專利名稱：表達嗜熱毛殼菌gla基因的酵母工程菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達熱穩(wěn)定外切糖化酶基因gla的酵母基因工程菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，系統(tǒng)命名為淀粉α-1.4葡聚糖葡萄糖水解酶，α-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3.)]，是一種具有外切活性的酶，它能把淀粉、糊精、糖原等從非還原性末端水解α-1.4葡萄糖苷鍵，而得到終產(chǎn)物β-D-葡萄糖，也能緩慢水解α-1.6葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖，是淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖過程中的主要酶類之一，糖化酶具有重要商業(yè)價值，它已在釀造、食品、醫(yī)學(xué)等工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。用于生產(chǎn)白酒、黃酒、酒精、醋、啤酒、乳酸鈣、檸檬酸、味精等作糖化劑；用于以葡萄糖作發(fā)酵培養(yǎng)基的各種抗生素、有機酸、氨基酸、維生素的發(fā)酵；與木質(zhì)素酶、纖維素酶、果膠酶等菌種共同作用，可將秸桿等農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)變?yōu)榧倚罂衫玫娘暳?；也可用于分解低聚糖；還大量用于生產(chǎn)各種規(guī)格的葡萄糖?？傊矊Φ矸?、糊精、低聚糖進行酶水解的工業(yè)上，都可適用。盡管糖化酶對α-1.6糖苷鍵的活性只有α-1.4糖苷鍵的0.2％，這足以在工業(yè)糖化過程中影響產(chǎn)量。
目前國內(nèi)外已篩選出多種糖化酶生產(chǎn)菌，并將其分離提純。但市場應(yīng)用的糖化酶主要來源于常溫菌，因產(chǎn)品成本高，熱穩(wěn)定性差，貨架壽命短，酶活力和產(chǎn)率低而制約糖化酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)上的應(yīng)用。由此可見，熱穩(wěn)定性糖化酶的研究和開發(fā)具有重要的商業(yè)價值。
嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum)是一種廣泛分布的，生長上限溫度較高的一種嗜熱真菌，從該菌中已分離了多種嗜熱酶，但未見該菌嗜熱糖化酶的報道。
本研究是通過RT-PCR及RACE方法從嗜熱毛殼菌Chaetomiumthermophilum獲得糖化酶gla基因，將該片段克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K上，獲得表達重組質(zhì)粒pPIC9K/gla，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，再從中篩選出一種高效表達糖化酶的酵母基因工程菌。其中一重組子GS-GLA-22經(jīng)6d誘導(dǎo)，糖化酶蛋白表達量為0.86mg/mL，其酶活為16.73U/mL，用于淀粉加工及其它工業(yè)領(lǐng)域，具有非常顯著的經(jīng)濟價值和社會價值。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是從嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum獲得糖化酶gla基因的全長cDNA，命名為gla(DQ104609)，并將gla構(gòu)建到表達載體pPIC9K上，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，培養(yǎng)選擇產(chǎn)酶量高的畢赤酵母工程菌株。
嗜熱毛殼菌gla全長的cDNA為2016bp，包括起始密碼子和多聚A尾。開放閱讀框部分為1797bp，由此推得具有599個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發(fā)現(xiàn)與15家族糖化酶的同源性很高，其中五個基序P-YFY-W-RDAAL、WG-PQRDGP、D-WEEV、AVG-Y-ED和L-W-YA非常保守表明經(jīng)過上述克隆步驟得到了嗜熱毛殼菌gla基因。該序列如下(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*長度2016堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源嗜熱毛殼菌(f)序列描述1 CTGCCTGACC AGGCAATGCC GCGACGCTAT CATCTGTCAA AAAATGGCTG AACGCCTCTA6061 AGTCAGAATC CGTGATGTCC GCATCGGTCC TGTTGGTCTT TGCACAGCAC GAAGTATCGG120121GTGCCGCATC GCACGCACCC CAGTGGGCTA ATCTCCAACG CTCAGCGGTC GATTCCTACA180181TTGAGCGTGA GACCCCTATC GCGTGGAACG CTTTGCTGAA CAACATAGGC CCATGCGGCG240241ATTGCGTCAC GGGAGCGGCC TGCGGAATCG TCGTGGCGAG GCCCTGCAAG TCCGACCCTG300301ATTACTTCTA CCAGTGGCAG CGAGACGCCG