專(zhuān)利名稱(chēng)：以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物轉(zhuǎn)化/生物催化技術(shù)、微生物菌株篩選領(lǐng)域，具體為一種以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選策略及方法。
背景技術(shù)：
磷霉素[(-)順-(1R，2S)-1，2-環(huán)氧丙基磷酸，英文名Fosfomycin，簡(jiǎn)稱(chēng)FOM]是一種廣譜抗生素。磷霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且迥異于大多數(shù)常用抗生素，它具有毒性低、無(wú)抗原性、抗菌譜廣、適應(yīng)癥多、不易形成耐藥性等特點(diǎn)。近年的研究結(jié)果又發(fā)現(xiàn)了磷霉素的一些新功效，例如與其它抗生素的協(xié)同作用、減輕其它抗生素的毒副反應(yīng)、聯(lián)合用藥治療危重感染、免疫增強(qiáng)作用。因此，磷霉素被稱(chēng)為二十一世紀(jì)的新抗生素。
目前，磷霉素生產(chǎn)主要采用化學(xué)合成法，即以丙炔醇為原料，經(jīng)過(guò)酯化、水解、加氫、環(huán)氧化、拆分、成鹽等工藝而最終獲得左旋磷霉素。但是，化學(xué)合成工藝的生產(chǎn)收率不到20％，這是因?yàn)樵诃h(huán)氧化過(guò)程中形成的是磷霉素消旋體，即50％左旋磷霉素和50％右旋磷霉素的混合物。將消旋體進(jìn)行化學(xué)拆分，分離出的左旋磷霉素為有療效的成品，分離出的右旋磷霉素則作為廢棄物排放掉。這不僅導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高和資源浪費(fèi)，也同時(shí)形成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。例如，某制藥企業(yè)的有機(jī)磷廢水排放量為20噸/日，COD值高達(dá)200000～300000mg/L。因此，實(shí)現(xiàn)左旋磷霉素的不對(duì)稱(chēng)合成或右旋磷霉素的再利用，是降低磷霉素生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)值和利稅、減少?gòu)U水排放的一項(xiàng)迫切需求。
近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到生物轉(zhuǎn)化(Biotransformation)/生物催化(Biocatalysis)將成為生產(chǎn)手性化合物的關(guān)鍵技術(shù)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)生物催化劑(微生物菌體或酶)本身就是手性催化劑，它們對(duì)底物構(gòu)型往往有嚴(yán)格要求，能選擇性地作用于對(duì)映體中的一個(gè)，而對(duì)另一個(gè)不起作用。生物轉(zhuǎn)化或合成正是利用酶促反應(yīng)的高度立體選擇性，將化學(xué)合成的外消旋物、前體或潛手性化合物轉(zhuǎn)化成單一光學(xué)活性產(chǎn)物。目前，生物轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)物的89％是手性的。生物轉(zhuǎn)化作用的優(yōu)點(diǎn)為手性專(zhuān)一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和(20℃～50℃、pH中性)、立體選擇性強(qiáng)、副反應(yīng)少、收率高、產(chǎn)物光學(xué)純度高，環(huán)境污染少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株篩選策略和方法，實(shí)現(xiàn)左旋磷霉素的不對(duì)稱(chēng)合成或右旋磷霉素的再利用，降低磷霉素生成成本。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株篩選方法，以實(shí)驗(yàn)室已有的菌株為出發(fā)菌株，采用以右旋磷霉素為底物的液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，采用生物檢定盤(pán)及薄層層析(TLC)相結(jié)合的方法對(duì)振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，從而確定從中篩選出產(chǎn)物為左旋磷霉素的轉(zhuǎn)化菌株。
所述實(shí)驗(yàn)步驟如下1)完全液體培養(yǎng)基按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，完全液體培養(yǎng)基有如下配方牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調(diào)pH 7.2-7.4，115℃滅菌30分鐘，備用；2)待測(cè)菌株的培養(yǎng)將待測(cè)菌株接種于完全液體培養(yǎng)基中進(jìn)行30℃富集，搖床160rpm，振蕩培養(yǎng)3天，然后加入轉(zhuǎn)化底物右旋磷霉素0.1～0.8％，并加入微量元素NaVO30.02％，CoCl20.05％(按重量百分比計(jì)算)進(jìn)行30℃搖床振蕩轉(zhuǎn)化培養(yǎng)5天，160rpm。
3)生物檢定及其平板的制備培養(yǎng)基I成分按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調(diào)pH 7.0-7.2；培養(yǎng)基II成分按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調(diào)pH 7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘；將融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤(pán)，制成下層平板；再將融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌懸液，混勻后倒入生物鑒定盤(pán)，制成上層平板；將轉(zhuǎn)化發(fā)酵液4500rpm、20分鐘離心取上清，加10μl于滅好菌的濾紙片上，待1小時(shí)干燥后，放于生物鑒定盤(pán)上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，觀(guān)察并測(cè)量抑菌圈直徑，依據(jù)抑菌圈的有無(wú)和抑菌圈直徑的大小來(lái)篩選具有磷霉素生物轉(zhuǎn)化能力的菌株。
