附作用，有望實行細(xì)胞的分選。
常用的細(xì)胞分選方法，其原理與流式細(xì)胞儀類似，利用反饋信號來判斷，反饋信號影響驅(qū)動力的施加，從而滿足預(yù)先設(shè)置的判斷細(xì)胞的某種驅(qū)動力，改變細(xì)胞的流向?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的分選。在生命科學(xué)和組織工程中，表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞的影響早在一個世紀(jì)以前就被發(fā)現(xiàn)，最早的關(guān)于表面形貌對細(xì)胞的影響方面的研究是Harrison(1.Harrison R.G.The cultivation oftissues in extraneous media as a method ofmorphogenetic study.Anat Rec，1912，6181-193)，在1912年，Harrison在蜘蛛網(wǎng)上培育細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沿著纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)生長。Curtis研究小組對細(xì)胞在不同的周期性表面和對稱性的表面上細(xì)胞的遷移研究發(fā)現(xiàn)，與在光滑或非周期性的表面相比，在具有周期性的微結(jié)構(gòu)柱列表面，細(xì)胞的粘附大大降低，用直徑為2μm的顆粒也得到了類似的試驗結(jié)果(2.Crutis ASG，Gadegaard N.Cells React to Nanoscale Order andSymmetry in Their Surroundings.IEEE TRANSACTIONS ON NANOBIOSCIENCE，20043(1)61-65。3.Crutis ASG，Casey B，GallagherJ O.Substratum nanotopography and the adhesionof biological cells.Are symmetry or regularity of nanotopography important？BiophysicalChemistry，2001，94275-283)。Hamilton等人在對微納凹槽的研究時發(fā)現(xiàn)，與平滑的表面相比，細(xì)胞在深度為750nm的凹槽表面遷移大大加快，而在深度為3μm或大于3μm的凹槽阻礙著細(xì)胞在表面的遷移(4.D.W.Hamilton，M.O.Riehle，R.Rappuoli.The response of primaryarticular chondrocytes to micrometric surface topography and sulphated hyaluronic acid-basedmatrices.Cell Biology International，2005，29605-615)。綜觀這些研究可以發(fā)現(xiàn)，在微納結(jié)構(gòu)表面，細(xì)胞活動能力在某一域限內(nèi)其遷移速度大幅降低或增加，這就為我們提供一種很有意義的思路，確定某一域限，利用細(xì)胞對不同結(jié)構(gòu)基地的選擇性粘附，依靠細(xì)胞與基底表面間的粘附作用力大小，實現(xiàn)細(xì)胞的選擇性分選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法，其復(fù)制出均勻性良好的微納圖案表面，在此表面上完成細(xì)胞的分選，而此方法無需任何反饋信號。
本發(fā)明的特征在于首先在母板表面澆鑄聚合物預(yù)聚物并固化成型，然后進(jìn)行脫模，復(fù)制出具有母板結(jié)構(gòu)的微納圖案表面，最后在具有此不同微納結(jié)構(gòu)的表面上培育細(xì)胞，通過細(xì)胞對基底表面進(jìn)行選擇性的粘附與脫附，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分選。
本發(fā)明按照如下步驟實現(xiàn)1.母板加工及其表面處理采用傳統(tǒng)光刻法，如等離子刻蝕法、電子束光刻等加工母板。加工完成的母板還需要進(jìn)行進(jìn)一步的清洗和硅烷化處理。經(jīng)過清洗和硅烷化處理后的母板表面形成一層疏水的表面自由能較低的分子層，使得脫模容易。常用的硅烷試劑有十七氟癸基三氯硅烷、十三氟癸基三氯硅烷等。
2.高分子聚合物的預(yù)聚體固化成型對母板硅烷處理后，在表面澆鑄高分子聚合物預(yù)聚體。最常用的聚合物預(yù)聚體是聚二甲基硅氧烷(PDMS)，具有良好的柔性和化學(xué)穩(wěn)定性，可以通過對其表面進(jìn)行修飾來改變其表面特性。其它可用的高分子聚合物有聚苯乙烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等。固化處理方法有紫外光固化和熱處理固化，也可在室溫下自然固化，但自然固化會增加加工的周期。
3.脫模固化后，將聚合物從母板上撕下，就可以得到聚合物模板。得到的聚合物模板可以作為母板用于澆鑄，制作出更多的模板，作為一次性的細(xì)胞分選基底。
4.細(xì)胞培育與分選將得到的模板和培養(yǎng)器皿進(jìn)行消毒滅菌，把模板置于培養(yǎng)皿的底面，將細(xì)胞懸液注入培養(yǎng)皿中，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中。定期更換新的培養(yǎng)液或維持液。最后，就在母板上沉積下某類細(xì)胞。