CTCTGCAAGG TCAAATTCCG AGCATACGAT360361TGCATAGGGG ACAGCAAGAA TTTAGCCACG AAATTCAGCA GCACAGCCAG GCACAAGCTA420421TTCTTCAGTT AATATGGAAC CCGTCAGGTG ACAATGGCGA GGCCTGGGGC TTGGGCGAAC480481CTAGGTTCAT GGTTGACGGC TTCATTCACA GCTGGTTCCA GGGCTGGGGA AGTCCACAGC540541GGGATGGCCC GGCGTTGAGT GCAATTGCAT TTATTCAAAC ACACAGCTGG CTTAAGGACA600601TGGGGCAAGC ACCCCACGCG AAGTTAATAA TCTGGCCTAT CGTTAAAAAC GATCTCACGT660661ACCACGGTCA ATACTGGAAT AATTCGGGCC AGGACCTTTG GGAAGAGGTA TTGCAAACCA720721CCTTCTTCCA AATTGCCGAA CAGCACAGCG CGCTTCTAGA AGGCGCGAAC TTTGCATTCC780781TTTCCGGCCC TCAATGCATT AGCTGCGACC AGGCGCCGCA GGTTTTATGT TTCCAAGGCA840841GGTTCTGGAA AGGCCACCAA TGCTATAATA GCGGCAGGCC CCGGAGCGGG TTAGACTTTA900901ACTGCGAGCT AGGCTCGATC CAAATGTTCG ACCCCAAGGC GGAATGCGAT CAAATTCAAT960961TCCAGCCTCA TAGGGACAGC GCGCTAGCTA ATCACAAGGT TGTTCAAGAC TCGTTCCGCT10201021 ACCACGGCTG TAATAACGGC CACCAGTGGG GCGACGCCGT TGCCGTAGGA AGTTACCCGG10801081 AATTCGTATA CTATAATGGC ATGCCATGGT ACCTTGCCAT TCAGGCGGCC GCGGAGCAGC11401141 TTTACGACGC CGTTTATCAA TGGCAAGATG TTGAATGGAT TCACATGGGC ATTCAATCCC12001201 TTGTGTTCTT CCACGCGGAT GTACTAACCT CGGCGGCCGG GCAATACACC AGGTCCCACA12601261 CGACGTATCA AAATATCCAC GACGCTGTTA AGACCTACGC CGACGGCTTC GTTTCGGTTG13201321 TATCGTGTGC CAAGTACCAC CCCAGGAACG GGACCCTACA TGAGGGCGAA CATAGGAATG13801381 ACGGCAAGCC CGACTCGGCC AGCCACTTGC ACTGGAGGTA TGCGGCCTTG TTGTGCGCCA14401441 TACACAGCAG GGCGACCCAA GTACCTGCCT CGTGGGGCGA GGCGTGCGCG ACGAGCCCCG15001501 GGGTGTGCAC CGCCATTGAG CAATCAGGGC ATTACTCCAC GGCCCATAAT CAATCCTGGC15601561 CGTCCGCGTG CAGTCAACAA CATCATAGGC AGACCCCGTG CCACTGCCAA CATCCCGTGG16201621 CCTACCATTT CAATGGCATT CAACAATACG GCGAAATCTA CGTTCTTGGA ACGATACCCG16801681 CGCTGGGCAA CTGGAGGGAC TGGGGCTGTC ACCTGAGGGC CGACAAATAT ACCAACTCGG17401741 ACCAGATTTG GTATTCCATT GTACAACTTC CAGCGGGCGA AAGGGCCGTT TATAAGTATA18001801 TACGCAAATG GGAAGGCAGG GTCGACCCGA ACCGGCTCAC GCAAGTTCAG GACTGTGGTC18601861 AAGACCACTG GTGAGTCACT TCAGTCGTCT GCAGAGGATT TATCCCCGCG CGTGGTGACA19201921 TTGCAATCCG CCAGCCAGCT CCCGGGGCTT CTCCCGAGGG ACGTCGTCAG CCTGCTGAGG19801981 TACATGACCC GGAGCTAATC GAAAAAAAAA AAAAAA 2016(2)SEQ ID NO 1的信息
(a)序列特征*長度457氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述1 MSASVLLVFA QHEVSGAASH APQWANLQRS AVDSYIERET PIAWNALLNN IGPCGDCVTG 6061 AACGIVVARP CKSDPDYFYQ WQRDAALQGQ IPSIRLHRGQ QEFSHEIQQH SQAQAILQLI 120121WNPSGDNGEA WGLGEPRFMV DGFIHSWFQG WGSPQRDGPA LSAIAFIQTH SWLKDMGQAP 180181HAKLIIWPIV KNDLTYHGQY WNNSGQDLWE EVLQTTFFQI AEQHSALLEG ANFAFLSGPQ 240241CISCDQAPQV LCFQGRFWKG HQCYNSGRPR SGLDFNCELG SIQMFDPKAE CDQIQFQPHR 300301DSALANHKVV QDSFRYHGCN NGHQWGDAVA