4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定及平板的制備本發(fā)明利用薄層層析分析磷霉素，展開(kāi)劑為正丁醇∶乙酸∶水(體積比3∶1∶1)，將展開(kāi)后的層析板風(fēng)干，置于生物鑒定平板上，待浸潤(rùn)后取下，37℃培養(yǎng)16hr，含有磷霉素部分產(chǎn)生抑菌圈。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種新的、效率高、操作簡(jiǎn)易的篩選策略及相應(yīng)的具體操作方法，用于篩選以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株。該篩選策略及具體操作方法的要點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)室菌種的前期富集及采用生物檢定與薄層層析(TLC)方法相結(jié)合的產(chǎn)物檢定策略。由于自然界中能進(jìn)行右旋至左旋磷霉素的菌種不多，且實(shí)驗(yàn)室已有菌種生長(zhǎng)緩慢，前期菌種富集很重要。而且采用生物檢定與TLC方法相結(jié)合的產(chǎn)物檢定策略進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，可以準(zhǔn)確確定產(chǎn)物中是否含有左旋磷霉素。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明篩選策略把篩選過(guò)程分為兩個(gè)步驟，即培養(yǎng)和鑒定步驟。以實(shí)驗(yàn)室已有的菌株為出發(fā)菌株，采用以右旋磷霉素為底物的液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，采用生物檢定盤(pán)及薄層層析(TLC)相結(jié)合的方法對(duì)振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，從而確定從中篩選出產(chǎn)物為左旋磷霉素的轉(zhuǎn)化菌株。
本發(fā)明中除特別說(shuō)明外，所述百分含量均為重量百分?jǐn)?shù)，所述pH調(diào)節(jié)采用重量濃度為10％的NaOH溶液或重量濃度為10％的HCl溶液。
所述實(shí)驗(yàn)室菌株采用以順丙烯磷酸(cPA)為唯一碳源篩選模型獲得。以cPA為唯一碳源菌株篩選模型設(shè)計(jì)思路能夠以順丙烯磷酸為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，必定存在可以作用于順丙烯磷酸的酶。所以從土壤樣品中篩選出的細(xì)菌具有環(huán)氧化順丙烯磷酸合成磷霉素的能力。具體過(guò)程如下一、制備土壤懸液稱(chēng)取土壤樣品5g，放入盛有100mL無(wú)菌生理鹽水并帶有玻璃珠的250mL的三角瓶中，置搖床振蕩30min，使土壤樣品在水中分散均勻，制成為土壤懸液。
二、菌株篩選1.順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基配方如下按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，(NH4)2SO40.3％，KCl 0.1％，NaCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，KH2PO40.05％，瓊脂粉2％，維生素復(fù)合液0.1％，順丙烯磷酸1.0％，余量為蒸餾水。pH 7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘。其中，維生素復(fù)合液的組成如下按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，葉酸0.002‰、生物素0.002‰、維生素B60.01‰、維生素B10.005‰、泛酸鈣0.005‰、維生素B20.005‰、維生素B120.0001‰，余量為蒸餾水。維生素復(fù)合液須經(jīng)0.2μm濾膜過(guò)濾除菌，并在培養(yǎng)基滅菌后以無(wú)菌操作加入。
2.篩菌過(guò)程
吸取0.1mL土壤懸液，加到順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。倒置于37℃培養(yǎng)5～7天。每天觀(guān)察菌落生長(zhǎng)狀況。
3.篩選獲得菌株的分離純化并保藏菌種分離純化培養(yǎng)基配方如下按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，(NH4)2SO40.3％，KCl 0.1％NaCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，KH2PO40.05％，瓊脂粉2％，pH 7.2-7.4，維生素復(fù)合液0.1％，酵母膏0.1％，順丙烯磷酸0.3％，余量為蒸餾水。121℃滅菌20分鐘。
挑取在順丙烯磷酸唯一碳源選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，劃線(xiàn)接種于上述分離純化培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行純化，然后再接種于相同培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行保藏。
本發(fā)明的具體操作步驟如下一、完全液體培養(yǎng)基的制備與菌株培養(yǎng)按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，完全液體培養(yǎng)基有如下配方牛肉膏0.5％，蛋白胨1％NaCl 0.5％，余量為蒸餾水，pH 7.2-7.4，115℃滅菌30分鐘，備用。