通過本發(fā)明中的復(fù)模法制作具有表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的基底，作為細(xì)胞分選的一種方法，與目前現(xiàn)有的細(xì)胞分選技術(shù)相比，具有廉價、方便的優(yōu)點，且具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的基底可以快速、簡單地進(jìn)行大規(guī)模的復(fù)制，制作出大量的一次性使用的細(xì)胞分選基底，避免出現(xiàn)分選基底的任何污染，細(xì)胞也無需進(jìn)行任何處理，對于微顆粒本發(fā)明也同樣適用。


圖1制作PDMS模板過程示意圖1硅片母板→2澆鑄→3固化→4PDMS模板→5細(xì)胞分選具體實施方式
以下通過制作PDMS模板對血液中紅血球、白細(xì)胞和血小板進(jìn)行分離分選的具體實施情況作如下說明1.母板加工及表面處理用等離子刻蝕方法制得具有精細(xì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的母板1，將母板1放入超聲波清洗機(jī)中，在丙酮與無水乙醇混合液中振蕩10分鐘，然后用去離子水進(jìn)行沖洗3遍，接著在真空干燥器中用十七氟癸基三氯硅烷對母板1進(jìn)行硅烷化處理。
2.在母板1上澆鑄PDMS，固化成型將PDMS預(yù)聚物(Dow-Corning公司，Sylgard 184)按照基質(zhì)∶固化劑＝10∶1的比例混合，用玻璃棒攪拌均勻，在真空干燥器中脫氣1小時，澆鑄到母板1上，PDMS在重力作用下鋪開。放入真空干燥箱中，真空保持30分鐘，脫去澆鑄過程中形成的氣泡，在真空度為0.06MPa、90℃下固化90分鐘。
3.脫模將固化后的PDMS模板從母板上表面輕輕揭開，得到PDMS模板4?？梢砸缘玫降腜DMS模板作為母板，重復(fù)進(jìn)行步驟1，2，3，能夠快速而大量地制得模板。PDMS模板上就復(fù)制出了母板上原有的圖案。
4.細(xì)胞培養(yǎng)與分選將PDMS模板4置于培養(yǎng)皿底面，在120℃蒸汽中高壓滅菌，或用70％的酒精進(jìn)行滅菌30分鐘，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3遍。將血液裝于培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中。血液中紅血球、白細(xì)胞和血小板細(xì)胞對于表面不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有著不同的粘附特性，對應(yīng)于不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)就可以分選出血液中的紅血球、白細(xì)胞與血小板細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法，其特征是首先在母板表面澆鑄聚合物預(yù)聚物并固化成型，然后進(jìn)行脫模，復(fù)制出具有母板結(jié)構(gòu)的微納圖案表面，最后在具有此不同微納結(jié)構(gòu)的表面上培育細(xì)胞，通過細(xì)胞對基底表面進(jìn)行選擇性的粘附與脫附，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法，其特征是先采用傳統(tǒng)光刻法加工母板，加工完成的母板再進(jìn)行清洗和硅烷化處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法，其特征是硅烷試劑為十七氟癸基三氯硅烷、十三氟癸基三氯硅烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法，其特征是聚合物預(yù)聚體為聚二甲基硅氧烷或聚苯乙烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法，其特征是所述的細(xì)胞培育與分選是將得到的模板和培養(yǎng)器皿進(jìn)行消毒滅菌，把模板置于培養(yǎng)皿的底面，將細(xì)胞懸液注入培養(yǎng)皿中，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，再在母板上沉積下某類細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用軟刻蝕方法進(jìn)行表面圖案復(fù)制工藝，特指基于微納表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞分選方法。首先在母板表面澆鑄聚合物預(yù)聚物并固化成型，然后進(jìn)行脫模，復(fù)制出具有母板結(jié)構(gòu)的微納圖案表面，最后在具有此不同微納結(jié)構(gòu)的表面上培育細(xì)胞，通過細(xì)胞對基底表面進(jìn)行選擇性的粘附與脫附，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分選。與目前現(xiàn)有的細(xì)胞分選技術(shù)相比，具有廉價、方便的優(yōu)點，且具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的基底可以快速、簡單地進(jìn)行大規(guī)模的復(fù)制，制作出大量的一次性使用的細(xì)胞分選基底，避免出現(xiàn)分選基底的任何污染，細(xì)胞也無需進(jìn)行任何處理，對于微顆粒本發(fā)明也同樣適用。
文檔編號C12N5/00GK1944635SQ20061004157
公開日2007年4月11日 申請日期2006年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月15日
發(fā)明者周明, 楊加宏, 鄭傲然, 蔡蘭 申請人:江蘇大學(xué)