VGSYPEFVYY NGMPWYLAIQ AAAEQLYDAV 360361YQWQDVEWIH MGIQSLVFFH ADVLTSAAGQ YTRSHTTYQN IHDAVKTYAD GFVSVVSCAK 420421YHPRNGTLHE GEHRNDGKPD SASHLHWRYA ALLCAIHSRA TQVPASWGEA CATSPGVCTA 480481IEQSGHYSTA HNQSWPSACS QQHHRQTPCH CQHPVAYHFN GIQQYGEIYV LGTIPALGNW 540541RDWGCHLRAD KYTNSDQIWY SIVQLPAGER AVYKYIRKWE GRVDPNRLTQ VQDCGQDHW 599構(gòu)建重組表達質(zhì)粒載體pPIC9K/gla，利用電轉(zhuǎn)儀提供的優(yōu)化參數(shù)進行電擊轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，然后進行誘導(dǎo)表達。獲得一重組子GS-GLA-22經(jīng)6d誘導(dǎo)，該基因工程菌的糖化酶表達量為0.86mg/mL，其酶活為16.73U/mL。表達量和產(chǎn)酶活力都較高，具有非常重要的經(jīng)濟價值和社會價值。


附圖1、糖化酶基因gla PCR產(chǎn)物電泳圖譜泳道1，RT-PCR泳道2，3′RACE泳道3，5′RACE泳道4，ORF cDNA泳道M，DL2000；
附圖2、重組質(zhì)粒pPIC9K/gla的酶切分析泳道1，DNA Maker DL2000泳道，2，SnaB I+Not I，泳道3，Bgl II，泳道4，Sac I，泳道5，Sac I，泳道6，λ-HindIII digest DNAMarker；附圖3、酵母轉(zhuǎn)化子在不同G418YPD培養(yǎng)基的平板篩選；附圖4、酵母轉(zhuǎn)化子GS-GLA-22的PCR結(jié)果；泳道1，pPIC9K使用5′α-factor和3′AOX1引物的擴增結(jié)果，泳道2，P1，P2的PCR鑒定結(jié)果，泳道3，酵母轉(zhuǎn)化子使用5′α-factor和3′AOX1引物的PCR鑒定結(jié)果，M，DNA Maker DL2000；附圖5、重組糖化酶的SDS-PAGE分析泳道1-6，酵母轉(zhuǎn)化子GS-GLA-22甲醇誘導(dǎo)1d、2d、3d、4d、5d、6d，泳道7，低分子量標準蛋白，泳道8，酵母轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC9K甲醇誘導(dǎo)6d。
(五)具體發(fā)明實施方式實施方式1嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilium糖化酶gla基因的克隆方法(1)RNA的提取參照Trizol試劑盒說明，提取總RNA。
(2)cDNA第一條鏈的合成按照Promega公司的Reverse TranscriptionReaction試劑盒說明書進行，以O(shè)ligo(dT)20為引物合成cDNA第一鏈。反應(yīng)條件為42℃1小時；95℃5分鐘。
(3)PCR反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試劑與條件為首先將下列試劑混在一起10X反應(yīng)緩沖液 2.5μl25mM MgCl22μl
10mM dNTP 2μl上游引物(10μM) 1μl下游引物(10μM) 1μl模板cDNA2μlTaq DNA聚合酶 0.5μl滅菌雙蒸水 14μl總體積 25μlPCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min；94℃變性1min；55℃退火1.5min，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃再延伸10min。
(4)基因克隆取2μl PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體進行連接，操作步驟按照Promega公司產(chǎn)品說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
(5)質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。
(6)序列測定在上海生工進行。
(7)3′和5′序列的分離按照5’/3’RACE Kit，2nd Genneration(RocheApplied Science)使用說明進行。
(8)同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與Genbank中的序列進行比較。
實施方式2嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilium糖化酶ebhl基因的核苷酸序列和氨基酸序列見“發(fā)明內(nèi)容”部分。
實施方式3表達載體的構(gòu)建(1)根據(jù)cbhl基因的成熟肽全編碼序列設(shè)計引物，分別引入SnaB I和Not I
酶切位點正向引物ep-gla55’-GCG GCGGTCGATTCCTACATTG-3’(SnaB I)反向引物ep-gla35’-GTC TCACCAGTGGTCTTGACCAC-3’(Not I)以嗜熱毛殼菌總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(yīng)(2)取2μl PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體進行連接，操作步驟按照Promega公司產(chǎn)品說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。減法提取質(zhì)粒DNA，進行序列測定。