將待測(cè)菌株接種于完全液體培養(yǎng)基中進(jìn)行30℃富集，搖床160rpm，振蕩培養(yǎng)3天，與空白對(duì)照完全液體培養(yǎng)基相比較用肉眼觀(guān)察出現(xiàn)明顯渾濁，然后加入轉(zhuǎn)化底物右旋磷霉素，使其重量比為0.1～0.8％，并加入微量元素NaVO3和CoCl2，使重量比分別為0.02％、0.05％，進(jìn)行30℃轉(zhuǎn)化培養(yǎng)5天，搖床振蕩160rpm，得到底物轉(zhuǎn)化后的發(fā)酵液。
二、產(chǎn)物鑒定1、指示菌培養(yǎng)與懸液的配制指示菌為大腸桿菌(E.coli)。
按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，指示菌培養(yǎng)基組成牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來(lái)水。加熱溶解后，采用NaOH 10％與HCl 10％溶液，并用pH試紙測(cè)試使培養(yǎng)基達(dá)pH 7.0-7.2。裝入茄型瓶90mL，121℃濕熱滅菌20分鐘后，擺斜面?zhèn)溆谩?br> 指示菌培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24hr，菌苔呈半透明至白色。
指示菌懸液的制備把100mL滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環(huán)刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的空錐瓶中，測(cè)定吸光度(O.D.值)為0.54-0.57。
2、生物檢定培養(yǎng)基及其平板的制備按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，培養(yǎng)基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來(lái)水，pH 7.0-7.2；培養(yǎng)基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為自來(lái)水，pH 7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘。將200mL融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤(pán)(20×30cm)，制成下層平板；再將100mL融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌懸液1mL，混勻后倒入生物鑒定盤(pán)，制成上層平板。
將轉(zhuǎn)化發(fā)酵液4500rpm、20分鐘離心取上清，加10μl于滅好菌的濾紙片上，待1小時(shí)干燥后，放于生物鑒定盤(pán)上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，觀(guān)察并測(cè)量抑菌圈直徑。生物轉(zhuǎn)化過(guò)程首先需要菌體吸收外源性前體，通過(guò)菌體內(nèi)酶催化作用可將右旋磷霉素轉(zhuǎn)化為具有抑菌作用的左旋磷霉素。因此可依據(jù)抑菌圈的有無(wú)和抑菌圈直徑的大小來(lái)篩選具有磷霉素生物轉(zhuǎn)化能力的菌株。只要有抑菌圈產(chǎn)生即可認(rèn)為菌株具有磷霉素生物轉(zhuǎn)化能力；抑菌圈越大，轉(zhuǎn)化能力越強(qiáng)。
3、薄層層析鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物磷霉素利用薄層層析分析磷霉素，展開(kāi)劑為正丁醇∶乙酸∶水(體積比3∶1∶1)，將展開(kāi)后的層析板風(fēng)干，置于生物鑒定平板上，待浸潤(rùn)后取下，37℃培養(yǎng)16hr，含有磷霉素部分產(chǎn)生抑菌圈。比較樣品與磷霉素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值(比移值)，從而驗(yàn)證轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，Rf值為3.53時(shí)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為具有以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株。
實(shí)施例將實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)以cPA為唯一碳源菌株篩選模型從土壤中篩選出的菌株，經(jīng)過(guò)前期富集培養(yǎng)，與其后的生物檢定與薄層層析檢驗(yàn)，比較Rf值，從中篩選出具有以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株。
權(quán)利要求
1.一種以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株篩選方法，其特征在于包括培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定兩個(gè)步驟，培養(yǎng)是以實(shí)驗(yàn)室已有的菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行前期富集培養(yǎng)，前期培養(yǎng)采用完全液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌種富集，然后加入右旋磷霉素，以右旋磷霉素做為發(fā)酵底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定采用生物檢定盤(pán)及薄層層析相結(jié)合的方法，對(duì)產(chǎn)物中是否含有左旋磷霉素進(jìn)行檢定。