(3)用SnaB I和Not I兩個限制性內(nèi)切酶將該基因從pGEM-T easy載體上切下，同樣酶切pPIC9K空載體并在CIAP作用下使之去磷酸化。將去磷酸化的線性化的pPIC9k空載體于雙酶切得到的目的片段在T4 DNA連接酶的作用下4℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，然后在含氨卞青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。
(4)將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化用限制性內(nèi)切酶Sac I線性化，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115。
實施方式4陽性轉(zhuǎn)化子篩選(1)用滅菌牙簽挑取單個菌落分別點種到MM和MD平板上，30℃倒置培養(yǎng)2-4d，在MD平板和MM平板上均能正常生長的轉(zhuǎn)化子(表現(xiàn)型為His+Mut+)為陽性轉(zhuǎn)化子。
(2)挑取陽性轉(zhuǎn)化子，分別點種于含0.50mg/mL、1.00mg/mL、2.00mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL G418YPD培養(yǎng)基平板上，以篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
(3)分別使用gla的特異引物ep-gla5/ep-gla3和載體pPIC9K上5′α-factor和3′AOXl通用引物進行PCR鑒定。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)后72℃延伸10min。
實施方式5畢赤酵母工程菌株誘導(dǎo)表達(1)將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含25mLBMGY培養(yǎng)基的250mL的搖瓶中，30℃下250-300rpm培養(yǎng)至OD600為2-6。室溫1500-3000g離心收集菌體，用無菌水洗三次，將菌體轉(zhuǎn)移至BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃繼續(xù)培養(yǎng)，每12h向培養(yǎng)基中添加100％甲醇至終濃度為0.5-1％。每12h取樣，離心收集上清，即為粗酶液。
(2)重組糖化酶的酶活力檢測采用DNS法測定誘導(dǎo)上清液中的糖化酶活性，反應(yīng)體系包含0.2mL(0.5％w/v)可溶性淀粉(懸浮于0.05mol/L、pH5.0的醋酸緩沖液)，200μL酶液，60℃保溫10min。用DNS法測定上清液中的還原糖量。一個酶活力單位(U)定義反應(yīng)條件下，每分鐘水解可溶性淀粉產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶蛋白量。
(3)蛋白含量的測定蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法，以牛血清白蛋白為標準蛋白測定。
(4)SDS-PAGE電泳分析gla基因的表達情況。
應(yīng)用以上方法我們篩選得到了表達量和產(chǎn)酶活力都較高的畢赤酵母工程菌株GS-GLA-22，可在釀造、食品、醫(yī)學(xué)等工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種表達嗜熱毛殼菌gla基因編碼蛋白的酵母工程菌株，其特征是該菌株為一種畢赤酵母，通過RT-PCR及RACE方法從嗜熱毛殼菌Chaetomiumthermophilum獲得糖化酶基因gla，將該片段克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K上，獲得表達重組質(zhì)粒pPIC9K/gla，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，從中篩選出高效表達糖化酶的酵母基因工程菌。
全文摘要
本發(fā)明是一種酵母基因工程菌Pichia pastoris GS－GLA－22，通過RT－PCR及RACE方法從嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum獲得糖化酶gla基因，將該片段克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K上，獲得表達重組質(zhì)粒pPIC9K/gla，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，再從中篩選出一種高效表達糖化酶的酵母基因工程菌。其中一重組子GS－GLA－22經(jīng)6d誘導(dǎo)，糖化酶蛋白表達量為0.86mg/mL，其酶活為16.73U/mL，用于淀粉加工及其它工業(yè)領(lǐng)域，具有非常顯著的經(jīng)濟價值和社會價值。
文檔編號C12N15/56GK101070524SQ20061004393
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日
發(fā)明者李多川, 陳靜 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)