2.按照權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述培養(yǎng)步驟如下1)完全液體培養(yǎng)基按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，完全液體培養(yǎng)基有如下配方牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，余量為蒸餾水，將上述組分均勻混合，調(diào)pH 7.2-7.4，115℃滅菌30分鐘，備用；2)待測(cè)菌株的培養(yǎng)將待測(cè)菌株接種于完全液體培養(yǎng)基中進(jìn)行30℃富集，搖床160rpm，振蕩培養(yǎng)3天，然后按重量百分比計(jì)算加入底物右旋磷霉素0.1～0.8％，并按重量百分比計(jì)算加入微量元素NaVO30.02％，CoCl20.05％進(jìn)行30℃轉(zhuǎn)化培養(yǎng)5天。
3.按照權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于采用以右旋磷霉素為底物的完全液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，加入右旋磷霉素、NaVO3、CoCl2后進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，160rpm，30℃轉(zhuǎn)化培養(yǎng)5天。
4.按照權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，通過(guò)采用生物檢定盤(pán)及薄層層析相結(jié)合的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定方法，篩選磷霉素轉(zhuǎn)化菌株，此轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定方法包括1)指示菌培養(yǎng)與懸液的配制按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，指示菌培養(yǎng)基成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來(lái)水，加熱溶解后，調(diào)pH 7.0-7.2，121℃濕熱滅菌20分鐘后，擺斜面?zhèn)溆?；指示菌培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24hr，菌苔呈半透明至白色；指示菌懸液的制備把滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環(huán)刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的生理鹽水中，測(cè)定吸光度為0.54-0.57；2)生物檢定培養(yǎng)基及其平板的制備按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，培養(yǎng)基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2.0％，余量為自來(lái)水，pH 7.0-7.2；按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，培養(yǎng)基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為自來(lái)水，pH 7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘；將融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤(pán)，制成下層平板；再將融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌懸液，混勻后倒入生物鑒定盤(pán)，制成上層平板；3)發(fā)酵產(chǎn)物生物鑒定將轉(zhuǎn)化發(fā)酵液4500rpm，20分鐘離心取上清，加10μl于滅好菌的濾紙片上，待1小時(shí)干燥后，放于生物鑒定盤(pán)上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，觀(guān)察并測(cè)量抑菌圈直徑，依據(jù)抑菌圈的有無(wú)和抑菌圈直徑的大小來(lái)篩選具有磷霉素生物轉(zhuǎn)化能力的菌株；利用薄層層析分析磷霉素，展開(kāi)劑為正丁醇∶乙酸∶水按體積比3∶1∶1，將展開(kāi)后的層析板風(fēng)干，置于生物鑒定平板上，待浸潤(rùn)后取下，37℃培養(yǎng)16hr，含有磷霉素部分產(chǎn)生抑菌圈；比較樣品與磷霉素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf，從而驗(yàn)證轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物轉(zhuǎn)化/生物催化技術(shù)、微生物菌株篩選領(lǐng)域，具體為一種以右旋磷霉素為底物的左旋磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選策略及方法。該篩選策略及具體操作方法在篩選過(guò)程中包括了菌株培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定兩個(gè)大步驟。該篩選策略及具體操作方法的要點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)室菌種的前期富集及采用生物檢定與薄層層析(TLC)方法相結(jié)合的產(chǎn)物檢定策略。由于自然界中能進(jìn)行右旋至左旋磷霉素的菌種不多，且實(shí)驗(yàn)室已有菌種生長(zhǎng)緩慢，前期菌種富集很重要。而且采用生物檢定與TLC方法相結(jié)合的產(chǎn)物檢定策略進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，可以準(zhǔn)確確定產(chǎn)物中是否含有左旋磷霉素。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1876830SQ20061004642
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日
發(fā)明者張雪姝, 徐慧, 張穎, 陳冠雄, 陳玉, 張海燕 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所